戊二醛蒸汽交联对胶原海绵的稳定作用

摘要

戊二醛是一种公认的交联和稳定胶原蛋白和其他蛋白质材料的试剂，包括明胶。然而，在某些情况下，溶液的使用会破坏材料的结构，例如，通过表面相互作用引起快速色散或扭曲。在一些个案中探索的另一种方法是使用戊二醛蒸气。在这项研究中，研究了在室温下5小时至48小时的培养时间内，在提供蒸汽的水库中不同浓度戊二醛的有效性，浓度从5%至25% (w/v)。这些数据表明戊二醛蒸气法交联胶原蛋白的有效性，并表明可以获得具有确定的中间稳定性的材料，例如，在体内控制再吸收速率。

1.介绍

戊二醛(GA)已被广泛用作胶原基生物医学材料的交联剂[1.]．这包括它在以组织为基础的设备上的应用，如心脏瓣膜置换[2.,3.]以及组织生物合成产品[4.]。此外，它还用于基于纯化胶原蛋白的产品，包括胶原蛋白糊剂[5.]及冷冻干燥的胶原蛋白海绵[6.].最近对重组胶原蛋白产品的稳定性进行了检测[7.]．

尽管其广泛应用于医疗产品中，但人们仍然担心其潜在的细胞毒性[8.–10]它是非特异性组织钙化的致病因子[11]．当然，生物来源的心脏瓣膜的非特异性钙化是一个重要问题，并导致功能丧失和需要修正[12]，虽然灾难性的失败不是一个正常的问题。已经研究了各种方法来减少这种钙化[13,14]．已经表明，从Ga的倾向形成反应性聚合物的细胞毒性和钙化产生，特别是在通常用于组织和胶原稳定的中性pH条件下。在酸性条件下，例如，在pH 3-pH 4周围，Ga主要作为单体发现，但将试剂取向中性pH导致聚合物形式的形成[15].交联将在pH值为4时发生，但交联速度较慢，且材料的热稳定性较低[16]．

其他方法已经研究了在中性pH稳定过程中最小化GA聚合物数量的方法。一种方法是在高温（例如，高达50°C）下用GA稳定胶原[17，低于典型的组织收缩温度。例如，通过核磁共振波谱对高温GA溶液的检测表明，游离醛含量增加[18]．

另一种方法是使用GA蒸汽，它已被用于制备基于胶原的生物医学材料[19–21.]。特别是，它已用于最初难以处理且不会损坏的样品，包括可能分散在溶剂中的细菌胶原蛋白海绵[7.]．然而，关于胶原蛋白的变性形式明胶，特别是电纺明胶材料的研究已经做了更多的研究[22.–24.，以及一些蛋白质复合材料，包括理论上的胶原蛋白或明胶[25.,26.]．在强溶剂中静电纺丝胶原蛋白也可能在无意中形成电纺明胶[27.]，尽管近年来已使用良性溶剂来静电纺丝胶原蛋白而不发生相关变性[28.,29.]．胶原蛋白或明胶的电纺膜经常脆弱，因此使用气相交联的使用具有明显的优于溶液方法。

先前的GA蒸汽稳定研究使用了多种条件，包括暴露时间、储层中的GA浓度和反应温度，但没有出现首选程序。在本研究中，我们检查了一系列条件，所有条件均在室温下，以更好地了解cro的程度和速率可能发生的错误。

2.材料和方法

2．1．胶原蛋白海绵的制备

使用成熟的方法从当地屠宰场获得的一岁生皮中纯化牛I型胶原蛋白[30.]对切碎的、未磨损的真皮进行胃蛋白酶溶解，使用1 100毫克/毫升胃蛋白酶（西格玛-奥德里奇） mM醋酸（默克）。如前所述，通过乙酸中的NaCl沉淀，然后在pH 7.2下分离不同胶原蛋白并纯化I型胶原蛋白[30.,31.]．纯化的牛型I胶原蛋白在50mM乙酸中的10mg / ml，用于制备冷冻干燥的胶原海绵，约3mm厚。用活组织检查冲头从海绵板切割戊二醛（GA）处理和分析的直径6mm的圆形样品。除非另有说明，否则所有其他化学物质都是最高等级的最高等级，并从Merck（维多利亚）获得。

2．2．戊二醛处理

对于GA蒸汽交联，GA以50%（w/v）储备溶液的形式获得（普罗西泰克，图林戈瓦，昆士兰州）。对于交联，GA>20 通过用水稀释储备GA溶液（从5%到25%（w/v））制成不同浓度的ml GA溶液，保存在70℃的玻璃干燥器下部 mm培养皿。切割的海绵盘放在这些溶液上方的玻璃培养皿中，以便随时接触蒸汽，并放置干燥器盖以密封室。在选定的时间取出样品，最多48次 h、 未经GA处理的对照样品以类似方式处理，但置于水上且未暴露于GA。用于差示扫描量热法（DSC）分析的样品用40 mM甘氨酸3 h，然后在毫开水中洗涤并风干。其他样品保持隔离，在清洁空气流中开放至少12小时 h在进行任何进一步分析之前。

2.3.差示扫描量热法

使用Mettler-Toledo DSC821仪器，通过DSC测定未经处理和GA蒸汽处理的胶原盘的热稳定性。胶原海绵盘的热稳定性介于0.8和0.9之间 分析前，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新水合。使用5°C/min的加热速率。数据从单独的样品测定中取平均值，每种条件下至少进行2次测定。每种试验条件下获得的值范围通常在1°C左右。

2.4. 扫描电子显微镜

样品在红外涂层（30）后进行检查 第60节 mA）使用Cressington 208HR溅射镀膜机，使用蔡司Merlin Gemini 2 FESEM仪器。

3.结果与讨论

GA是一种广泛使用的交联剂，用于胶原蛋白、明胶和许多其他蛋白质，通常在稀释浓度下使用，例如0.1到2.0% (w/v)，在水溶液中[1.]或在有机溶剂中使用频率较低[32.]．在某些情况下，样品的性质使其不适合在溶液中稳定。在这些情况下，使用GA蒸汽已被证明是一个合适的替代方案。

以前使用了广泛的隔离治疗条件(见表)1.)，其中使用了温度变化和蒸汽储层中GA浓度的变化。本研究比较了浓度和时间变化对胶原交联效果的影响。交联的有效性由胶原蛋白熔化温度的升高(变性温度)。该方法允许适度快速、重复性的测定，但加热速度高(5°C/min)可能导致值略有增加，特别是在较低的温度下，与使用较低的加热速度的方法相比可能会降低4°C左右。

本研究检测了水溶液中从5%（w/v）GA到25%（w/v）GA的浓度，培养时间长达48小时 h（图1.).使用的温度为室温，这是其他人最常使用的温度（表1）1.）.此前，一些研究使用了更高的温度[20.,22.]，其中交联速度预计会增加，部分原因是GA蒸汽压的增加。例如，在室温（20°C，32°C）和 ppm）和40°C（226 ppm）[42.]．

目前的数据表明，完全交联> 80℃，可以通过使用20％或25％（W / V）储层24小时或48小时来实现。这与先前的报告一致资料[20.,21.),在室温下，超过25%（w/v）GA的胶原海绵在24小时内温度>80°C h[21.]同样地在8小时后在37℃下报道> 80℃的胶原膜，在37℃下在37℃下进行8％（w / v）ga [20.]．提供了一个很好的定量测量交联，但并不总是报道。通常，材料的物理外观和稳定性是在不同的条件下引用的，例如在酸溶液中。对于明胶样品，a不能服用，因为明胶已经变性（来自胶原蛋白）。GA处理的明胶样品的交联效率可以通过检查材料对蛋白质水解的稳定性来估计。然而，不同研究中使用的条件往往不同，因此很难进行比较。

在较低的GA储层浓度下，即使在48小时的培养时间后，似乎也没有发生完全交联(见图)1.）.此外，对于较低浓度的交联程度，如值，似乎接近最大值取决于所使用的浓度(图1.）.样品培养超过5% (w/v) GA显示在孵育48 h后，这些值没有增加太多。超过10%和15% (w/v) GA解决方案的样品也可能接近70°C范围中的最大值(图)1.)，低于当GA浓度较高时，发现大于80°C的值。这些取决于储层中GA浓度的表观平台值有可能提供不同交联的样品系列，例如，用于再吸收率研究，类似于在溶液稳定中使用不同GA浓度获得的样品系列[43.]．

GA蒸汽交联对于任何多孔样品都具有优势，通过避免表面张力和反复冷冻干燥（溶液法发现），蒸汽的使用可导致胶原组织和拓扑结构的微小变化。SEM研究（图2.)，在对照组未处理材料中，海绵胶原结构几乎没有变化(图2（a）)和GA蒸汽广泛稳定(20% (w/v) GA, 24小时)(图2（b））.

在本研究中，我们检测了未添加添加剂的纯化胶原蛋白。GA气相稳定也可用于基于胶原蛋白和明胶的复合材料。例如，这包括胶原蛋白或明胶与其他蛋白质的混合物[25.,26.]，或含有其他成分，包括碳水化合物[44.),聚合物(45.]，以及矿物[46.]．

除了混合物外，胶原蛋白和明胶还可以在同轴纺丝过程中用作外部涂层[47.]．

以前的几项研究使用GA蒸汽交联胶原基材料进行细胞生长，这些研究一致表明，所产生的交联不会产生细胞毒性[7.,21.,33.–35.,37.]，即使在更长的时间点使用更高的GA浓度[7.,21.,33.,35.]这与GA作为单体的反应性是一致的，并且不允许在稳定材料中形成大量聚合物。其他研究表明，GA蒸汽交联可提高材料的机械性能[19,35.,36.]．

4.结论

本研究证明了GA交联在一系列条件下的有效性。已经表明，在室温下用20％或25％Ga蒸气处理，可以获得具有20％或25％Ga蒸气的胶原海绵的基本上交联。通过改变Ga浓度，可以获得中间的交联。这些观察结果以及通过GA浓度和时间变化的交联变化的理解应该是在设计基于这些蛋白质材料的胶原胶和凝胶化合物和复合材料的优选交联特性。GA蒸汽交联的使用对于不容易处理的多孔材料特别有用，提供稳定性。随后，可以使用额外的基于溶液的交联，以增加必要时稳定性，或者在保持稳定的结构的同时引入化学修饰。

信息披露

约翰姆拉姆肖目前的地址是墨尔本大学圣文森特医院外科病区，墨尔本，Vic 3065，澳大利亚。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Wendy Tian博士对DSC的建议和Mark Greaves对FESEM的帮助。

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