合成聚合物支架在乳腺癌中的应用3 d组织培养和动物肿瘤模型

文摘

多孔支架的制备三维(3 d)从合成聚合物是大多数实验室进行生物医学研究的一个挑战。在这里,我们提供一个方便的和具有成本效益的方法制备高分子水凝胶和多孔支架使用保利(lactic-co-glycolic)酸(PLGA)或聚已酸内酯(PCL)。乳腺癌细胞生长在三维聚合物支架表现出截然不同的生存形态,扩散比2 d聚合物表面。乳腺上皮细胞培养在PLGA -或者PCL-coated幻灯片表达细胞外基质(ECM)及其受体的蛋白质。雌激素受体(ER)积极T47D 4-hydroxytamoxifen乳腺癌细胞更敏感(4-HT)治疗时培养的三维多孔支架比2 d的文化。最后,癌症cell-laden聚合物支架支持一致的动物肿瘤形成和生物标志物的表达在人类肿瘤。我们的数据表明,合成聚合物多孔支架满足3 d组织培养的基本要求在体外和在活的有机体内。脚手架技术有吸引人的潜力应用于抗癌药物筛选更好的控制的人类癌症的恶化。

1。介绍

二维在体外细胞培养模型工具在解决各种问题和提供宝贵的知识领域的癌症细胞生物学几十年了。随着研究技术的进步,2 d细胞培养模型的缺点已经被识别,包括缺乏cell-ECM交互和细胞形态的差异,增殖率、生存能力、极性、能动性、分化、和对治疗的敏感性与细胞的特点在活的有机体内(1- - - - - -6]。这些限制的二维培养系统已经成为阻碍我们理解的进步发展的机制发生和发展的癌症和治疗方法来治疗人类癌症,强调需要更好的文化平台,能够密切模仿组织环境中原生癌细胞存活。

集成的空间概念,各种三维细胞培养系统已经形成了克服的局限性2 d的文化。有显著增加的使用3 d文化过去10年(7),导致许多不同的有趣的发现在2 d传统文化的影响。例如,细胞生长在3 d文化显示代谢特征的变化,如增加糖酵解(8),在基因表达模式,比如upregulation VEGF和检验基因参与血管生成(9- - - - - -11),在趋化因子的生产,如interleukin-8 [12),而在2 d表面细胞生长。比较值得注意的是全基因组基因表达分析的基因表达模式U87细胞生长在2 d和3 d文化与一群53儿科高级神经胶质瘤显示重要的3 d之间的相似之处,但不是2 d、文化样本和人类大脑肿瘤(13]。此外,一些研究显示药物抗性增加癌细胞生长在3 d系统相比,细胞2 d文化(14- - - - - -16),概括癌细胞对化疗的反应在活的有机体内。根据需要解决的科学问题和具体的实验设计,3 d支架应用于生物医学研究主要是使用天然材料制作,如原生组织蛋白质和藻类,或合成聚合物,如PLGA, PCL,聚(乙二醇)(挂钩)7,17,18]。合成聚合物支架的优点是他们丰富的可用性,成本低,适合大规模3 d生物打印和某些组织结构的重建,和灵活的定制来满足特定的物理需求不同的文化系统(19- - - - - -24]。

在这项研究中,我们侧重于描述应用合成聚合物支架的药效的制造使用PLGA和PCL改性气体发泡的方法对3 d组织文化和乳腺癌研究的动物模型。可行性、形态学、增殖和乳腺癌细胞的受体表达以及他们对抗癌药物在动物和发展成肿瘤的支持3 d支架。

2。材料和方法

2.1。聚合物涂层的幻灯片

显微玻片和70%乙醇清洗,晾干在生物安全柜,涂上2%的PCL (Sigma-Aldrich), PLGA (Sigma-Aldrich),或PCL和PLGA(1: 1的比例)溶解在氯仿(Sigma-Aldrich) 1小时,风干在生物安全柜,和冲洗两次1 x细胞播种前PBS。

2.2。三维多孔支架制备的聚合物

制造多孔支架具有类似孔隙大小脱细胞小鼠乳腺组织(~ 100米)(16),1.0克PLGA或0.5克PCL是溶解在1毫升氯仿其次是增加1克碳酸氢钠(NaHCO₃Sigma-Aldrich)的解决方案。解决方案被慢慢地分发到半球形的模具(直径4毫米)建于瓷板,这是保存在−80°C冷冻1 - 2小时和冻干−50°C 48小时如前所述[16]。0.1 N的支架被洗盐酸(HCl)解决方案6小时(每小时更换解决方案)在室温下生成后毛孔释放有限公司₂由NaHCO₃从支架和盐酸反应,其次是在蒸馏水洗涤数次,直到水变的pH值中性的。支架被浸泡在70%的乙醇3 - 5小时,洗了三次1 x PBS 10分钟,并保持在1 x PBS直到使用。PCL和PLGA支架相结合的生成是通过等体积混合(1:1的比例)的PCL和PLGA解决方案和遵循同样的程序如上所述。

2.3。在体外2 d和3 d的文化

MCF10A细胞(美国类型文化集合,写明ATCC)保持在1 x DMEM / F12 50/50 (Mediatech)补充1020 g / ml胰岛素,ng / ml EGF, 0.5g / ml氢化可的松,100 ng / ml霍乱毒素,Penicillin-Streptomycin马血清,5%和1%。mda - mb - 231细胞(写明ATCC)保持在1 x DMEM (Mediatech)补充Penicillin-Streptomycin的边后卫为10%和1%。种幻灯片(圆形,直径12毫米;ThermoFisher科学)或支架放置在24-well或96孔板,与无菌1 x PBS洗几次,与培养基预处理。MCF10A或mda - mb - 231细胞悬浮在各自的培养基被播种在幻灯片或支架(1×10⁵每张幻灯片或支架)和允许连接到45分钟的矩阵。细胞被培养在中在最优条件下(37°C, 5%有限公司₂在表示时间点),收集,分析,或用于下游实验。长时间的培养,培养基是每隔一天补充。

2.4。活和死细胞试验

种幻灯片或者聚合物支架上的细胞培养简要洗1 x PBS (37°C)两次,孵化生活/死细胞染色(2的解决方案M calcein-AM和4米1 x PBS的EhtD-III PromoKine)在室温下30分钟。使用荧光显微镜数字化图像捕获(蔡司Axio成像仪M2)。活细胞把calcein-AM染色和荧光绿色EGFP过滤器,而死细胞EthD-III染色和荧光红在德克萨斯红过滤器。

2.5。扩散分析

的扩散涂层幻灯片和支架上的细胞生长测定使用CCK-8试剂(Sigma-Aldrich)时间点。短暂,CCK-8的解决方案是添加1:10稀释到文化和孵化(37°C, 5%的股份有限公司₂),3个小时。文化的上层清液中收集和比色反应上层清液,以反映扩散状态测量使用协同2标(BioTek)吸光度在490海里。误差线代表标准差(SD)的三个独立实验的手段。

2.6。细胞表面受体表达

种幻灯片上的细胞培养在80%左右confluency洗了冷1 x PBS两次,固定在4%多聚甲醛。如前所述(执行免疫荧光染色25使用初级整合素-抗体)2(鼠标,圣克鲁斯生物技术、sc - 74466)和胶原蛋白1型(兔子,Abcam ab34710)设置1整合素6(兔子,英杰公司,710201年)和层粘连蛋白-3(鼠标,圣克鲁斯生物技术、sc - 33178)为组2和Alexa萤石®dye-conjugated anti-rabbit和anti-mouse(热费希尔科学)二级抗体检测整合素受体的表达在细胞表面的聚合物矩阵。

2.7。反应细胞的抗癌药物

T47D乳腺癌细胞(写明ATCC 1×10⁵细胞/支架)被播种的3 d支架和96 -孔板培养7天。(Z) 4-hydroxytamoxifen (4-HT、Abcam ab1419430)在最后1的浓度M管理在隔日从7日到第14天的文化。细胞生存实验使用现场/执行死化验如上所述。一式三份独立实验进行了统计学意义。

2.8。在活的有机体内肿瘤形成

mda - mb - 231细胞(1×10⁵细胞/支架)被播种在球形多孔PLGA支架(4毫米直径),在最优条件下培养(37°C, 5%有限公司₂)植入前24小时。空白(无细胞-控制)和cell-laden支架植入右和左腹股沟乳腺脂肪垫,4日分别8-week-old女性NOD-SCID老鼠(查尔斯河实验室)。有六个复制每个移植条件。肿瘤的生长监测使用光谱计算机断层扫描(CT)的在活的有机体内PerkinElmer成像系统(20)。肿瘤被收集到冰冷的4%多聚甲醛植入4周后,石蜡包埋,横截面,抗原检索(1毫米EDTA溶液,10毫米三基地,和0.05%渐变20;pH值9.0),沾HER2(兔子,细胞信号技术,2165)和ki - 67(鼠标,细胞信号技术,9449)主要抗体之后,Alexa fluorophore-conjugated二级抗体。使用荧光显微镜图像被抓获之前(25]。

2.9。统计分析

单向方差分析都使用了容易(构建6.0.0 /核心v5.9.92 AnalystSoft)软件分析统计数据。误差线代表平均数标准误差(SEM)三个独立的实验,除非另有指示。

3所示。结果与讨论

3.1。细胞生存、形态学和聚合物支架上的扩散

检查癌细胞的生存发展聚合物根基,人类三(ER、PR和HER2受体)阴性乳腺癌mda - mb - 231细胞培养在PLGA-coated显微玻片(2 d)和多孔PLGA支架(3 d),分别作为描述的方法,见图1(一)14天。第一天,一天14文化样本收集和沾住/死细胞分析工具包中描述的方法。这种染色方法绿色标签活细胞和死细胞在红色荧光显微镜下观察细胞。我们的研究结果表明,死亡人数在PLGA-coated发现细胞玻片(数字1(b) (i)1(b) (v))或在PLGA 3 d支架(数字1(b)和(iii)1(b) (v))是微不足道的第一天。然而,死亡细胞的数量检测到PLGA-coated玻片明显较高(数字1(二)和(b)1(b) (v))比在3 d PLGA多孔支架(数字1(b) (iv)1(b) (v))在14天。增加了细胞死亡的原因2 d文化可能是由于更快的mda - mb - 231细胞的增殖率相比,平面上的细胞在三维支架,与以前的观测一致,其它脚手架材料被用于三维细胞培养(16,26]。因为染色的性质和成像方法,一些细胞生长的三维支架似乎是由于增长的细胞在不同的焦平面/深度的三维支架(图1(b)和(iii)1(b) (iv))。

我们下一个检查癌细胞生长在聚合物之间的形态差异2 d表面和聚合物三维支架。结果表明,mda - mb - 231细胞生长的2 d PLGA在轴表面形状和表面密集地区或多或少地普遍的方式(图1(b) (ii)),而3 d PLGA支架上培养表现出圆的形状和扩大为细胞集群(图1(b) (iv))。这些数据与先前的研究一致显示独特的形态学特征的细胞种植在三维细胞支架相比礼服在2 d文化27- - - - - -29日]。两种文化之间的形态差异可能是两个因素的结果。一个是表面的不同物理特性的二维平面和三维多孔支架,前者是光滑的,甚至,后者是粗糙和不均匀,因为现有的毛孔表面的支架。另一个是空间之间的邻近的细胞和细胞之间的相互作用和根基,二维交互是“双向”横向和基底表面的细胞和3 d交互在大部分或全部被“多向”表面的细胞。多向交互特性的三维细胞培养像原生的封闭环境组织的特点,活细胞粘附和与周围的矩阵或/和其他细胞在各个方向。此外,即使癌细胞生长在2 d文化可以相互成长的细胞群达到confluency时,他们很难形成tumoroids通常可以实现3 d的文化。因此,癌症细胞的形态学特性在3 d微环境可能是一个基本因素癌症细胞生长、能动性、肿瘤发展,抵抗治疗药物。

癌症细胞增殖在适应生活环境对肿瘤的生长至关重要。评估的支持PLGA在细胞增殖在2 d和3 d文化,MCF10A和mda - mb - 231细胞生长PLGA-coated玻璃幻灯片和多孔PLGA支架为14天。细胞增殖率测量使用CCK-8试剂1天,第七天,一天14的文化。结果表明,MCF10A和mda - mb - 231细胞生长的PLGA-coated玻片培养时间(图迅速扩散1(c))。虽然类似的趋势在3 d文化中,细胞的增殖率大大低于2 d文化(数字1(c)和1(d))。此外,mda - mb - 231细胞的增殖率略高于MCF10A细胞2 d和3 d文化(数字1(c)和1(d))。类似的差异在2 d和3 d细胞增殖文化是我们以前的研究中观察到使用本机组织ECM支架材料(16和研究中使用其他材料22,30.]。然而,观察增殖率增加JIMT1乳腺癌细胞生长在基底膜基质相比,常规2 d文化(31日),表明细胞类型,或/和文化系统相关的表型,应该考虑不同的实验目的。总的来说,细胞系的增殖率显示在3 d文化模型相似的肿瘤模型在活的有机体内。

3.2。聚合物支架上细胞表面受体的表达

I型胶原蛋白是乳腺组织的主要组件之一ECM (16)和整合素21是一个主要受体I型胶原蛋白(32]。调查是否ECM的合成聚合物支持表达蛋白质和细胞表面受体,MCF-10A和mda - mb - 231细胞培养PLGA-coated幻灯片上24小时,与4%多聚甲醛固定,沾染了I型胶原抗体和整合素2如前所述[25]。免疫荧光(如果)显微镜检测到强烈的I型胶原蛋白和整合素染色信号2 MCF10A和mda - mb - 231细胞(数字2(b),2(c),2(f)2(g))。尽管mda - mb - 231细胞似乎是有点小于MCF10A细胞PLGA-coated幻灯片,总体I型胶原蛋白和整合素的表达α2在肿瘤细胞低于正常MCF10A细胞(数字2(b) -2(d)和2(f) -2(h))。这些数据符合低整合素的以前的报告2 (ITGA2)表达在初级乳腺癌相比,正常乳腺组织(33]。此外,基底整合素的表达水平α2β5月1日支持乳腺癌细胞迁移和肿瘤的生长34,35)由于高水平的整合素受体抑制癌细胞迁移(36]。我们观察到一个很好的colocalization整合素2受体I型胶原细胞尤其是边缘的细胞,暗示当地I型胶原蛋白沉积在幻灯片上表面和整合素的绑定2受体的沉积胶原蛋白吸附和迁移的细胞。同样的,我们研究了I型胶原蛋白和整合素的表达水平2 MCF10A和mda - mb - 231细胞生长在PCL - PLGA / PCL -(50/50)涂布幻灯片,结果是一致的与那些在PLGA基础(数据没有显示)。此外,我们没有注意到显著差异的形态、生存能力,和细胞增殖的细胞生长在PLGA, PCL,或3 d PLGA / PCL(50/50)表面(数据未显示)。这些数据表明,合成聚合物表面或支架可用于研究癌症生物学的某些方面。然而,必须考虑的选择不同类型的合成材料和制造方法为生物医学或生物工程3 d支架应用程序由于各自不同的优势和局限性的方法相比,一些生物材料模型系统(7]。

3.3。响应聚合物支架上的细胞生长的药物

传统上,抗癌功效的高活性化合物最初测试在2 d细胞培养系统中,和有前途的药物从这些研究进一步评估候选人在动物实验中在进入临床试验。然而,大多数药物有效的候选人2 d文化在动物实验或临床试验失败了。的一个主要原因归功于这些药物测试失败是二维培养系统无法模仿的天然组织微环境细胞生活在它们的行为就像在本地组织。有越来越多的证据支持3 d组织培养作为候选药物的药效更好的模型来测试(7]。

在这项研究中,我们审查的影响4-hydroxytamoxifen (4-HT)、雌激素受体(ER)的活性代谢物拮抗剂他莫昔芬,在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞腔的一种T47D细胞种植在3 d PLGA支架。细胞治疗1M 4-HT隔天开始每天7到13细胞播种后支架,和图片被天8和14个时间点。细胞的可行性进行了分析使用前面描述的一样生活和死细胞化验。与药物检测结果一致性在生物材料三维组织培养研究[16和动物模型37- - - - - -39],T47D细胞种植在3 d PLGA支架不太敏感,比PLGA-coated 4-HT幻灯片(数据未显示)。T47D细胞处理车辆溶剂只显示细胞增殖增加14天第七天相比,没有表现出显著差异在细胞生存能力在7天或14天在3 d细胞生长支架(数字3(一)-3(c)和3(h) -3(j))。然而,T47D细胞在支架上的扩散是4-HT治疗后明显下降,表现出的7天14(数字图像3(d) -3(g)和3(k) -3(n))。一个接近完整的细胞死亡在4-HT-treated 14天(数据样本3(k) -3(n))。这些数据都支持了这样的观点,即肿瘤细胞培养在3 d环境中开发药物抗性见本地肿瘤和表明,聚合物支架可以作为tissue-mimicry环境研究癌症细胞对治疗药物的反应。3 d的药物抗性注意到文化的异质种群可能是由于癌细胞和ECM的复杂生化的特性环境沉积的细胞内的3 d结构影响渗透率的多药耐药性的药物和超表达的蛋白质(40- - - - - -42]。

3.4。肿瘤形成的聚合物支架支持

评估的功能聚合物多孔支架支持老鼠体内的肿瘤形成,多孔PLGA支架被涂上一层mda - mb - 231细胞,培养24小时,植入NOD / SCID小鼠的乳腺脂肪垫。空白支架没有细胞作为消极的控制。肿瘤生长被一个监控在活的有机体内光谱CT成像系统(20),肿瘤大小和卡尺测量。收集肿瘤移植4周后,石蜡包埋,横截面为免疫组织化学(包含IHC)染色,如果显微镜分析。动物全身层析实验结束时候拍摄的图像表明,肿瘤肿块从癌症cell-laden支架开发,而不是空白支架对照组,观察期间(数字4(一)和4(f))。如果图像显示,通过植入后4周,支架被细胞占据了DAPI染色细胞核的细胞样品的横截面(数字4(b)和4(g))。正如预期的那样,增殖细胞核抗原生物标志物ki - 67无法探测发现空白支架植入和在高水平在肿瘤来源于mda - mb - 231 cell-laden PLGA支架(数字4(c)和4(h)),这表明快速扩散的癌症细胞群成立于本机内的支架植入乳房组织。另一方面,HER2受体,负面的mda - mb - 231细胞,发现在一些基质细胞在正常和肿瘤组织而不是癌细胞(数字4(d)和4(我))。我们没有发现显著差异在肿瘤大小比较PLGA支架组PCL或PLGA / PCL(50/50)并联支架组动物实验(数据没有显示)。这些数据支持的可行性应用多孔聚合物支架在动物肿瘤模型生成一致的肿瘤形成的优势在合理的时间内。

4所示。结论和讲话

三维细胞培养克服了许多癌症生物学研究中2 d文化模型的局限性。我们的数据有进一步深入了解合成聚合物支架可以成功地用于3 d组织培养和动物肿瘤模型。表型的肿瘤细胞中我们观察到3 d文化对于生存、形态、增殖,I型胶原蛋白及其受体表达和应对4-HT治疗非常鼓励额外的研究系统在癌症研究中的应用。例如,癌症细胞迁移和交互与其他类型的细胞三维孔隙内的支架可以研究。由于非生物高分子材料的特点,从模型中提取核酸和蛋白质三维文化进行进一步分析从生物分子来源于原生组织不受干扰。

自传统的肿瘤生成模型,注入癌细胞背侧皮下或乳腺脂肪垫的动物,在肿瘤的生长有很大的变化43- - - - - -45),我们的三维多孔scaffold-based动物肿瘤模型可以是非常有用的在不断生成实验肿瘤生物医学研究和临床前药物筛选。动物肿瘤产生使用此脚手架方法可以促进癌症生物标志物表达的观察,分子调节癌症恶化,药效和药物在肿瘤相似的大小和发展阶段。重要的是,这种简单、经济便宜的脚手架方法可以适应生物工程和其他相关领域。然而,尽管3 d的快速进步的发展文化模型,没有我为人人的3 d系统可以概括所有本地人类肿瘤的特点,和每个模型都有自己的优点和缺点。因此,重要的是要选择最适合的三维培养系统特定的研究目的。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

音译)和李Girdhari Rijal设计项目。Girdhari Rijal进行了实验。钱德拉Bathula Girdhari Rijal,音译)李写和编辑手稿。

确认

作者感谢同事在生物医学科学系的科学讨论。他们也非常感谢动物园工作人员的一致支持在斯波坎的华盛顿州立大学的校园。这个项目是由华盛顿州立大学创业基金支持李音译。

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