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国际期刊的生物材料
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国际期刊的生物材料/2016年/文章

研究文章|开放获取

体积 2016年 |文章的ID 9169371 | https://doi.org/10.1155/2016/9169371

小女孩出版薇费雷拉,罗杰·罗德里戈·费尔南德斯,阿曼达Freire阿西斯,Janaina a . Dernowsek Geraldo Passos,法比奥天花,卡琳娜Fittipaldi Bombonato-Prado, ”氧化钛表面Nanopatterning影响mRNA和MicroRNA表达在人类牙槽骨的成骨细胞的细胞”,国际期刊的生物材料, 卷。2016年, 文章的ID9169371, 15 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/9169371

氧化钛表面Nanopatterning影响mRNA和MicroRNA表达在人类牙槽骨的成骨细胞的细胞

小女孩出版薇费雷拉,1 罗杰·罗德里戈·费尔南德斯,1 阿曼达Freire阿西斯,2 Janaina a Dernowsek,2 Geraldo a Passos,1,2 法比奥天花,3 和 卡琳娜Fittipaldi Bombonato-Prado1

1细胞培养实验室、形态学、生理学及基本病理,牙科学院的小溪Preto,圣保罗大学14040 - 904年小溪Preto, SP,巴西

2遗传学、分子免疫遗传学集团部门小溪Preto医学院,圣保罗大学14049 - 900年小溪Preto, SP,巴西

3工学院,机械工程系,渥太华大学,渥太华,加拿大

学术编辑器:Esmaiel Jabbari
收到了 2015年11月26日
修改后的 2016年3月30
接受 05年4月2016年
发表 2016年4月21日

文摘

被广泛用于骨科和牙科植入钛的应用程序。众所周知,微-纳米生物材料的表面特性影响细胞活动,控制implant-host组织交互。改善我们的理解多尺度地表特征如何影响细胞行为,我们使用微阵列来评估转录概要文件从人类牙槽骨的成骨细胞的细胞培养工程钛表面,表现出以下地形:nanotexture (N),纳米+ submicrotexture (NS),和粗糙的显微组织(先生),通过调节实验参数(温度、溶液成分)的一个简单而有效的化学治疗H2所以4/小时2O2解决方案。生化分析表明,细胞培养增殖扩增10天后,和细胞生存能力逐渐增加14天。表面处理中,我们观察到的碱性磷酸酶活性增加表面纹理的函数,与更高的活动所示细胞坚持到nanotextured表面。然而,粗糙的显微组织组显示大量的钙比nanotextured组。微阵列数据显示716年的微分表达式mrna和32个小分子核糖核酸与骨相关功能。结果表明,氧化钛表面的nanopatterning诱导成骨细胞的细胞的新陈代谢和贡献的变化的解释机制,控制细胞反应微观——;表面。

1。介绍

在过去的三十年里,整形外科和口腔颌面外科使用钛金属材料的选择因其良好的生物相容性,主要与(1)弹性模量与骨,(2)优秀的耐腐蚀由于表面TiO2层,和(3)生物惰性在活的有机体内(1]。这些优点提高了钛的应用,从股茎假肢设备来取代牙科元素(2]。然而,特定生理等方面植入网站,血液供应,和周围的骨组织的质量和数量可以干扰骨整合过程,最终确定移植的成功率(3]。除了这些因素,金属物理化学性质(如地形、粗糙度、化学成分和润湿性)在不同的尺度也将有助于确定骨整合过程的结果影响的细胞和细胞外的事件发生在implant-host组织相互作用[4]。

能力与邻近组织和促进相互作用引起的生物反应通过指导特定的细胞过程沿预定的路线基本特征,下一代的生物材料应具备(5]。现在普遍认为在微观表面形貌的理性设计,纳米是一个强大的工具来控制和指导细胞反应(6]。表面的地形可以影响周围组织细胞反应通过修改细胞粘附和迁移,增殖和胶原合成的material-host组织接口(7]。同样,表面化学是另一个重要参数,在高骨并列中起着基础性作用[8]。

众多技术开发工程师钛表面的方式,促进骨细胞生长并最终植入固定。几项研究已经显示不同类型的钛表面处理如何影响这些过程,并着重指出微和nanopatterned表面施加一个微分影响骨形成和细胞行为从附近组织植入物表面获得(7]。在这种背景下,细胞培养是一个有用的工具,因为它们允许细胞如何调查和矩阵与钛表面(9]。目前,基因表达模式的研究正日益获得利益,旨在揭示基因的功能角色,使新方法在细胞疗法(10]。工具,如现在可以用来识别基因微阵列调制在细胞与生物材料接触,据Bombonato-Prado et al。11]。基因微阵列可以最终帮助识别不同监管在成骨细胞暴露于不同生物材料用于骨再生/替换程序。

目前的研究依赖于生化分析和基因表达来评估不同的人类牙槽骨细胞培养的细胞反应在不同的钛表面。我们的结果表明,纳米多孔钛表面生成的氧化nanopatterning影响牙槽骨细胞行为,从先前的研究特色,有调查mrna的表达差异及小分子核糖核酸的细胞接触不同的地形。

2。材料和方法

2.1。钛表面制备

工业纯的2级钛(Ti)光盘,13毫米直径和厚度2毫米,与Exakt 400 CS抛光机配备了320年,500年,800年、2500年和4000年粗燕麦粉(Exakt先进技术,德国)和感觉先后抛光磨料粒子的氧化铝粘贴(Al2O3)(0.05毫米)。马的光盘是用钛Extran®02(美国默克密理博)去离子水稀释2%,紧随其后的是酒精70%和去离子水30分钟。接下来,简单而高效的化学腐蚀基于硫酸的混合物(H2所以4在36个N)和过氧化氢( )是应用于不同的相对浓度酸和过氧化氢,在不同的温度下。这个过程提供三种不同类型的钛表面,所述的上一篇文章(5]。应用程序的一个完全可编程数字热板(EchoTherm™美国Torrey Pines科学HS40)自动反馈确保温度控制。获得nanotextured表面(N),钛光盘提交给腐蚀了50:50 H2所以4(36个N) / 30%过氧化氢溶液( )在25°C。实现纳米+ submicrotextured表面(NS),钛光盘处理50:50 H2所以4(36个N) / 30%过氧化氢溶液( )在50°C。治疗的钛光盘30%过氧化氢溶液( 在50°C)解决方案仅是用于获得粗略的显微组织(MR)表面。未经处理的钛光盘作为控制(C)。在实验之前,处理和未经处理的(控制)钛盘清洗和去离子的H2O,热压处理过的,风干。确认存在不同的表面粗糙,钛光盘是场发射扫描电子显微镜下检查(蔡司狮子座440年,英国剑桥大学)在15千伏。

2.2。细胞培养

人类肺泡骨头碎片从健康的成年捐赠者获得知情同意,使用研究协议经伦理委员会批准的研究大学牙科学院的圣保罗(批准号2011.1.1015.58.6)。成骨细胞的细胞在培养瓶,直到subconfluence然后播种/钛光盘24-well文化板块的浓度2×104细胞/。生长介质由alpha-minimum重要介质(αmem;Invitrogen-Life技术,大岛,纽约)补充10%胎牛血清(Gibco-Life技术)、庆大霉素(Gibco) 50毫克/毫升,和二性霉素b (Gibco)在0.3毫克/毫升,加入抗坏血酸(Gibco-Life技术)在5毫克/毫升,β甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)7毫米,和地塞米松(Sigma-Aldrich) 10−7m细胞培养是保持在37°C下湿大气含5%股份有限公司2和95%的空气。培养基是改变了三次一个星期。

2.3。细胞生存能力

细胞生存能力评估MTT试验(3 - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴)7,10,14天后开始的文化。为此,细胞被孵化与MTT(5毫克/毫升)10%的培养基在37°C为4个小时。从油井中然后吸气,1毫升的异丙醇(0.04 N盐酸异丙醇)被添加到每个。盘子放在瓶5分钟,200年μ这个解决方案的L被转移到一个96孔板。光密度在570海里(μ定量、BioTek仪器、Winooski VT,美国)。

2.4。碱性磷酸酶测定

碱性磷酸酶活性化验一磷酸从百里酚酞百里酚酞的释放;一个商业工具(Labtest Diagnostica、MG、巴西)是用于这一目的。一磷酸,50毫升的百里酚酞和0.5毫升的二乙醇胺缓冲(0.3μ摩尔/毫升,pH值10.1),以及由此产生的解决方案是保持在37°C, 2分钟。之后,50毫升的溶解产物被添加到每个井,这是保持在37°C, 10分钟。然后,包含Na 2毫升的一个解决方案2有限公司3(0.09μ摩尔/毫升)和氢氧化钠(0.25μ摩尔/毫升)添加颜色发展。30分钟后,吸光度测量在590海里。碱性磷酸酶活性与百里酚酞从标准曲线计算浓度从0.012到0.4不等μ摩尔的百里酚酞/ h /毫升。数据表示为总蛋白测定碱性磷酸酶活动规范化。

2.5。矿化基质形成

矿化基质形成检测在21天的茜素红S (Sigma-Aldrich)染色区域富含钙。连接细胞被固定在10%福尔马林在4°C 2 h后通过为每个增加一小时浸泡在酒精浓度(30%,50%,70%,100%)。下一步是与2%茜素红S染色,pH值4.2,10分钟。钙含量是评估一个比色方法以前描述(12]。所有生化数据被克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney测试相比。使用SPSS 17.0统计软件和差异 被认为是具有统计学意义。

2.6。总RNA提取

10天后,每种文化的总RNA提取总RNA mirVana隔离设备®(美国纽约Ambion),根据制造商的指示。紫外分光光度法证实RNA蛋白质和酚的准备工作是免费的。RNA降解评估了微流控电泳RNA安捷伦6000纳米芯片,进行一个安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。只有RNA样本的蛋白质和酚和以RNA完整数量(RIN)≥9.0。

2.7。微阵列杂交
2.7.1。信使rna表达人类Oligoarrays剖析与安捷伦4×44 K

基因表达变化进行评估与安捷伦一种颜色(Cy3荧光染料)基因表达芯片平台根据制造商的指示。短暂,500 ng个人的总RNA来合成双链cDNA和青蓝3 (Cy3) CTP标记互补放大RNA (cRNA)通过安捷伦线性放大工具(安捷伦),根据制造商的指示。人类通过使用安捷伦4×44 K寡核苷酸微阵列(安捷伦)cyanine-labeled互补的RNA杂化微阵列在SureHyb钱伯斯(安捷伦)旋转烤箱在65°C, 17 h。每个数组包含44000年寡核苷酸探针覆盖整个人类功能基因组。数组是根据制造商的指示和洗与安捷伦DNA微阵列扫描仪扫描。

2.7.2。microrna的表达分析与安捷伦8×15 K Oligoarrays老鼠

短暂,总RNA样本贴上Cy3使用安捷伦microrna的完整的标签和杂交工具包(安捷伦)。为此,100 ng的总RNA被孵化与小牛肠脱去磷酸磷酸酶在37°C为30分钟,变性在100% DMSO 8分钟100°C,和标签使用T4 perCp-Cy3连接酶2 h的16°C。每个标记RNA样本杂交个体数组在8×15 K安捷伦人类microrna的数组格式的幻灯片。每个数组包含探测器720人类microrna。杂交是SureHyb钱伯斯(安捷伦)55°C 20 h,和数组洗根据制造商的指示和扫描。

2.8。微阵列数据分析

oligo-mRNA和oligo-miRNA数组幻灯片与DNA芯片扫描仪扫描(安捷伦),使用安捷伦和杂交信号提取特征提取软件。微阵列数值定量数据归一化到第75个百分位并通过GeneSpring GX生物信息学分析平台(http://www.agilent.com/chem/genespring),根据默认的指令。信使rna分析中,我们使用方差分析统计检验( )改变≥2.0折起来,微rna分析,我们使用方差分析统计分析( )褶皱变化≥1.513]。一个完整的文件,提供了所有的mrna和microrna在这项研究中使用的数组,以及实验条件,网上公共数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/),加入数组表达e - mtab - 3091 (mRNA杂交)和e - mtab - 3093 (microRNA杂交)。

2.9。寡核苷酸引物设计和定量实时聚合酶链反应(存在)

信使rna和microRNA oligoarray数据经中存在五mRNA (SMURF2, NOTCH1, PHOSPHO1 COL24A1, FGF1)和六个小分子核糖核酸(miR-31-3p, mir - 134, mir - 136 - 3 - p, mir - 376 - c - 3 - p, mir - 424 - 5 - p,和mir - 494)。信使rna或小分子核糖核酸当选的基础上他们的表达模式和生物功能相关的模型系统进行了研究。Primer3 web工具(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi)是用于选择双寡核苷酸引物的最佳的熔化温度60°C。表1列表中使用的寡核苷酸引物中存在引物mrna和表2列出了加入数量和成熟为小分子核糖核酸序列。所有存在的实验进行了一式三份。单向方差分析与统计软件统计测试执行GraphPad Prism 5.0 (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm)。
信使rna的象征 底漆 序列
SMURF2 向前 5′-CATGTCTAACCCCGGAGGC-3′ 60°C
反向 5′-TCCATCAACCACCACCTTAGC-3′
NOTCH1 向前 5′-TACAAGTGCAACTGCCTGCT-3′ 60°C
反向 5′-ATAGTCCTCGGATTGCCTGC-3′
PHOSPHO1 向前 5′-ATACCTCAGCTAGCCCCCTT-3′ 60°C
反向 5′-TGTAGGGACTCTGTTGGCCT-3′
COL24A1 向前 5′-CCCCACGGCAAAAACGAAAT-3′ 60°C
反向 5′-GCCTCCAAGGCCTAGTTGAT-3′
FGF1 反向 5′-ACGGGCTTTTATACGGCTCA-3′ 60°C
向前 5′-ATGGTTCTCCTCCAGCCTTTC-3′
GAPDH 向前 5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′ 60°C
反向 5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′
表1
引物用于存在反应和各自的意义和反义序列。
微 ID-miRBASE 序列
hsa-miR-31-3p MIMAT0004504 UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU
hsa - mir - 134 MI0000474 CAGGGUGUGUGACUGGUUGACCAGAGGGGCAUGCACUGUGUUCACCCUGUGGGCCACCUAGUCACCAACCCUC
hsa - mir - 136 - 3 - p MIMAT0004606 CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU
hsa - mir - 376 - c - 3 - p MIMAT0000720 AACAUAGAGGAAAUUCCACGU
hsa - mir - 424 - 5 - p MIMAT0001341 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA
hsa - mir - 494 MI0003134 GAUACUCGAAGGAGAGGUUGUCCGUGUUGUCUUCUCUUUAUUUAUGAUGAAACAUACACGGGAAACCUCUUUUUUAGUAUC
表2
加入数字和成熟使用的小分子核糖核酸序列中存在的反应。

3所示。结果

3.1。扫描电子显微镜(SEM)

SEM表征了表面形态的钛光盘。抛光控制钛盘显示表面光滑。对钛盘给了地形表面轴承nanocavities沿着盘表面不同的分布。nano + submicrotextured表面组包含nanocavities的最大数量。除了表面粗糙度,表面粗糙的表面显微组织组和nanotextured组表面图像(图非常相似1)。

(一)”name=
(一)
(b)”name=
(b)
(c)”name=
(c)
(d)”name=
(d)
图1
扫描电子显微镜不同的钛表面:(a)控制表面,(b) nanotextured表面,(c)纳米+ submicrotextured表面,(d)粗糙表面显微组织。
3.2。细胞生存能力

细胞生存能力相似的组在各个时间点。例外是粗糙的表面显微组织集团表现出更高的生存能力在第七天开始后的文化( 与其他组相比(图2)。


图2
细胞生存能力的人类肺泡成骨细胞的细胞在7天,10,14日开始的文化抛光光盘和钛钛表面氧化nanopatterning蚀刻。Mann-Whitney测试 。
3.3。碱性磷酸酶活性

在所有的实验小组,酶碱性磷酸酶的活性,与矿化过程,在开始后第14天高(图文化3)。在治疗组,nanotextured表面组显示最高的碱性磷酸酶生产,这是统计学意义与纳米+ submicrotextured组相比在第14天开始后的文化( )。


图3
碱性磷酸酶(ALP)活性的人类肺泡成骨细胞的细胞后7,10,14天的文化开始抛光光盘和钛钛表面氧化nanopatterning蚀刻。Mann-Whitney测试 。
3.4。矿化结节

在茜素红S量化的基础上,对钛表面含有不同数量的钙沉积。粗糙的表面显微组织组的最大数量的钙与对照组相比,nanotextured表面集团( )(图4)。


图4
定量分析钙化结节茜素红S染色地区21天后开始的文化对抛光光盘钛和钛表面氧化nanopatterning蚀刻。Mann-Whitney测试 。
3.5。分析差异表达mrna

总共716个基因显示改变≥2.0折起来 (图5)。表3显示与骨相关的差异表达基因,细胞粘附,细胞凋亡,细胞生长和细胞分化。表4描述了这些基因的表达差异作为钛表面形貌的函数。
骨生成 细胞粘附 细胞凋亡 细胞生长和增殖 细胞分化
ATP6VOA4 AMICA1 AIPL1 E2F5 C10orf27
CDX1 SORBS1 LUC7L3 KIAA1109 SOX21
CYP27B1 NRXN1 ERBB3 LGI1 CYP24A1
SMURF2 PCDHA11 NOTCH1 CYP27B1 NANOG
NOTCH1 NRXN1 PSMD3 GRIN2A HSF4
PHOSPHO1 FGF1 BTK GPAM LAMC3
ERBB3 PTPRC KDR
PCDHB10 ABCB9 MMP7
EPB41L5 KDR PDE3A
UTRN MAPT CENPF
NOTCH1 GPAM FGF1
NCKAP1L RNF7 MECOM
COL24A1 CD28 PTPRK
表3
基因差异表达以下人群:控制、nanotexture,纳米+ submicrotexture和粗糙的显微组织文化的10天后,用相关函数根据基因本体数据库。
基因 C先生和 C和S C和N 与NS先生 与N先生 NS和N
足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部
ABCB9 2423年 1045年 1106年 −2319 −2191 1059年
AIPL1 1055年 −2369 1164年 −2500 1103年 2758年
AMICA1 2308年 1693年 2524年 −1364 1094年 1491年
ATP6V0A4 −5137 −1532 −3833 3353年 1340年 −2502
BTK −4130 −1516 −6530 2725年 −1581 −4308
C10orf27 −2049 −1277 −1827 1605年 1122年 −1431
CD28 −3104 −1478 −2068 2101年 1501年 −1400
CDX1 −2178 −1136 −1572 1918年 1386年 −1384
CENPF 2296年 1639年 1574年 −1401 −1459 −1041
COL24A1 2308年 1076年 −1584 −2144 −3655 −1705
CYP27B1 2325年 −1042 4278年 −2422 1840年 4457年
E2F5 2572年 1012年 3240年 −2542 1260年 3203年
EPB41L5 2725年 1796年 2440年 −1518 −1117 1359年
ERBB3 −2036 1391年 −1934 2832年 1052年 −2691
FGF1 1929年 1309年 2792年 −1473 1447年 2132年
GPAM 3438年 −1467 2420年 −5045 −1421 3551年
GRIN2A 2065年 −1066 2005年 −2202 −1030 2138年
HSF4 −2358 −2213 −1331 1066年 1772年 1663年
KDR 1563年 −1134 2118年 −1772 1355年 2401年
KIAA1109 1948年 1340年 2146年 −1453 1102年 1602年
LAMC3 2138年 2921年 2086年 1366年 −1025 −1400
LGI1 3533年 1452年 4124年 −2433 1167年 2839年
LUC7L3 2064年 1673年 1507年 −1234 −1370 −1110
MAPT 6567年 1653年 4711年 −3973 −1394 2849年
MECOM −2952 −3421 −8666 −1159 −2936 −2533
MMP7 2731年 1120年 2208年 −2438 −1237 1972年
NANOG 3365年 2137年 3791年 −1575 1127年 1774年
NCKAP1L −1722 −2257 −1736 −1311 −1008 1300年
NOTCH1 1306年 −1812 1416年 −2367 1084年 2565年
NRXN1 2462年 1377年 −1203 −1788 −2963 −1657
PCDHA11 2074年 −1266 2259年 −2626 1089年 2859年
PCDHB10 3328年 −1025 3581年 −3411 1076年 3669年
PDE3A −3260 1121年 −3908 3656年 −1199 −4382
PHOSPHO1 −2024 −1214 −1757 1667年 1152年 −1448
PSMD3 −2075 −2131 −1353 −1027 1533年 1574年
PTPRC 1453年 −1392 1475年 −2022 1016年 2054年
PTPRK −3909 −1952 1034年 2002年 4040年 2018年
RNF7 2803年 1199年 1387年 −2339 −2021 1157年
SMURF2 1193年 −2344 −1142 −2797 −1362 2053年
SORBS1 −3880 −3008 −3342 1290年 1161年 −1111
SOX21 2006年 1583年 2829年 −1267 1411年 1787年
UTRN −1602 −1884 −2062 −1176 −1287 −1094
表4
mrna的相对表达水平之间的差异表达控制(C), nanotexture (N),纳米+ submicrotexture (NS),和粗糙的显微组织(MR)组10天后的文化。舰队指挥官:褶皱的变化。

图5
层次聚类716个差异表达基因的人类肺泡成骨细胞的细胞在抛光和蚀刻钛表面(nanotextured、纳米+ submicrotextured和粗糙的显微组织)10天后开始的文化。红色:upregulation;以上;差别格林:对这些黑色:未调制的。
3.6。分析差异表达的小分子核糖核酸

结果显示,32个microrna显示改变≥1.5折起来 (图6)。表5提出了差异表达microrna与骨相关,细胞凋亡,细胞生长。表6总结了不同这些microrna的表达研究钛表面。
骨生成 细胞凋亡 细胞生长和增殖
hsa - mir - 424 - 5 - p hsa - mir - 494 hsa - mir - 134
hsa - mir - 136 - 3 - p hsa - mir - 134
hsa - mir - 136 - 5 - p
hsa-miR-31-3p
hsa - mir - 376 - c - 3 - p
hsa-miR-19b-3p
hsa-miR-21-3p
hsa-miR-21-5p
hsa - mir - 218 - 5 - p
hsa-miR-29b-3p
表5
小分子核糖核酸之间的差异表达控制、nanotexture纳米+ submicrotexture,文化的和粗糙的显微组织团体10天后,用相关函数根据基因本体数据库。
microrna的 C先生和 C和NS C和N 与NS先生 与N先生 NS和N
足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部 足球俱乐部
hsa - mir - 101 - 3 - p 2635年 1033年 1036年 −2551 −2542 1003年
hsa - mir - 106 b - 5 - p 1511年 −1018 1000年 −1539 −1510 1019年
hsa - mir - 1246 1173年 1963年 1133年 1674年 −1036 −1733
hsa - mir - 1290 1057年 2161年 1113年 2045年 1053年 −1941
hsa - mir - 134 −1478 −1119 1025年 1321年 1515年 1147年
hsa - mir - 136 - 3 - p 182144年 −1044 4031年 −190073 −45188 4206年
hsa - mir - 136 - 5 - p 67552年 1001年 −1132 −67496 −76442 −1133
hsa-miR-15a-5p 1633年 1009年 −1027 −1619 −1678 −1036
hsa - mir - 1826 - _v15.0 −1174 1173年 1299年 1377年 1525年 1107年
hsa - mir - 1914 - 3 - p −1401 −1001 1186年 1399年 1662年 1188年
hsa - mir - 193 - a - 3 - p 2493年 −1059 −1021 −2640 −2546 1037年
hsa-miR-19a-3p 2033年 −1060 −1069 −2154 −2173 −1009
hsa-miR-19b-3p 1544年 −1035 −1053 −1598 −1627 −1018
hsa-miR-21-3p 1402年 −1205 −1097 −1688 −1538 1098年
hsa-miR-21-5p 1782年 −1000 −1000 −1782 −1782 −1000
hsa - mir - 218 - 5 - p 1931年 1054年 −1005 −1832 −1940 −1059
hsa-miR-26b-5p 1635年 1036年 1024年 −1579 −1598 −1012
hsa-miR-27a-3p 1588年 −1000 −1000 −1588 −1588 −1000
hsa-miR-29b-3p 2128年 1083年 1014年 −1964 −2098 −1068
hsa - mir - 301 - a - 3 - p 1685年 −1041 1034年 −1754 −1630 1076年
hsa-miR-31-3p 1464年 −1092 −1120 −1599 −1640 −1026
hsa - mir - 374 a - 5 - p 1868年 −1083 −1093 −2023 −2041 −1009
hsa - mir - 376 - a - 3 - p 1411年 −1081 −1046 −1526 −1477 1033年
hsa - mir - 376 - b - 3 - p 2361年 −1105 1085年 −2608 −2176 1199年
hsa - mir - 376 - c - 3 - p 1424年 −1141 −1077 −1625 −1533 1060年
hsa - mir - 377 - 3 - p 1754年 −1019 1005年 −1788 −1745 1025年
hsa - mir - 424 - 5 - p 2125年 1051年 1043年 −2021 −2038 −1008
hsa - mir - 450 a - 5 - p 202710年 1121年 3964年 −180812 −51138 3536年
hsa - mir - 494 −1416 1006年 1120年 1424年 1585年 1113年
hur_5 −1357 1120年 1132年 1519年 1537年 1011年
miRNABrightCorner30 1657年 2170年 1197年 1309年 −1385 −1813
mr_1 −1519 −1000 −1000 1519年 1519年 −1000
表6
小分子核糖核酸的相对表达水平之间的差异表达控制(C), nanotexture (N),纳米+ submicrotexture (NS),和粗糙的显微组织(MR)组10天后的文化。舰队指挥官:褶皱的变化。

图6
层次聚类32差异表达人类肺泡成骨细胞的细胞的小分子核糖核酸抛光和蚀刻钛表面(nanotextured、纳米+ submicrotextured和粗糙的显微组织)10天后开始的文化。红色:upregulation;以上;差别格林:对这些黑色:未调制的。
3.7。信使rna所确认的数据实时定量PCR

存在确认5个差异表达mrna在实验小组;这些信使rna先前被oligomicroarray分析(表5)。确认的mrna与细胞凋亡(NOTCH1)相关联,骨组织和骨组织矿化(SMURF2、NOTCH1和PHOSPHO1),细胞粘附(COL24A1和FGF1),细胞增殖(FGF1) (http://geneontology.org/访问20/02/2014)(图7)。


图7
定量mrna的表达人类肺泡的成骨细胞的细胞在抛光和蚀刻钛表面(nanotextured、纳米+ submicrotextured和粗糙的显微组织)。由图基多重比较检验统计分析; , , 。
3.8。实时定量PCR微rna所确认的数据

实时定量PCR允许分析差异表达的六个microrna在实验组:miR-31-3p, mir - 134, mir - 136 - 3 - p, mir - 376 - c - 3 - p, mir - 494, mir - 424 - 5 - p(表6)。这些microrna与一些功能,如细胞凋亡(mir - 134和mir - 494),骨矿化(miR-31-3p, mir - 136 - 3 - p, mir - 376 - c - 3 - p,和mir - 424 - 5 - p),细胞生长和增殖(mir - 134) (http://geneontology.org/访问02/20/2014)(图8)。


图8
定量microrna的表达人类肺泡的成骨细胞的细胞在抛光和蚀刻钛表面(nanotextured、纳米+ submicrotextured和粗糙的显微组织)。由图基多重比较检验统计分析; , , 。

4所示。讨论

几项研究,旨在分析和比较不同细胞类型的反应接触钛表面改性通过许多方法(14]。在目前的研究中,观察到氧化钛nanopatterning产生微观和nanotextured表面,影响人类牙槽骨细胞的新陈代谢。它已被证明,15]nanotextured钛表面生成的化学方法促进成骨细胞增殖,这一个有前途的技术,在生物环境中细胞活动的监管。之前的调查显示,化学氧化 解决方案是一种有效的工具来实现各种物理和化学配置在钛表面,证明,通过改变蚀刻等参数解决方案组成,温度,和曝光时间,可以修改地形,氧化层厚度和润湿性商业纯钛(5]。在目前的研究中,通过使用这些参数,我们表明,氧化nanopatterning促进类似的反应为细胞生存能力组各时间点测试,除了粗糙的显微组织显示,生存能力要明显高于其他组后7天。除了生存之外,生化检测,如碱性磷酸酶活动是重要的将生物材料地形与细胞分化和骨整合8]。高山是第一批功能基因表达的钙化过程,所以它是可能的,他们的一个角色在矿化过程中发生在早期阶段(16]。然而,碱性磷酸酶的增加产量是观察14天之后所有实验群体的文化。在蚀刻表面,细胞培养nanotextured钛光盘显示最高的高山的活动,这是统计学意义相比NS组后14天。利用微阵列方法,我们发现716个差异表达基因的牙槽骨的成骨细胞的细胞接触不同的钛表面,其中大部分是与骨生成的过程(例如,矿化,粘附,细胞凋亡、增殖,并分化)。其中,观察到NOTCH1基因上调表达在纳米+ submicrotexture表面相比其他实验条件。等级是一个关键的目标在osteoclastogenesis成骨细胞的细胞,以及骨骼发育和骨重建(17]。切口是触发额外的途径在反应初期改性钛表面,因为它将参与骨生成的过程在活的有机体内骨形成和治疗18]。这些研究结果与我们的芯片结果一致,尽管存在验证方法显示类似的反应只有在增加C / C / N先生之间的表达式组。PHOSPHO1另一个差异表达基因,显示高表达在细胞附着到粗糙的显微组织。这个基因蛋白参与了羟磷灰石晶体的初始沉积在基质矿化的早期事件(19]。有趣的是,微阵列数据是在良好的协议与我们的生化结果,文化在接触粗糙的显微组织显示高钙沉积,尽管不存在类似的验证方法。SMURF2与SMADS和诱发ubiquitin-mediated退化,防止TGF -的信号β(转化生长因子)和BMP(骨形态形成蛋白)。两个TGF -β和BMP多功能蛋白质重要调节增殖,分化、迁移和凋亡[20.]。微阵列数据显示细胞内高表达SMURF2坚持到纳米+ submicrotexture表面相比其他蚀刻表面,而中存在高表达的细胞播种nanotextured钛。这些结果表明SMURF2因此低表达的细胞的表面可能会影响先生积极成骨细胞分化和Runx2稳定,促进cell-biomaterial交互,如图7和21天后在麻省理工和茜素红染色检测,分别。另一个基因重要的细胞粘附和细胞增殖是FGF1,起着至关重要的作用在成骨细胞的增殖和分化21]。FGF1表达在细胞培养芯片提高控制和NS表面,而存在显示高表达在细胞播种nanotextured光盘。我们的生化检测细胞增殖和生存能力并没有透露差异对细胞粘附和增殖。COL24A1基因被证明有一些控制成骨细胞分化和矿化,通过互动与整合素β3、转化生长因子β(TGF -β)/ SMADS信号通路(22]。发现COL24A1基因被激活的同时,骨钙素基因编码,和它的表达逐渐增加成骨细胞开始沉积矿化矩阵(23]。我们的微阵列分析显示增加表达细胞播种nanotexture钛盘相比其他蚀刻表面,在协议与其他调查(24]。

已经观察到,在几个microrna参与骨形成在早期和后期的成骨细胞分化调节通路在活的有机体内(25]。目前的研究发现32 microrna实验团体间的差异表达。特别是,这些microrna参与矿化,细胞凋亡,调节细胞生长和增殖。我们发现mir - 136 - 3 - p展品低表达在细胞的表面粗糙的显微组织相比,N和先生在芯片表面,存在数据。文献表明,mir - 136在成骨细胞分化[差别促进对这些26),这表明在目前工作这微细胞外基质的沉积中受益,见我们的生化结果。另一方面,mir - 134的高表达组先生揭示了微阵列数据可能导致减少细胞粘附,某些小分子核糖核酸促进监管蛋白跨膜细胞粘附受体和重视团结的细胞细胞外基质,以及参与细胞之间的相互作用(26]。Poitz et al。27)表明,mir - 134提升β1整合素-监管,导致减少粘附纤连蛋白的间充质干细胞(msc)。尽管如此,我们的MTT测定不显示任何减少先生表面上种子细胞的可行性。微阵列和存在方法还显示mir - 494的表达增加nanotexture相比,粗糙的显微组织。这个微rna介导细胞凋亡和坏死在不同的细胞类型28),但并没有观察到这种效应在目前的工作,与所有细胞的可行性蚀刻表面显示相似或高于控制细胞。我们观察到miR-31参与转录因子的调控osterix人类骨髓细胞(msc)分化成成骨细胞(29日]。Osterix骨细胞分化调控的重要元素,在骨体内平衡中扮演着重要的角色30.]。邓et al。31日]还发现过度miR-31显著降低成骨的转录因子的表达像OPN, BSP, OCN, OSX,但不是Runx2。我们的微阵列数据分析以及存在显示miR-31-3p增加其表达在细胞播种nanotexturized表面和减少在奥钛光盘。同样,细胞表面粗糙的显微组织显示低表达mir - 424 - 5 - p相比其他表面蚀刻表面而nanotextured显示更高的表达,证实了微阵列和存在。mir - 424也有监管角色人类骨髓细胞的分化成成骨细胞(32),这些结果可能是导致增强的细胞分化在第一组的高山活动后14天。影响骨代谢,其他microrna差异表达在我们的研究中,如miR-19b miR-21, mir - 218和miR-29b。

中存在的方法有助于验证微阵列数据。在这项研究中,我们验证了微阵列方法进行五个基因的存在和六个小分子核糖核酸当选的基础上与骨生成的表达式模式和他们的协会。然而,存在没有证实所有的微阵列分析获得的结果,也显示了其他的研究[33,34]。根据文献,通过两种方法获得的数据之间的差异可能会出现因为微阵列杂交协议可能避免的细微差别基因表达的检测,可检测到存在技术(35]。另一个理由是,这些差异可能会由于增加分离PCR引物的位置和微阵列探针(36]。此外,微阵列和存在协议执行标准化,不同的软件(即。全球基因表达和内生控制职责。)37]。

出现在这个调查结果显示,其他几个mrna和microrna可以调制由于表面改性,和更多的研究应该写给阐明他们的角色在成骨细胞的新陈代谢。总之,它已经表明,氧化钛表面nanopatterning影响牙槽骨的成骨细胞的细胞代谢和调节基因编码蛋白质的表达,对骨很重要。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢圣保罗研究基金会(FAPESP)必须占州政府的财政支持(流程2011/00702-0和2011/21982-0)。

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