银纳米粒子:使用写明ATCC参考菌株的生物合成铜绿假单胞菌广谱抗菌药物临床和活动

文摘

目前,生物基纳米材料吸引了巨大的关注由于记录这些人的抗菌性。这项研究报告的胞外生物合成银纳米粒子(Ag-NPs)使用铜绿假单胞菌从一个参考文化集合。上层清液的绿色文化铜绿假单胞菌孵化在37°C与硝酸银溶液中24小时更改为黄棕色,表明Ag-NPs的形成,证实了紫外可见光谱、透射电子显微镜、x射线衍射。TEM分析表明球形和伪球形纳米粒子与分布式大小主要是25至45纳米,和XRD模式揭示了水晶Ag-NPs的性质。也提供了一个评估的抗菌活性biosynthesized Ag-NPs对人类致病微生物和机会,也就是说,金黄色葡萄球菌,葡萄球菌epidermidis,粪肠球菌,变形杆菌,鲍曼不动杆菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,克雷伯氏菌肺炎。Ag-NPs被发现在picomolar生物活性浓度水平显示杀菌效果对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株。这项工作表明第一个帮助使用biosynthesized Ag-NPs广谱杀菌制剂临床菌株的致病性细菌耐多药耐甲氧西林等金黄色葡萄球菌,答:baumannii,大肠杆菌。此外,这些Ag-NPs显示,微不足道的细胞毒性效应在人类中性粒细胞暗示低毒性的主机。

1。介绍

持续出现抗生素耐药性的致病性和投机取巧的微生物要求科学界不断开发新的药物和药物靶点。罹患卫生保健相关感染病明显高的成本和增加是由多重耐药微生物引起的感染数量增加(1]。超过70%的医院内细菌感染对抗生素的一个或多个传统上用于治疗他们,和人感染耐药微生物通常花更多的时间在医院,需要使用两个或三个不同的抗生素治疗有效,毒性更强,更昂贵的(2]。

尽管许多科学家正在设计药物作用的目标通过小说的作用机理,介绍了一些新的抗生素制药工业在过去的十年中,并没有改善活动对耐多药细菌(3]。在当前的场景中,纳米技术提供了机会再探索已知抗菌材料的生物学性质通过操纵它们的大小来改变效应(4]。

最近,纳米粒子在各领域的应用大大扩展。纳米粒子具有独特的物理化学特性,如高表面积比质量,高反应活性,和大小在纳米的范围(10⁻⁹米)。纳米粒子已被成功地用于纳米化学方面的提高催化剂的固定和活动,在传感器,在医学和制药交付治疗纳米工程代理商,和在食品工业中限制细菌生长5- - - - - -8]。由于纳米粒子也证明抗菌活动,小说在这一领域应用的发展使他们成为一个有吸引力的替代抗生素。

近年来,已经有越来越多的银纳米粒子的合成和研究的兴趣(Ag-NPs),因为银一直以其抗菌作用和Ag-NPs视为无毒、环保抗菌材料,可能与广谱活性和低得多倾向相比,抗生素诱导微生物耐药性(8,9]。目前,许多方法已经报道的合成Ag-NPs通过化学、物理和生物的路线(10]。后者已成为一个绿色的替代和它非常有利,因为它是环保的,符合成本效益,容易扩大。Ag-NPs有很大潜力的生物合成与自然减少代理和/或稳定化合物从细菌、真菌、酵母、藻类、或植物(10,11]。

在这项工作中,我们提供一个简单的和环保的绿色合成策略Ag-NPs使用的金属还原文化上层清液铜绿假单胞菌写明ATCC 27853。紫外可见光谱和透射电子显微镜是用来描述Ag-NPs biosynthesized。虽然类似的策略已经被Kumar和Mamidyala[以前12),这项工作提供了第一手细胞外Ag-NPs使用的生物合成铜绿假单胞菌从一个参考文化集合。我们也评估了在体外抗菌功效Ag-NPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,如代表金黄色葡萄球菌,葡萄球菌epidermidis,粪肠球菌,变形杆菌,鲍曼不动杆菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,和肺炎克雷伯菌。我们所知,这是第一个工作报告的帮助使用biosynthesized Ag-NPs杀菌制剂临床菌株的抗多种抗菌素的人类的病原微生物,即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,答:baumannii,大肠杆菌。此外,我们提交细胞生存能力分析的初步结果biosynthesized Ag-NPs-treated人类中性粒细胞。

2。材料和方法

2.1。试剂

大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)和穆勒辛顿汤(MHB)获得BritaniaLab并准备根据制造商的建议。硝酸银(纯度> 99%)从Cicarelli购买,阿根廷和就业准备新鲜的银解决方案(10毫米)无菌蒸馏水为每个实验。右旋糖酐的明串珠菌属mesenteroides(78000年平均分子量),Ficoll-Hypaque (histopaque - 1077),从σ和台盼蓝的解决方案了。汉克的平衡盐溶液(hbs)制备无菌蒸馏水。

2.2。生物合成的Ag-NPs

TSB介质制备、消毒和接种新的增长铜绿假单胞菌写明ATCC 27853年被孵化24小时37°C。孵化期后,文化是离心机在10000 rpm和文化上层清液用于Ag-NPs的合成。不同浓度的铜绿假单胞菌文化上层清液(10、30和体积的50%)分别添加到反应容器含有不同浓度硝酸银(1、5、10毫米)。

2.3。表征Ag-NPs

的bioreduction Ag)⁺离子被定期监控抽样整除(2毫升)的反应混合物的紫外可见光谱和测量混合物。这些样品的紫外可见光谱能整除的记录从200年到800 nm日本岛津公司在室温下紫外可见分光光度计。的胶体稳定性Ag-NPs被电动电势测量使用Delsa评估™纳米C仪器(贝克曼库尔特)。此外,biosynthesized纳米粒子使用透射电子显微镜(TEM)等进行了表征。Ag-NPs形态分析进行了使用TEM图像获得JEM-JEOL 1120 EXII模型显微镜操作在80千伏。样本准备通过添加一滴反应混合物在多洞的碳涂层铜TEM网格和允许它在空气中干燥。Ag-NPs的晶体结构和化学成分是由x射线衍射(XRD)分析使用x射线衍射仪(PANalytical X-Pert Pro)与铜K-alpha辐射在40 kV和40马2θ30 - 70°。

2.4。菌株

的抗菌活性biosynthesized Ag-NPs检查在几个具有代表性的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株。以下革兰氏阳性微生物进行评估:金黄色葡萄球菌写明ATCC 29213年methicillin-sensitive金黄色葡萄球菌(MSSA)临床菌株1、MSSA临床菌株2,MSSA临床菌株3,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)美国epidermidis写明ATCC 12228,粪大肠写明ATCC 29212。在革兰氏阴性微生物进行了测试p .奇异君子兰临床菌株,答:baumannii临床菌株,大肠杆菌写明ATCC 25922,大肠杆菌临床菌株1,大肠杆菌临床菌株2,铜绿假单胞菌写明ATCC 27853,k .肺炎写明ATCC 700603。所有菌株都生长在MHB耗氧24小时在37°C。

2.5。确定的最低抑制浓度和最低杀菌浓度Ag-NPs Time-Death化验

标准管稀释法对MHB被用来评估Ag-NPs的抗菌功效。压力来自文化的24小时MHB介质稀释10⁶CFU /毫升和孵化10分钟37°C。Ag-NPs添加到细菌悬浮液浓度的范围从0.025到51.2点。观察细菌生长在18 h(孵化后,适应症的临床和实验室标准协会(CLSI)。Ag-NPs,抑制细菌生长的最低浓度被认为是最低抑制浓度(MIC)。最低杀菌浓度(MBC)测量的最低浓度,降低初始培养液到99.9%。Time-death进行了分析金黄色葡萄球菌和大肠杆菌参考菌株的0.6点Ag-NPs biosynthesized。两个菌株的起始剂10⁷CFU /毫升2毫升MHB孵化了2.5 h在37°C,不断搅拌,然后他们与纳米颗粒上升。在不同的时间,一个整除细菌悬液的收集,在磷酸盐缓冲溶液稀释,穆勒辛顿琼脂板上镀Ag-NPs的缺失。殖民地被数24小时后在37°C。

2.6。中性粒细胞准备从人类血液和细胞的可行性分析

人类中性粒细胞分离结合右旋糖酐/ Ficoll-Hypaque沉降过程。沉积在葡聚糖6%梯度离心之前进行。Ficoll-Hypaque的混合物被用来分离单核细胞从剩下的血液的细胞。沉降后,低渗的溶解的红细胞。嗜中性粒细胞层洗两次,悬浮在哈佛商学院。细胞准备调整~ 10⁶细胞分析/毫升。

台盼蓝排斥试验被用来确定可行的细胞的数量在一个细胞悬液接触Ag-NPs 40点。在该测试中,细胞悬液只是与0.02%台盼蓝混合然后检查来确定细胞或排除染料。在这里给出的协议,一个可行的细胞将有一个明确的细胞质而不能存活的细胞将显示蓝色的细胞质。值的可行性治疗细胞被表示为相应的比例,从控制细胞。

2.7。道德声明

健康志愿者参与这项研究的人献血之前,所有参与者签署书面知情同意参与。本研究通过化学学校制度审查委员会和符合阿根廷(ANMAT 5330/97)和国际(赫尔辛基宣言)原则和生命伦理规范。

3所示。结果与讨论

添加不同浓度的铜绿假单胞菌文化上层清液(10、30和体积的50%)水AgNO₃溶液在不同浓度(1、5、10毫米)导致Ag-NPs的生物合成。然而,最好的妥协产生更高的Ag-NPs较低的多分散性与10毫米AgNO达成₃解决方案和铜绿假单胞菌文化上层清液浓度为30%。数据1(一)和1 (b)显示的视觉变化的颜色从绿色到淡黄色棕色文化的上层的孵化与Ag) 37°C⁺离子反应的24 h后,而没有颜色变化可以观察到在文化没有AgNO上层清液₃。的bioreduction Ag)⁺离子证实了紫外可见光谱如图2。紫外可见光谱中,strong-broad吸收带中心约420海里,分配给一个表面等离子体(13),的Ag-NPs biosynthesized使用铜绿假单胞菌文化上层清液,吸收峰为中心在300纳米左右是由于银离子。Ag-NPs电动电势的本研究发现−36.0 mV说明纳米颗粒间的斥力作用将负责静电稳定。这证明证明Ag-NPs分散在介质。形态和大小分布的Ag-NPs获得被透射电子显微镜(TEM)研究了。代表TEM图像和粒度直方图biosynthesized纳米颗粒的细胞外基质铜绿假单胞菌如数据所示3(一个)和3 (b),分别。可以看出,纳米粒子是球形,直径约球和相对统一的25到45纳米。一个可能的机制可以解释Ag-NPs的生物合成是考虑到NADH-dependent硝酸还原酶,酶分泌的铜绿假单胞菌,负责减少Ag)吗⁺对Ag)⁰以及随后Ag-NPs形成。bioreduction可能发生通过电子从NADH NADH-dependent还原酶可以作为载体(9,11]。x射线衍射图样的biosynthesized Ag-NPs图所示4。三个峰值为38.1°,44.2°,和64.5°对应(111),(200)和(220)银层被证实使用标准粉末衍射数据的JCPDS号码04 - 0783。所有峰对应于一个面心立方(fcc)对称。除了这些代表山峰fcc银纳米晶体,其他山峰可以观察到在图4表明有机相的结晶表面的纳米粒子和Ag-NPs稳定(14]。

连续选择有抵抗力的细菌对多种抗生素导致的复苏的研究小说的非常规能源的抗生素。因此,抗菌性的biosynthesized Ag-NPs对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌病原体代表探索在这项工作。我们挑战的临床和参考菌株金黄色葡萄球菌,美国epidermidis,粪大肠,p .奇异君子兰,答:baumannii,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,k .肺炎用不同浓度的Ag-NPs(从0.1到51.2 pM)使用传统的管macrodilution方法确定麦克风和MBC Ag-NPs(见表1)。

它可以观察到在桌子上1,biosynthesized Ag-NPs有效对抗所有的细菌物种研究和引人注目的麦克风在picomolar水平估计在0.4和6.4之间点。与传统的临床抗生素,如环丙沙星、Ag-NPs获得显示更高的增长对所有的测试细菌种类和抑制作用显著降低水平的浓度(μM和点对环丙沙星和Ag-NPs职责)。这些结果表明,Ag-NPs作为潜在的抗菌药物,建议自然广谱的抗菌活性。麦克风观察值铜绿假单胞菌和美国epidermidis高于其他菌株,这可以解释为他们形成生物膜的能力(15),然后减少Ag-NPs-mediated抗菌作用。考虑到MBC /麦克风比率来衡量抗菌剂的杀菌能力(杀菌代理:MBC /麦克风≤2;抑菌剂:MBC /麦克风> 2),结果列在表中1允许指出Ag-NPs杀菌活性的菌种进行测试。此外,杀菌动力学Ag-NPs biosynthesized从time-death曲线分析了实验使用金黄色葡萄球菌写明ATCC 29213和大肠杆菌写明ATCC 25922,分别作为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的模型。获得的结果显示减少3日志₁₀4 h后的孵化Ag-NPs浓度(参见图0.6点5)。Ag-NPs强大的杀菌药物与临床的致病菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,答:baumannii,大肠杆菌,这被认为是一些最致命的微生物耐多药的人口(16]。这明显是一个有前途的结果因为使用biosynthesized Ag-NPs可能克服细菌耐药性的方法之一,发挥先进药物治疗学的重要作用。

Ag-NPs-mediated杀菌效果的机制还有待了解。一些研究建议Ag-NPs附着在细胞壁影响其膜完整性,从而干扰细胞的渗透性和呼吸功能(9]。同样,Ag-NPs抗菌活性的大小依赖和小Ag-NPs有可用的表面积大比大的互动更有效的抗菌药物。然后,Ag-NPs不仅可能与细胞膜相互作用,但也可以穿透细菌内(8]。另一个可能的机制参与Ag-NPs的抗菌活性是Ag)的释放⁺离子杀菌作用的发挥部分但重要的作用[9]。

细胞生存能力以应对Ag-NPs估计通过台盼蓝排斥试验细胞接触Ag-NPs浓度远高于麦克风/ MBC确定。30分钟和3 h孵化后,细胞生存能力大于80%和50%,分别。这些初步结果表明biosynthesized Ag-NPs有微不足道的细胞毒性效应在人类中性粒细胞即使3 h(暴露于纳米颗粒,表明低毒性的主机。因此,获得的非常规抗菌剂可用于病人没有副作用,是另一种控制传染病引起的不同的病原菌。

4所示。结论

我们报道一个简单的生物合成和绿色化学方法Ag-NPs使用文化的上层清液铜绿假单胞菌参考应变在37°C和减少代理没有任何有害的。纳米粒子的特征通过紫外可见光谱和透射电子显微镜。TEM分析证实Ag-NPs及其大致的相对均匀分布的球形形状。的抗菌活性biosynthesized Ag-NPs是评估和发现这picomolar浓度水平的纳米材料具有杀菌活性对代表人类革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌包括临床分离耐多药耐甲氧西林等细菌金黄色葡萄球菌,答:baumannii,大肠杆菌。这是值得注意的,因为Ag-NPs已被证明是有效的抗菌药物无论存在于人类的病原微生物的耐药性机制和可能是一个潜在的候选人是有效的广谱杀菌代理和无毒的主机。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

梅丽莎·波佐·奎因特罗斯就是受害者和伊凡娜m . Aiassa马丁内斯的贡献同样这项工作。

确认

作者希望承认金融支持CONICET (PIP 11220130100702公司,PIO 14520140100013公司)和ANPCyT-FONCyT (2014 N°1663皮克特人)从阿根廷和SECyT-UNC科尔多瓦,阿根廷。梅丽莎·波佐·奎因特罗斯就是受害者和伊凡娜m . Aiassa马丁内斯谢谢CONICET的博士生和博士后奖学金,分别。作者还要感谢胡安·卡洛斯Fraire协助TEM实验。

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