小说Vanadium-Loaded有序胶原蛋白支架促进骨软骨分化的骨髓祖细胞

文摘

可以改善骨骼和软骨再生设计功能化生物材料,包括生物活性药物在生物相容性和生物可降解支架。基于我们之前的研究,我们设计了一个vanadium-loaded胶原蛋白对骨软骨组织工程支架。Collagen-vanadium加载支架通过扫描电镜,红外光谱,渗透率的研究。鼠骨髓祖细胞被镀在胶原膜或vanadium-loaded评估细胞的差异依恋,增长和成骨的或chondrocytic分化。潜在的细胞毒性支架MTT试验评估和评价培养生264.7巨噬细胞形态学变化。我们的结果表明,加载VOAsc没有改变槽有序结构的胶原膜虽然膜透性增加,表明一个更加开放的结构。VOAsc向媒体公布,建议diffusion-controlled药物释放。Vanadium-loaded膜被证明是一个更好的基础所有的评估方面BMPC生物相容性(粘附、生长和分化成骨细胞和chondrocytic)。此外,没有检测到胶原蛋白或vanadium-loaded支架对巨噬细胞生存的影响或细胞毒性。基于这些结果,我们已经开发出一种新的有序胶原支架装载VOAsc显示骨软骨组织工程的潜力。

1。介绍

骨软骨损伤是一种常见的创伤和关节和骨骼退行性改变的结果(1]。作为关节软骨是一种无血管的组织分化的细胞是嵌入在一个有机矩阵,它有一个非常有限的自然愈合的潜力(2,3]。不同的组织工程学策略被用来改善骨软骨损伤的再生能力。特别是,微裂缝过程结合支架植入有或没有的间充质干细胞和/或生长因子显示有前景的结果(4- - - - - -7]。骨软骨缺损填充矩阵与一个适当的替代(例如,with functional characteristics similar to those of the original tissue) can decrease reparation time and thus patient morbidity [7- - - - - -9]。间充质干细胞的使用是特别感兴趣,因为在特定的因素呈现分化为成骨细胞的能力或内层,因为他们可以获得相同的病人(10]。尽管这些令人鼓舞的方面,一个重要的患者数量提交这些程序显示病变的恶化,突显出完善的设计足够的生物材料的重要性。

包含不同的生物活性分子的骨头和/或软骨再生也被报道,导致支架的设计,可以作为一个控制输送系统(11,12]。这个可以改善的有属性矩阵,甚至减少一定的细胞毒性药物,从而降低组织修复所需的时间。此外,设计一个官能团或者“智能”生物材料可以优化降解率和dosification的生物活性分子。

虽然开发了许多材料修复骨软骨缺损,没有与胶原蛋白的性质(13]。这种天然聚合物被广泛使用,因为其固有的生物相容性,生物降解能力,osteoconductivity和具有成本效益的可用性(14]。最近,我们已经准备好和微尺度有序胶原蛋白支架和显示它的效力为骨组织工程(15]。我们的研究结果表明,胶原纤维的取向积极调节成骨细胞的生长和发育。相比,面向随机的胶原蛋白支架,有序胶原基质增强体外成骨分化的MC3T3E1 preosteoblasts增加成骨细胞分化和细胞外基质矿化的标志16]。

此外,我们以前报道的成骨的属性vanadyl (IV)抗坏血酸盐(VOAsc)复杂以及其可能的作用机制,在两个成骨细胞的细胞系在文化17]。VOAsc显著刺激成骨细胞的增殖和I型胶原蛋白的生产和增加矿化结节的形成。我们证明了这个复杂的抑制磷酸酶,同时激活ERK通路调节细胞内钙含量和pi3激酶通路。完全我们的观察表明,钒(IV)抗坏血酸盐复杂可能是一个有用的药理骨组织再生的工具。另一方面,我们评估使用聚钒的交付系统(β丙内酯)电影18]。在此系统中,钒解放速度控制导致选择性对骨肉瘤细胞的抗增殖效果比药物细胞毒性较低的解决方案。

基于我们之前的数据,在目前的工作,我们设计了一个有序胶原蛋白支架含有不同数量的VOAsc并评估其潜在的骨头和软骨的再生。我们已经确定几个物理化学和生物相容性胶原支架的属性。特别是,我们调查的影响VOAsc加载到膜上的生长鼠骨髓祖细胞(BMPC)和他们的表型分化为成骨细胞和内层。我们也评估可能的支架的体外细胞毒性。

2。材料和方法

2.1。膜制备和表征

膜是准备使用酸溶性胶原蛋白提取牛跟腱。命令电影是按照标准化程序获得我们的实验室15]。Vanadyl (IV)抗坏血酸盐(VOAsc)合成了我们之前的描述和表现为紫外可见和红外光谱(17,19]。股票的解决方案准备在室温蒸馏水和立即使用不同的化验。膜的纯胶原蛋白是含有VOAsc复杂,鉴于有序分层模式的胶原蛋白和钒(100,或200的解决方案μg / mL)或者在一个模具,根据我们先前所描述的方法(15]。这个配方被选为了获得10、20或40μg / mL VOAsc每厘米²膜表面(,,)。有序胶原膜没有钒也准备作为一个控制(基底条件,)。

膜的表面特征进行了使用扫描电子显微镜(扫描电镜;菲利普斯505年,荷兰),加速25千伏的电压。ADDAII软成像系统的图像进行了分析。傅里叶变换红外(FTIR)光谱收集来分析和比较所有支架样品VOAsc后的材料特性。红外光谱分析进行了使用一个IRAffinity-1光谱红外光谱(日本岛津公司)。支架被固定在一个port-cell和光谱收集2000至800厘米⁻¹。

渗透率是评价通过测量膜通量的氯化钠,与一个定制的玻璃细胞如前所述[15]。在这个设备的膜细胞分裂两个隔间:其中一个()充满了解决方案正在研究和其他(与蒸馏水)。完整的细胞保存在一个恒温槽在37°C。两个半电池与一个磁性搅拌装置,以避免可能的在膜表面形成一层没有被搅动的。流体样本取自隔间定期对电导率测定生理盐水浓度与辐射计CMD3电导仪。之前进行校准。渗透率是由 在哪里是细胞体积,膜区域,溶液的浓度,浓度在时间。的一块对使用的决定吗。最小平方合适后,斜率的价值。

2.2。钒释放动力学研究

发布概要文件的VOAsc脚手架是由孵化支架样品(1厘米²)含有不同数量(10、20和40μg / mL /厘米²)的VOAsc 1.0毫升无菌DMEM无酚红在37°C (pH = 7.4)不同的时间。在适当的时间(每15分钟在最初的小时,然后每30分钟直到5 h,最后每小时24 h),上层清液被删除,取而代之的是新鲜的媒体。药物的释放时间之后通过监测VOAsc出现在上层清液中,诸如使用T60紫外可见分光光度计(PG)。VOAsc浓度与吸光度的线性校准曲线在580 nm获得使用VOAsc标准范围0 - 1毫克/毫升。试验进行了一式四份,结果表示为部分释放与发布时间()。

2.3。生物相容性的研究

2.3.1。细胞培养和孵化项目

坳的生物相容性和Col-V(含有不同数量的VOAsc)膜被评估使用大鼠骨髓祖细胞(BMPC),调查可能的形态学的变化,增长,成骨细胞的诱导,chondrogenic分化生长在不同的支架。BMPC选择是因为他们代表更好的生理模型骨由于其自我更新能力和multilineage分化而克隆细胞系建立(20.]。在适当的条件下,这些细胞可以分化为成骨细胞,内层或脂肪细胞。此外,他们还可以用于体内骨组织再生的研究。BMPC孤立从年轻男性Sprague-Dawley大鼠的股骨和培养如前所述[21]。细胞被维护在一个基础培养基(dmem - 10%的边后卫)37°C到在不同的膜,镀后新鲜培养基添加每2天。之前他们使用细胞培养,1 - 2厘米²支架样品被浸泡在70%乙醇消毒和紫外线照射。不同的潜伏期后,和Col-V vanadium-loaded膜处理评估细胞粘附、增殖或分化。

为了比较的直接影响VOAsc除了在细胞培养基的影响复合膜释放,一些实验进行的镀BMPC标准组织培养板。在这些情况下,细胞培养的基础培养基和不同剂量VOAsc溶液中的复杂数据的表示1- - - - - -7。不同的潜伏期后,细胞单层膜处理评估增殖和成骨分化如下所述。

2.3.2。评价细胞生长

细胞被洗的磷酸盐(PBS, pH值7.4)与甲醇附着细胞被固定后,沾染了染色,使用Eclipse TS100尼康显微镜观察,并与CCD相机拍摄0.7 x DXM尼康镜头(16]。播种后细胞粘附(1 h)和扩散(24小时)进行评估通过计算细胞的数量/每实验条件字段代表的10个领域里的。

2.3.3。BMPC分化

为BMPC成骨细胞的分化,细胞培养不同时间的成骨的媒体(10% FBS-DMEM补充5毫米β-glycerol-phosphate和25μg / mL抗坏血酸)。成骨分化被碱性磷酸酶评估特定活动(高山)和细胞外钙沉积(矿化结节)。高山的决心,提交给15天成骨细胞分化与PBS和可溶性0.5毫升0.1%洗Triton x - 100。整除总细胞提取的用于蛋白质测定(22)和测量高山的光度法测定的初始利率(10分钟)的水解p-nitrophenyl-phosphate p-nitrophenol在37°C。矿化结节测量经过21天的成骨分化用茜素红染色。彩色钙沉积提取1毫升0.1 N氢氧化钠和光学密度记录在548海里。此外,1型胶原蛋白生产评估在细胞单层镀成标准的细胞培养板VOAsc的效果评估解决方案,由天狼星红染色,正如我们先前描述(17]。

Chondrogenic分化评估后21天文化Chondrogenic介质(23]。简单地说,10⁷BMPC /毫升resuspended 40μL无血清DMEM和四个人滴(10μ每下降L)小心地放在坳或Col-V电影包含在每个室内24-well板块。细胞被允许坚持在37°C 2 h。基础培养基,然后添加一个额外的24小时,之后,取而代之的是一个chondrogenic介质(无血清DMEM补充10 ng / mL的TGF-b3(美国PeproTech) 10⁻⁸M地塞米松,1 x胰岛素转移硒(其)补充(表达载体)),在这21天改变培养基培养细胞每三天。生产软骨素硫酸粘多糖(呕吐),chondrocytic分化的标志,被阿尔新蓝染色评估(pH值3)的文化。一夜之间,短暂,细胞被固定和染色0.1 N阿尔新蓝0.5%盐酸,与0.1 N HCl冲洗两次,一次蒸馏水。最后,提取染料4 M盐酸胍盐和吸光度测量在600海里。

2.4。评价支架的细胞毒性

生264.7 monocyte-macrophage细胞在DMEM包含10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ在37°C g / mL链霉素5%的股份有限公司₂的气氛。这个细胞株曾被用于我们的实验室评估细胞毒性,因为它代表了一个适当的和敏感的体外模型炎症(16,24]。与10% EDTA接种后,细胞被播种在坳或Col-V膜和孵化24 h后MTT生物测定。短暂、5毫克/毫升的MTT的解决方案是添加和孵化3 h (24]直到紫色甲瓒晶体的形成,溶解在二甲亚砜(DMSO)和吸光度测量在490海里。264.7在其他实验中,形态的原始细胞培养对脚手架进行了分析染色染色后,使用Eclipse TS100尼康显微镜,用CCD摄像机拍摄0.7 x DXM尼康镜头。

2.5。统计分析

结果表示为均值±SEM和获得至少三个独立的实验。两组之间的差异是由单向方差分析评估使用图基事后测试。为非正态的分布式数据,nonparametrical克鲁斯卡尔-沃利斯与邓恩事后测试执行,测试使用GraphPad InStat,版本3.00 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。所有统计分析被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。膜的表征

加入钒的脚手架被红外光谱证明。VOAsc在胶原蛋白支架的存在证明了特征峰为抗坏血酸在1755厘米⁻¹(C = O拉伸),1670厘米⁻¹(C = C振动)之前已经描述(19]。Col-V膜光谱,一个强的特征ν(V = O)出现在962厘米⁻¹和一个高峰在1372厘米⁻¹对应于(C3-O) V复杂的观察。此外,特征峰证明了胶原蛋白在1653厘米⁻¹(酰胺),1550 - 60厘米⁻¹(酰胺二世),1240厘米⁻¹(酰胺III)(图1(一))。

SEM分析表明支架表面平行排列的胶原纤维和槽结构(图1 (b)),它不会受到钒的存在复杂的(图1 (c))。胶原蛋白层的叠加是齐次坳(图1 (d))和Col-V(图1 (e))支架,不影响钒层的形态复杂,由SEM观测到的。然而,由于SEM不是最敏感的方法来评估支架孔隙结构的变化我们也调查性质的膜的通透性。

磁导率是一个重要的物理化学特性自VOAsc必须从脚手架以交付作为成骨的化合物。我们测量了膜通量的氯化钠来衡量其渗透率37°C。我们发现Col-V膜的渗透率值是2.16×10⁻⁴厘米/秒,代表增加约40%相比我们之前描述值坳脚手架(1.47×10⁻⁴厘米/秒(15)(图2)。我们也评估了可能VOAsc交付对脚手架渗透率的影响。因此,Col-VOAsc支架的渗透率确定最初如上所述,24小时后再次使用相同的膜清洗的蒸馏水(图2红色的情节)。我们发现这两个曲线的重叠,表明没有渗透系数的差异。

3.2。VOAsc释放动力学

为了分析钒释放的动力学,我们菲克第二定律用于一维传输与温和的肿胀率[薄聚合物电影25]: 在哪里累积绝对数量的药物释放时间吗;药物资料的绝对累积释放在无限的时间;是一个常数合并结构和设备的几何特征;和是释放指数,表明药物释放机制。图3显示了部分钒释放来电影(含不同浓度的药物)作为时间的函数。它可以观察到,VOAsc复杂以一种受控制的方式向媒体发布,快速和线性动力学在第一次3 h。在初始速率VOAsc版本中可以观察到微小的区别为不同的vanadium-loaded膜。不过,孵化时间结束时,每个膜的观察饱和曲线与钒的释放复杂的持续24小时。的动力学过程可以通过菲克模型分析来确定指数。插入图3的情节与,显示了线性回归的情节部分钒在短时间释放。扩散系数的值(),,为,,分别,虽然没有统计上的不同。这些结果表明,钒释放的机理发生Fickian扩散过程。

3.3。VOAsc BMPC增殖和分化的影响

在第一系列的实验中,我们使用BMPC播种标准组织培养板,为了调查VOAsc复杂的影响直接添加到培养基。治疗的细胞有2.5 -100人μM VOAsc 24 h对细胞增殖导致两相的影响。图4(一)结果表明,10 - 50μM VOAsc显著刺激BMPC扩散,而高剂量显示抑制细胞生长的倾向。钒的影响复杂的BMPC成骨的潜力评估2周后成骨的媒体文化的决心的高山,1型胶原蛋白生产、和矿物的结节。我们可以看到在图4 (b),在BMPC VOAsc并不影响高山。在类似的情况下,VOAsc剂量依赖性增加1型胶原蛋白生产和钙沉积矿化结节。这些结果表明,在低剂量,VOAsc疲软的有丝分裂原,其长期暴露于BMPC导致成骨的影响。

3.4。BMPC VOAsc-Collagen支架的生物相容性

使用BMPC支架的生物相容性研究。细胞被播种和来支架和允许坚持(2 h)或增长(24小时)。细胞连接到两个和膜显示随机分布与波峰和波谷之间均匀附件(数字5(一个)和5 (b)、职责)。高倍镜下,细胞圆形或多面与一个或多个细胞质扩展(数字5 (c)和5 (d))。对于其他VOAsc-loaded膜,也获得了类似的结果和(数据没有显示)。

然后,我们调查的影响加载不同剂量VOAsc BMPC胶原膜的生长和分化。因为它可以看到数据6(一)和6 (b)有doses-dependent增加细胞粘附和增殖BMPC相比有序胶原膜()。细胞分化也是改善vanadium-loaded矩阵。在那些支架,有剂量依赖性增加高山活动(图6 (c))和矿藏(图6 (d))相比,胶原蛋白有序矩阵()。此外,细胞分化为软骨细胞产生更多的插科打诨(20μg / mL VOAsc每厘米²)比在支架膜(%的坳,图6 (e))。

因此,我们的观察表明,添加生长因子如钒(IV)抗坏血酸盐复合可以提高胶原蛋白的能力矩阵支持粘附,生长和分化BMPC chondrocytic和成骨细胞的表型。

3.5。细胞毒性研究

虽然胶原蛋白之前用于脚手架准备和它展示了生物相容性,我们想知道如果我们的结构可能产生任何原始264.7巨噬细胞的细胞毒性影响的文化。图7(一)显示了这些细胞的增长上和支架,维护他们的圆形单核细胞的形态没有激活(即的迹象。缺乏细胞质的扩张,如传播或形成的细胞突起)。MTT评价演示了相同数量的幸存细胞上生长和膜(图7 (b))。

4所示。讨论

许多骨组织修复策略集中在仿生支架的发展制定创新组织替代品的协同组合矩阵与细胞疗法。一个有趣的策略是合成和天然高分子的结合以达到适合骨组织的力学性能。此外,改善osteoconductivity并入支架可以实现的增长刺激物质和/或干细胞。胶原是骨细胞外基质的主要成分,是一个有趣的骨组织工程材料,因为它提供了先天的生物信息所需的细胞粘附、增殖和取向,促进chemostatic响应(26]。另一方面,胶原蛋白可以很容易的获得与微或nanometric结构支架,已被证明作为成骨细胞的发展模板(15,16]。在这项研究中,我们扩展先前的研究设计一个collagen-based支架,包括一个复杂的钒(VOAsc)体外成骨的属性。包含VOAsc到胶原蛋白矩阵没有影响的宏观结构脚手架SEM观察到,虽然增加了生物材料的磁导率。有趣的是,没有变更的渗透性vanadium-loaded支架前后24小时洗,即使交付实验证明VOAsc呈正向媒体公布的在同一时间。因此,我们假设钒与胶原矩阵创建一个更复杂的交互可逆透水结构但不住宿的毛孔矩阵。渗透是一种物理参数描述复杂的材料属性的调节分子运输内外脚手架的各个方面。这个属性也是一个重要的监管机构细胞分化和支架降解27- - - - - -29日]。高渗透率值似乎成骨的所需和chondrogenic标记表达,影响关联与维护所需的低氧张力chondrocytic表型(27]。在我们的文化条件,BMPC得以生长和分化成成骨细胞或软骨细胞有序胶原蛋白支架,表达足够水平的成骨分化或chondrocytic标记当lineage-specific条件。然而,由于chondrogenic和成骨诱导显著增加了更多的渗透vanadium-loaded支架,渗透率似乎并不是一个细胞命运在我们的系统的主要监管机构。

到目前为止,几项研究已经评估骨骼和软骨再生使用胶原蛋白支架(5,29日,30.]。在这些研究中,发现了胶原蛋白结构有效地修复关节软骨或骨缺损。然而仍有一些尚未解决的问题,如骨膜支架植入需要防止超然,关节置换的透明软骨纤维软骨,持续疼痛,和机械性能不足5,29日- - - - - -31日]。为了提高我们订购的osteoinductivity胶原VOAsc矩阵我们加载成骨的复杂。在溶液中我们曾证明VOAsc刺激成骨细胞的生长和发育,增加胶原蛋白的分泌和细胞外MC3T3E1细胞矿化。这些影响与激活的细胞外调节激酶(ERK)途径17]。我们还表明,VOAsc诱发快速ERK磷酸化(分钟小时)和再分配,表明这个复杂的可以通过MAPK通路调节成骨细胞的增长。在我们目前的研究中,我们确认之前的观察使用老鼠BMPC VOAsc。BMPC具有自我更新能力和分化multilineage在特定的培养条件。此外它代表更好的骨细胞模型,使用的优势,可以在体外和体内研究骨组织再生。直接添加VOAsc文化媒体刺激BMPC扩散生长在标准组织培养板两相的方式。尽管低剂量(10 - 50μ米)显著提高细胞增长,高的可以抑制。在长期的实验中,低剂量的VOAsc(做些μBMPC M)显著增强成骨的潜力,由成骨细胞的标记表示1型胶原矿化生产和矩阵。更重要的是,这些结果表明无毒钒复杂对这些细胞的影响。

在我们目前的系统(BMPC种植在胶原蛋白支架)是预计VOAsc必须首先释放支架对细胞行为。因此释放动力学评价,显示矩阵的快速VOAsc发布前三个小时内浸到文化媒体,之后到达了一个高原。这种影响是不依赖于浓度VOAsc坳中加载支架(图3)。此外,三种膜的扩散系数的评价研究是非常相似的暗示的速度释放动能主要依赖于扩散过程。我们的结果也可以表明,尽管最初释放VOAsc可能受益BMPC附件和增长,降低钒复杂的但持续释放之后可以作为成骨的或chondrogenic代理。在这种背景下,我们找到了一个刺激细胞生长在高山活动Col-V支架剂量依赖性的方式。在媒体上直接添加VOAsc没有修改这个标记。另外,初始VOAsc存在于细胞膜与细胞的相互作用可以启动信号诱导特定transcriptor BMPC的命运的相关因素。提出了类似的建议Laurencin集团的短期治疗小成骨的分子(32]。当地交付已成为另一种系统性的交付,因为它可以避免药物不良影响。在这个意义上其他组织开发了控释系统引导骨组织,寻找降低药物毒性和增加骨骼和软骨基质沉积(33- - - - - -35]。事实上,包含支架的成骨的药物会减少修理时间(12]。

另一个重要的问题是植入支架的可能性可能会导致毒性、炎症或免疫原性。因为这个原因我们进行实验评估的反应巨噬细胞细胞系在文化、原始264.7细胞,这是一个公认的模型来研究炎症反应和细胞毒性药物或支架。我们先前已经表明,一些钒配合物直接添加到培养基能引起毒性作用如增加活性氧和氮物种(36,37]。此外,口服治疗一些钒衍生品显示胃肠道毒性(38]。在这个工作中,我们的研究结果表明,没有形态变化在细胞生长在胶原蛋白或vanadium-loaded胶原蛋白支架。此外,细胞保存相同的两种膜增殖率。因此,毒性是避免钒包含在脚手架时,这一战略已经被其他组织细胞毒性药物(34,39,40]。虽然在某些情况下毒性与支架降解[有关38- - - - - -40),我们目前的系统退化的胶原蛋白支架有或没有VOAsc,如果它存在,并没有使毒性。

5。结论

总之,我们已经开发出有序胶原蛋白支架为骨和软骨组织再生。VOAsc包含进支架有效提升BMPC成骨细胞和软骨细胞的分化,没有毒性作用。我们的研究结果表明,collagen-VOAsc构造可能是骨软骨组织工程的潜在用途。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这部分工作是支持由Facultad de Ciencias正序连赢,所de La Plata (UNLP) Comision de Investigaciones Cientificas de La Provincia de布宜诺斯艾利斯(CICPBA),和报社Nacional de Promocion Cientifica y Tecnologica (Prestamo报价- 1728 / OC-AR,皮克特人1083)。安娜·m·Cortizo属于Carrera del Investigador CICPBA,著Ruderman和玛丽亚你们俩Molinuevo Carrera del Investigador成员国家之内马志尼的国家,和伊内斯g . Mogilner得到国家的支持。

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