一个新的体内评估半导体纳米晶体毒性的模型系统

摘要

在新兴的纳米技术领域，一个关键问题与新型纳米材料对环境和人类健康的潜在影响有关，因此可以以最小的风险使用这项技术。智能纳米材料是一种专为结合在单一结构上的多用途标签和特性而设计的材料，需要对化学物理特性和充分的毒理学评估进行全面表征，这是一项具有挑战性的工作;的体外通常用于纳米毒性评估的毒性测定不能准确预测在活的有机体内响应。为了克服这些限制并评估碲化镉量子点在表面涂层中的毒性特性，我们使用了淡水水螅体九头蛇寻常的作为一个模型系统，我们评估了在活的有机体内通过对形态特征、种群增长率和再生能力的影响进行评分，得出急性和亚致死毒性，为纳米毒理学提供了新的研究线索。

1.介绍

在过去的十年中，胶体半导体纳米晶体的合成和生物功能化的进展引起了生物学和医学领域研究人员越来越广泛的兴趣。量子点(QDs)作为细胞结构和分子的特异性标记物，监测活细胞和动物中的分子和生理事件的大量成功使用，证明了它们作为多用途生物探针的巨大潜力[1，2]然而，关于纳米颗粒本身是否能引发生物反应存在一个开放性问题，这可能会干扰他们打算测量的现象。越来越多的证据表明，即使在没有特定配体的情况下，纳米颗粒也发挥着积极的作用，并且尺寸和电荷等因素对ac反应至关重要细胞反应的激活、内化和细胞内运输[3.，4］．因此，致力于开发用于生物医学目的的纳米结构材料的广泛科学界的一个优先事项是将纳米材料的物理和化学特性与其行为联系起来，在活的有机体内．而大多数已发表的数据处理这一重要问题依赖于细胞培养研究，并集中于识别影响纳米颗粒对活细胞影响的物理化学参数[5，6，我们提出了一个新的模型系统，以工作在整个动物水平。小的淡水珊瑚虫九头蛇寻常的(刺胞虫、水螅)是一种双胚层动物，位于后生动物进化的基础上，仅由两个上皮细胞层(一个内内胚层和一个外外胚层，面对低离子强度的介质)，少数分散的特化细胞类型，一个神经网络控制功能和生理(图)1)这种结构的复杂性，比脊椎动物简单，有中枢神经系统和专门的器官，但比培养细胞复杂得多九头蛇类似于细胞和远处区域在生理上连接的活组织[7］．

解决生物问题的可行性九头蛇正如我们组之前展示的模型系统。在一项开创性的工作中，我们合成了谷胱甘肽功能化量子点(GSH-QDs)，研究了在活体息肉中激发的生物活性，并确定了gsh靶向细胞[9］．在接下来的研究中，我们使用不含官能团的杆状CdSe/CdS纳米晶体(QRs)来识别细胞qr相互作用的机制。出乎意料,九头蛇QRs波处理显示出一种行为反应，一种触角扭动活动，其特征很好，并显示为钙依赖性，依赖于触角神经元的存在。这些结果表明，在使用QRs波之前，需要深入研究活生物体与新合成纳米材料之间的相互作用我们还确定了参与相互作用的化学和生物因素-九头蛇［4)工作都在活的有机体内，在整个动物和分离细胞的水平，以及体外在固定标本上，得出结论，QR内化是QR正表面电荷和细胞膜上存在膜联蛋白调节的膜转运事件的综合结果。

这是一个显著的优势九头蛇作为金属基纳米晶体靶向的模式生物，有可能评估这些纳米颗粒在不同方面的潜在毒性九头蛇生理机能。目前，可获得适合评估纳米毒性的新动物模型是一个优先考虑的问题。九头蛇对一系列污染物敏感，已被用作水污染的生物指标[10- - - - - -12］．金属污染物如铜、镉和锌已经被测试与不同的九头蛇根据中位致死浓度(LC50)，所有物种的相对毒性依次从毒性最大的铜到毒性最小的锌镉[13］．针对哺乳动物受体的药物和药物也被证明会产生负面影响九头蛇，显示了利用这种水生无脊椎动物准确评估通过污水和垃圾填埋场泄漏进入天然水体的药物的潜在毒理学效应的可行性[12］．有几种生物测定方法可用来评估某一特定化合物的急性或亚致死毒性。息肉暴露于不同的药物可能导致(1)形态特征和发育程序的改变，(2)再生或模式形成的改变;惊人的再生能力九头蛇依靠胃区有丝分裂活性多能干细胞的存在，能够在72小时内再生一个新的有机体;由于这一过程受时间、位置和形态发生因素的控制，培养基中有毒物质的存在可能会影响整个过程，(3)种群增长率的变化;生物分析测量九头蛇无性繁殖的种群增长迅速、敏感和精确。大量的九头蛇由于体型小，繁殖速度快，可以培养[14].高生育率九头蛇可在短时间内进行亚慢性毒性试验，以评估毒物的种群繁殖效果。

在本文中，我们评估了CdTe荧光量子点的毒理学效应，呈现出不同的化学涂层，对整个生物体，九头蛇寻常的．通过使用不同的方法在活的有机体内研究了CdTe量子点的形态特征对生长速率和再生的影响，确定了CdTe量子点的不同行为和毒理学效应，如表面涂层的影响，显示了使用的可行性九头蛇作为纳米毒理学研究的快速、低成本和可靠的工具。

2.方法

2．1．纳米晶体工作

本研究中使用的水溶性CdTe量子点表面包覆巯基乙酸(TGA)或谷胱甘肽(GSH)，并按[15］．TGA-QDs(平均直径3.1 nm)和GSH-QDs(平均直径3.6 nm)分别在537 nm和598 nm处出现首次电子跃迁的吸收波长。

2.2.水螅培养

九头蛇寻常的(株Zurich，最初由P. Tardent获得)在生理溶液(SolHy: 1 mM CaCl)中进行无性培养₂, 0.1 mM那科_3.，pH7），通过Loomis和Lenhoff的方法进行轻微修改[14].动物被关在家里每周喂食三次新鲜孵化的蛋卤虫盐沼无节幼虫．

2.3.完整和再生动物的体内实验

每组20只动物在塑料多孔中收集，并在室温下使其在300℃平衡L的生理溶液(SolHy: CaCl₂1. 嗯，那科_3.0.1 通过向每个含有10个息肉的孔中添加测试量子点并在必要时进行培养，开始测试。监测量子点摄取在活的有机体内，除非另有说明，通过连续录像，使用摄像机数码相机(奥林巴斯)连接到配备荧光滤光片组(BP460-490 /DM505/LP510)的立体显微镜(奥林巴斯ZSX-RFL2)。广泛的洗涤后,在活的有机体内通过使用立体显微镜和倒置显微镜（Axiovert 100，蔡司），配备数字彩色摄像机（奥林巴斯，DP70）和荧光滤光片组（BP4502013490/FT510/LP515），在多个放大倍数下完成成像。为了测定急性毒性，通过使用结构渐进性变化评分程序监测QD治疗引起的形态学变化。该程序允许检查动物从QD诱导的损伤中恢复的能力。每天，使用体视显微镜，可识别的物理变化对不同根据Wilby描述的得分值（范围从1到10），记录不同的QD范围[8]。对于图像采集和分析，使用软件系统Cell F（Olympus）。对于再生实验，将处理后的息肉在胃区域和胃壁进行平分在活的有机体内在截肢后的不同时间点拍摄。采用定量的方法对远端再生进行评价九头蛇，根据对再生14天触须伸长的估计，测定触须再生指数(TRI)，以及对不同实验中不同样本的剖面进行统计分析[16]。根据此方法，对于息肉，有可能计算时t对应的触手再生指数(TRI)如下: 在哪里表示生理条件下单个珊瑚虫的最大触手数，即:；表示类的触手数(设置了5个触手等级，长度分别为1/8、1/4、1/2、3/4和1)th九头蛇当时.的三值系列在固定的观察时间得到的息肉代表了息肉的个体再生情况。最后，对于每组九头蛇，计算任意观测时间的平均TRI以跟踪各组的平均再生率。实验在空调环境中进行并在每个测试条件下重复三次。采用Spearman-Karber trim法计算半数致死浓度（LC50）和致死时间（LT50）[17］．

２.４.九头蛇的增长率

实验动物(4九头蛇用指示的QD处理4 h，然后清洗，第二天置于3.5 cm培养皿中(1九头蛇/处于同一发育阶段的对照动物未接受治疗。实验组和对照组均未接受治疗九头蛇每天喂食1次，以种群倍增时间为生长参数。生长速率常数()的定义为,在那里是同一时刻动物的数量吗和动物的数量．为，即人口翻倍的时间通过线性回归确定[18］．

2.5.统计分析

使用Spearman-Karber修剪法计算LC50和LT50值[17］．采用非参数Friedman分析比较形态条件的中位评分[13］．一个-测试()用双因素方差分析（ANOVA）检验单种群增长率回归曲线斜率的显著性(）.

3.结果

使用了两种类型的高发光CdTe量子点，巯基乙酸封端CdTe量子点（此处表示为TGA量子点）[15]和谷胱甘肽修饰的量子点（此处称为GSH量子点），以及在不同培养时间对动物行为和形态的影响九头蛇作为一种小型水生动物，简单地将QD添加到培养基中，就可以研究QD与动物之间的相互作用，避免了传递方法或侵入性操作。将不同浓度的TGA-QDs和GSH-QDs添加到活息肉组中，通过荧光立体显微镜持续监测，观察孵育后潜在的QD摄取、定位和细胞形态。通过荧光显微镜观察，动物没有出现荧光标记，可能是由于钙离子的影响九头蛇培养液，已被证明可以漂白QD发光[19].如图所示2，采用基于cdte的量子点处理诱导形态学改变，并根据以前的方法评分[8］．

通过应用修剪Spearman-Karber方法获得了半致死浓度（LC50）的精确估计，该方法具有良好的统计特性，易于使用，并推荐用于精确计算LC50值及其95%置信区间终点[17］．因为这种方法计算死亡的动物和九头蛇为了恢复损伤，我们将死亡动物视为得分低于4的动物。治疗动物在每次QD试验浓度下记录的中位数得分随着暴露、浓度和时间的增加而降低，如图1所示3.．

在表1使用Spearman-Karber方法计算的LC50和LT50值报告了TGA-和GSH-封端量子点。TGA-量子点的特点是LC50和LT50值均低于GSH量子点，表明巯基乙酸表面与谷胱甘肽封端相比发挥了更大的毒性作用。

全面描述CdTe量子点对动物的毒理学影响九头蛇之后，我们又采用了两种方法。第一种是基于九头蛇使截肢后身体缺失的部分再生。在头部再生过程中，可以通过立体显微镜监测新触手的发育，每天可以对触手的数量和长度进行评分，以评估毒物对这一受控过程的潜在影响。我们使用定量方法来测定QD治疗对患者的影响九头蛇再生(16]，每天计算每一种情况下的触须再生指数(TRI)，即平均触须长度/九头蛇（相对于最大触手长度，假设过程完成时为1）。

如图所示4，TGA QD治疗组动物的TRI值明显低于未治疗组动物的TRI值。这些差异在触手再生的最初几天更为明显（图左面板中灰色阴影）4)，在触手发育的后期不明显。相比之下，gsh -QD处理的动物与未处理的动物具有相似的TRI特征，表明这种QD类型的动物没有毒性作用九头蛇再生。

最后，探讨CdTe量子点对细胞的潜在长期毒性作用九头蛇对生殖能力进行了测定九头蛇组织通常由上皮细胞周期长度、外胚层细胞“过量”吞噬和芽形成之间的平衡来调节[18］．因此，人口增长率是衡量人口增长的一个间接指标九头蛇组织生长速度和细胞活力。计算QD处理的息肉的生长率，并在常规喂养条件下与未处理的动物进行比较。如图1的图表所示5（a），用GSH QDs（使用两种不同的亚致死浓度）治疗的息肉的生长速度与未治疗的动物相似，表明没有毒性作用。仅在实验开始时观察到轻微差异，如比率所示(个体数/创始人数)，但其后，即第11天，差异不显著。

固定增长率九头蛇用TGA量子点处理（图5（b）)相反，与未处理组相比，差异显著九头蛇．比率差异，表明这种类型的QD对九头蛇生殖能力。

4.讨论

尽管CdTe QD对细胞培养系统的毒性已经积累了丰富的数据[20.- - - - - -23]，在整个动物水平上评估毒理学效应是科学界的优先事项。九头蛇寻常的为研究新型纳米材料对生物的影响提供了一个可行的系统，因为它非常简单;它只有两层细胞结构，因此可以与活体组织相比，但它呈现了进化动物的复杂生理和行为。上皮的透明性使追踪荧光纳米粒子成为可能，而其对金属的敏感性使其成为纳米毒理学研究的理想模型。在这项研究中，我们研究了CdTe量子点对九头蛇，采用三种不同的方法，即评估对息肉形态、再生和生殖能力的影响。我们定量估计了这些影响，分别计算了LC50和LT50值、触手再生指数和种群增长率。总的来说，我们的数据显示，与gsh盖帽的QD或未经处理的动物相比，tga盖帽的QD显示毒性作用。通过荧光显微镜，我们无法评估荧光量子点的吸收九头蛇细胞;在这个阶段，我们不能评估毒性是由于TGA-QDs发挥的细胞内或细胞外的作用。正如我们之前所展示的，正表面电荷是纳米粒子内化成纳米粒子的关键因素九头蛇细胞[4]，所观察到的TGA-QD的毒性可能是由于细胞外活动，即与二价离子结合并竞争膜受体，我们目前正在这方面进行研究。

一些研究表明，量子点的细胞毒性作用可能是由镉离子（Cd）介导的^２＋)。[24确实,九头蛇对游离镉离子敏感[10］．然而，我们使用颗粒QD制剂的上清液进行了类似的生物测定，我们没有检测到任何诱导毒性，这表明Cd可能有作用^２＋由盖帽TGA的负基团配位的离子，在量子点表面，而不是释放Cd^２＋来自QD核心。因此，鉴定九头蛇Cd^２＋cdte - qd诱导毒性的潜在机制可能会被揭示出来。动物生存能力和QD之间的剂量依赖相关性进一步支持了它们的细胞毒性取决于QD的作用而不是其他正在进行的过程的假设，为未来研究CdTe-QD反应的有趣的细胞和分子机制打开了道路九头蛇用细胞器特异性染料成像的CdTe量子点处理的动物的单细胞制备的共焦激光显微镜可能揭示可归因于活性氧（ROS）的存在的溶酶体损伤，活性氧可通过Cd形成^２＋-特定的细胞途径和/或通过cdte触发的光氧化过程，涉及单线态氧或电子从受激量子点转移到氧[20.，25］．细胞生物学研究工具检查坏死过程的存在或诱导程序性细胞死亡(凋亡)将有助于揭示CdTe QD毒性的机制，这将对破译高等生物中半导体纳米晶体毒性的基础有非常宝贵的帮助。

总之，我们已经证明，当CdTe量子点与九头蛇细胞，这种相互作用诱导细胞形态的进行性变化，最终导致细胞和动物死亡。CdTe量子点诱导的细胞毒性与量子点暴露时间和浓度以及量子点的表面化学和涂层有关。动物接触2小时 纳摩尔剂量CdTe QD的hr诱导进行性形态学改变，得分高达72 检测到完全死亡时的小时数。通常在芽形态发生和再生过程中建立的前后极性没有受到影响。剂量反应曲线显示，TGA-QD暴露的诱导毒性比GSH-QD更明显。通过使用亚致死剂量的量子点治疗动物，再生试验和种群增长率均受到TGA的影响，而非GSH封端量子点的影响，这表明GSH量子点的亚细胞稳定性增强或GSH对潜在Cd的保护作用^２＋全身的活性氧。

由于纳米颗粒可能通过污水排放和垃圾填埋场泄漏进入自然水域，并对水生物种(包括淡水无脊椎动物)构成未知风险，我们建议，无脊椎动物检测不仅可用于提高纳米生态毒理学的知识水平，还可用于通过标准化测试调查工程纳米粒子在水生环境中的行为和生物利用度。综上所述，我们认为我们的简单模型系统，目前主要被一些生物学家用于研究发育和再生过程，有很大的潜力来启发许多在纳米科学领域工作的科学家。从化学家到毒理学家，都需要新的模型来研究纳米粒子对生物体及其环境的影响，并研究生物-非生物相互作用的分子基础。

致谢

我们感谢Giuseppe Nolfe博士(波佐利控制学CNR研究所)在数据统计分析方面的宝贵帮助;Giuseppe Marino获得技术援助;乔凡娜·德·罗萨请求协助九头蛇形态学评分。这项工作得到了纳米科学- era网络项目NANOTRUCK(2009-2012)和裘槎基金会项目9220054的支持。

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