在活的有机体内可注射预混合放射性不透明磷酸钙水泥的评价

摘要

在这项工作中，一种辐射不透明的预混磷酸钙水泥(pCPC)已经开发和评价在活的有机体内．在水泥浆中加入0 ~ 40%的氧化锆可获得不透明度。研究了氧化锆对凝固时间、强度和辐射不透明度的影响。在在活的有机体内研究用pCPC、PMMA或骨碎片填充大鼠椎体2 × 3.5 mm的圆柱形缺损。纳米spect CT检测骨再生过程中成骨细胞活性。研究表明，在水泥中加入氧化锆后，水泥的凝结时间变长，抗压强度降低。所有材料评估在在活的有机体内研究填充了骨缺损，在损伤部位有很强的成骨细胞活性。尽管成骨细胞活性，PMMA阻止骨愈合，骨碎片组显示极少的新骨形成。12周时，pCPC部分被吸收并被新骨取代，骨长入良好。由于pCPC具有良好的处理性、放射性混浊性，并可在骨水泥吸收的同时使松质骨愈合，因此可以考虑将其用于椎体骨折的微创治疗。

1.介绍

由于人口老龄化和需要较少运动的生活方式，现在许多老年人的骨骼结构很弱。骨结构较弱的并发症之一是骨折风险增加，特别是在椎体。椎体压缩性骨折疼痛。为了减轻疼痛，可以使用椎体成形术来固定骨折[1］.传统上使用的是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)水泥。然而，使用PMMA也有一些并发症，如水泥渗漏和增加相邻骨折的风险[2，3.，因此人们对寻找替代材料的兴趣增加了。磷酸钙骨水泥(CPCs)，首次出现于80年代初[4，5，是PMMA的替代品。由于与骨的化学相似性，cpc具有良好的生物相容性并被再吸收在活的有机体内［6，7］.cpc由磷酸钙盐组成，与水混合后溶解，然后沉淀形成刷钙或磷灰石的固体，这取决于溶液的pH值[4］.在临床实践中，已经有许多商业cpc作为骨空洞填充物使用[8];但是很少用于椎体成形术。在脊柱应用中使用cpc有两个主要障碍:处理和放射不透明。要获得具有足够工作时间的CPC并非易事，该CPC可通过G11或G13针头进行注射，而无需压滤。有关注射性和设置调节器的各种出版物可参阅[9- - - - - -13］.最近采用了一种创新的方法，将水换成甘油作为混合液体[14］.这为外科医生提供了无限的注射时间，并且在预混合磷酸钙水泥(pCPC)就位并与水接触之前，粘度保持不变。预混概念已被证明适用于刷灰石和磷灰石水泥[14- - - - - -16］.在椎体注射过程中，重要的是能够用x线跟踪骨水泥以避免渗漏。在PMMA的情况下，这是解决添加任何ZrO₂或贝索₄［17，18］.一些添加剂已经被建议添加到cpc的辐射不透明度，如铋[19]和锶[20.］.然而，很少有关于ZrO的CPC的报道₂和贝索₄，这些材料在PMMA水泥中有很好的使用记录。

本文的目的是评价一种含ZrO的预混磷酸钙水泥₂，考虑其凝固时间、抗压强度、辐射不透明度，以及其在活的有机体内椎体大鼠模型的行为。

2.方法

2．1．ZrO的影响₂内容

2．1．1．水泥制备

水泥的粉末部分包括β-tricalciumphosphate (β-TCP, Fluka)，一水磷酸一钙(MCPM, Scharlau)，氧化锆(ZrO_2，Sigma-Aldrich)。MCPM和β-TCP以等摩尔的量混合。到0,10,20,30，或40% (w/w) ZrO₂是补充道。然后将粉末与甘油(99%，Sigma-Aldrich)混合。在所有评价的成分中，粉液比为4.2 g/mL。在混合之前,βtcp和ZrO₂用热(200°C, 2小时)消毒[21])， 70%乙醇浸泡24h灭菌。

2.1.2。抗压强度

混合后，膏体被注入圆柱形模具中∅6mm，高度12mm，两端开孔进行抗压强度测试，然后浸入37°C磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4, Sigma-Aldrich)模拟生理pH并开始设置反应。24小时后从模具中取出样品，使用万能试验机(Shimadzu AGS-H)，十字头速度为1mm /min;记录每个样品的最大压应力。在样品和十字头之间放置一层塑料薄膜，以减少模具产生的缺陷的影响。每组检测6个样本。

2.1.3。设置时间

搅拌后，将水泥膏体注入4个圆柱形模具中∅6毫米，高度3毫米为凝固时间。为了使水泥凝固，将模具浸泡在37°C的PBS中。当样品能够支撑453.5 g尖端直径为1.06 mm的Gillmore针而不断裂时，认为胶结物已经凝固。四个样品连续测试，每次测试间隔4分钟。取试样承受重量的时间与试样在荷载作用下断裂的前一次时间的平均值为设置时间。每组测量三次。

2.1.4。防辐射

为了测量x射线的不透明度，制作了1毫米厚的样品。x射线不透明度测量在1mas, 40和80 kV。1毫米的pmma基水泥(Vertebroplastic, DePuy, USA)样品，其中有硫酸钡作为辐射不透明剂，使用0.5 - 2.5 mm的铝楔在0.5 mm的步骤作为对照。

2．2.在活的有机体内

水泥用于在活的有机体内如上所述，制备了含20% ZrO的研究₂．在无菌条件下，于4天前将1 mL注射器预充水泥在活的有机体内实验。注射器置于8°C保存至手术。

2.2.1。动物手术

3个月大，480 ~ 600 g雄性Wistar大鼠用氟烷麻醉。手术部位用碘伏冲洗三次，尾部根部结扎防止出血。切除尾部远端后，在第四或第五尾椎轴向钻一个直径2.0 mm、深3.5 mm的孔。为了阻止骨的再生，将一根不锈钢丝植入孔内。伤口用不可吸收的聚丙烯缝线缝合。用x射线证实了金属丝的定位。12周后再次麻醉动物，取出植入的金属丝。这个洞要么用聚甲基丙烯酸甲酯(Heraeus Palacos R) (), pCPC ()，或与受影响的人类冻干骨碎片()，伤口就愈合了。纳米spect /CT随访骨再生。12周后，这些动物被过度麻醉并处死。最后2节椎体(最后手术椎体+ 1节健康椎体)用4%甲醛固定，显微ct和组织学分析。

2.2.2。Nano-SPECT / CT分析

对每组2-3只大鼠进行单同位素纳米spect /CT (Bioscan)成像，以跟踪骨替代品的整合和骨再生。每周进行一次纳米spect /CT检查，共6周，第12周再次进行。大鼠接种0.5 mL, 150 MBq^99米Tc-methyl diphosphonate (^99米Tc-MDP)，氟烷麻醉下通过尾静脉。亚稳锝(^99米Tc)被标记到一个膦酸盐化合物上，如MDP，以生成^99米Tc-MDP，选择性富集于成骨细胞。选择性积累^99米Tc-MDP通过在骨中羟基磷灰石表面的化学吸附和与羟基磷灰石晶体结构的结合来保证[22］.两小时后用乙醚腹腔麻醉动物，并进行30分钟的图像采集。根据同位素密度，与近端健康椎体相比，再生活性以百分比表示。

2.2.3。ct机分析

采用显微断层扫描(Skyscan 1172 x射线显微断层扫描，Kontich, Belgium)对手术椎体进行检查。扫描是在60kv电压和铝滤波器下进行的。使用skysccan Nrecon软件，使用改进的Feldkamp算法进行重建。将视图旋转180度(旋转0.5度)进行显微层析重建。3D可视化使用了SkyScan CTvox (Kontich, Belgium)。

2.2.4。组织学

甲醛固定的第4和第5椎体用Biodec-R溶液浸泡1周脱钙。从石蜡块上切下5微米的纵向切片，并安装在玻片上。常规苏木精-伊红(Merck & Co)染色用于确认微ct测量结果。

3.结果

３．１．评价ZrO₂内容

3.1.1。抗压强度和凝固时间

抗压强度随ZrO含量的增加而降低₂如图所示1．当没有ZrO的时候₂水泥抗压强度为13.5(±0.6)MPa, ZrO为40%₂抗压强度降至8.0(±1.2)MPa。括号中的值为标准差。有20% ZrO₂强度为11.8(±1.2)MPa。越来越多的ZrO₂也增加了设置时间，如图所示2．0% ZrO₂设定时间为20(±4)分钟，ZrO为20%₂具有26(±2)的凝固时间，用40% ZrO₂， 37(±2)min。

3.1.2。防辐射

从图中的x射线图像3.可以得出20%的ZrO₂给予足够的辐射不透明度，相当于1-1.5毫米铝和脊椎塑料在40千伏和80千伏。获得了良好的射电对比在活的有机体内pCPC，如图所示的micro-CT图像6．

３.２．在活的有机体内

动物对植入物的耐受性良好，无伤口感染或排斥反应。

3.2.1之上。Nano-SPECT / CT分析

种植后12周监测成骨细胞活性(图)5）.活动度计算为下一个健康椎体的百分比。CT图(图中蓝线)4)遵循两个椎体的结构，但从图中红线看，操作椎体的像素强度远高于健康对照椎体4．在所有动物身上都观察到了同样的趋势。在所有三组中，其数值都高于正常骨，如图所示5．此空洞缺损的成骨细胞活性高于正常骨，并在植入后的前5周内保持高水平。各组之间的整体活性具有可比，pCPC的活性略有上升趋势，特别是在第2周，而骨碎片和PMMA组的活性略有下降。在研究期间，任何组的任何动物的成骨细胞活性都没有恢复到正常水平(图中单位为100)。

3.2.2。ct机分析

在图6给出了具有代表性的填充缺陷及其横截面的3D效果图。如图所示，在填充PMMA的椎体中(上)，缺损被PMMA完全填充，未见成骨。PMMA与骨分离。这一结果在PMMA组的所有动物中都是一致的。

在充满骨屑的椎体中，没有骨吸收或骨吸收缓慢，骨愈合有限。图中横断面CT图像显示骨碎片与新骨之间无骨连接6(底部)。有一些骨骼形成;然而，骨碎片仍然与骨头分开。在图中的组织学图像中7 (b)骨碎片被认为与新形成的骨头直接接触。

在椎体pCPC的情况下(图中中间图像)6)可观察到新骨形成(蓝色箭头)。pCPC部分被吸收并被骨骼取代。然而,ZrO₂没有被吸收，因此可以在新形成的骨中观察到骨水泥的残留。组织学结果,(图7(一))证实了pCPC的纳米ospect和CT结果。与新生骨直接接触，无免疫反应。

4.讨论

本文介绍的预混水泥中含有ZrO₂获得辐射不能透过。越来越多的ZrO₂在水泥浆中会减少活性物质(MCPM和βtcp)。当水泥与水接触时，活性物质就会溶解，并开始形成铌铁矿晶体，使水泥具有强度。随着ZrO的增加，抗压强度由13.5(±0.6)MPa降至8.0(±1.2)MPa₂从0到40% ZrO₂(图1）.随着ZrO含量的增加，凝固时间增加₂．0% ZrO₂在40%的ZrO下，设定时间为20(±4)分钟，而在37(±2)分钟₂(图2）.在之前的一份关于预混铁镍石水泥的出版物中也发现了同样的趋势[16而高强度样品凝固时间也较短。由于用于测试凝结时间的方法是测量水泥获得一定强度的速度，因此这种关系是预期的。随着ZrO₂随着水泥含量的增加，实验中发现水泥的粘度降低。自从ZrO₂的密度比β-TCP和MCPM更多ZrO₂意味着当使用相同重量的粉末时，总粉末体积会更小。随着粉末体积的减少，甘油将更容易包裹粉末颗粒，从而降低粘度。有20% ZrO₂抗压强度为11.8(±1.2)MPa，固化时间为26(±2)min，对于某些椎体骨折均为可接受值，且放射不透明度良好。因此，这个配方被选为在活的有机体内研究。

从纳米spect的结果可以看出(图5)此空洞缺损的成骨细胞活性高于正常骨，并在12周的研究期间保持高水平。这表明在整个研究过程中，骨形成一直在进行。虽然在研究中很少有动物对纳米spect的结果进行统计分析，但可以观察到一个轻微的趋势，表明pCPC与其他组相比，对成骨细胞活性有积极的影响。第2、3、4周最明显。磷灰石在磷灰石作用下形成的铁镍铁矿的化学稳定性较差在活的有机体内在pH值为~7.4的条件下，因此它能比形成cpc和骨移植的磷灰石更快地被吸收[23］.当pCPC被再吸收时，钙离子和磷酸盐离子被释放出来，刺激成骨细胞[24］.这可以解释为什么pCPC动物的成骨细胞活性似乎略高。

看CT结果PMMA组没有出现意外。聚甲基丙烯酸甲酯填充缺陷，它不能被吸收，因此任何新骨形成到腔内被阻塞。另一方面，来自骨碎片的结果显示新骨形成进入腔内;然而，骨碎片没有显示骨再巩固的迹象，它与宿主骨的界限清楚。这可能是由于骨碎片的结构高度致密，其成骨诱导电位只能在接触面看到，宿主组织对移植物的渗透受到限制。

pCPC组观察到新骨形成，新骨与材料之间存在连接。这表明pCPC具有骨传导特性，这在以前的出版物中已经证实了[25，26］.pCPC的吸收和新骨的形成，即重建，在这个模型中似乎是平衡的。的ZrO₂不是再吸收;而CT结果显示，ZrO周围骨整合良好₂．之前的研究中ZrO₂与骨的接触也报告了良好的骨-种植体接触[27］.在未来的研究中，ZrO的骨整合₂将被更彻底地评估。

5.结论

含20% ZrO的预混合磷酸钙水泥₂具有良好的处理能力，良好的辐射不透明度，足够的强度和凝固时间。

研究中评估的所有材料都填充了骨腔，在每个情况下损伤部位都有很强的成骨细胞活性。然而，尽管有成骨细胞活性，PMMA阻碍骨愈合，甚至骨碎片似乎都不如pCPC有效。pCPC部分被吸收并被新骨取代。

致谢

感谢瑞典研究理事会的财政支持。作者感谢micro-CT核心设施的Csaba博士Dobó-Nagy和Miklós Kovács，以及纳米spect /CT核心设施的Krisztián Szigethy和Ildikó Horváth，感谢他们在成像方面的宝贵帮助。他们非常感谢西匈牙利地区组织银行的Lajos Csönge博士提供的骨碎片。的在活的有机体内这项工作得到了资助TÁMOP 4.2.2-08/1/KMR-0004， ÖAD 66öu5, TÉT- A4/04, Arg-17/2006, SG-STAR-CELLTHER和bolai奖学金。

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