文摘

本研究的目的是发展和评估细菌的生物学性质cellulose-hydroxyapatite (BC-HA)纳米复合材料膜骨再生。纳米复合材料是由细菌纤维素膜顺序孵化CaCl的解决方案₂其次是Na₂HPO₄。BC-HA膜在被评估在大鼠胫骨骨缺损1,4,16周。热重分析表明,矿物相的数量是40%总重量的-50%。光谱、电子显微镜、能量色散x射线分析和x射线衍射显示公元前HA晶体在纳米纤维的形成。低结晶度HA晶体呈现Ca / P摩尔比率为1.5 (calcium-deficient公顷),类似于生理骨。傅里叶转换红外光谱分析显示分配给磷酸盐和碳酸盐离子的乐队。在活的有机体内1周后测试显示没有炎症反应。4周后,观察缺陷被新的骨组织完全填满。骨再生的BC-HA膜是有效的。

1。介绍

最近,新一代的resorbable材料已经开发了柔软和/或骨组织再生的目的(1- - - - - -4),包括细菌纤维素(BC),这表明可能osteoconduction属性(5- - - - - -10]。

公元前是来自文化的革兰氏阴性细菌,Gluconacetobacter xylinus,生产高度水化膜(99%水),免费的木质素和半纤维素,并提出了一种比植物纤维素较高的分子量和结晶度。公元前膜显示出巨大的弹性,湿强度高,适合11]。凝胶状的膜形成的静态文化特点是一个3 d结构组成的一个超细纤维素纳米纤维网络(“nanocelluloses”),导致大量纳米多孔表面。提供的独特属性nanometric结构导致了许多商业产品和医疗应用,如伤口敷料和皮肤替代品(12]。公元前膜生物相容性等重要特征,bioinertness,生物降解性和选择性渗透。此外,他们也起到屏障的作用对微生物在创伤和烧伤,加速愈合过程,提供缓解疼痛,减少疤痕形成13- - - - - -15]。BC有膜引导骨再生(GBR)在骨缺损的关键和非关键尺寸,在牙周损伤,resorbable屏障膜使成纤维细胞的细胞和纤维结缔组织为骨缺损。此外,文献的结果显示,公元前膜有效促进骨形成,除了一个低成本的治疗16- - - - - -19]。方等。20.公元前]表明,HA /纳米复合材料支架开发的生物相容性,可以促进细胞增殖和分化在体外使用源自人类骨髓基质细胞(hBMSC)。其他在体外研究表明,BC-HA复合材料在组织工程应用潜力巨大或骨再生(21,22]。因此,BC-hydroxyapatite (BC-HA)复合材料也应适合使用骨再生,因为这个组合可能促进骨再生,主要用于GBR。基本上,有两种主要的途径提出了复合膜的制备。第一类包括公元前的仿生路线提交膜预处理与Ca(哦)₂或CaCl₂解决方案。后来,膜浸泡在SBF溶液,HA形成主要发生在膜表面5,6,8- - - - - -10]。第二条路线包括循环与CaCl治疗₂和磷酸钠的解决方案(7]。

本文旨在描述BC-HA复合膜的制备和表征;此外,复合膜的生物行为在被评估在大鼠胫骨骨缺损。

2。材料和方法

2.1。制备细菌Cellulose-Hydroxyapatite复合材料(BC-HA)

细菌纤维素膜从Fibrocel提供(Produtos Biotecnologicos LTDA, Ibipora,公关,巴西)。

公元前的羟磷灰石(HA)到水凝胶进行以下提出的方法论Hutchens et al。7]。公元前高度水化膜(2×2厘米²、5毫米厚度)沉浸在20%乙醇室温(25°C) 24 h。HA成立于公元前20毫升的交替孵化周期为0.05摩尔·L⁻¹CaCl₂解决方案(pH值5.8)和20毫升0.1摩尔·L⁻¹Na₂HPO₄解决方案(pH值9.1)25°C。样本干7天在50°C和由γ辐射消毒(20 kGy的)。

2.2。BC-HA复合材料的表征

干燥的样品的热重(TG)曲线记录使用TA SDT 2960 TA仪器有限公司样本加热在开放α铝锅从40°C到600°C下氮气氛(流量:70 mL分钟⁻¹)的加热速度10°C min⁻¹。x射线衍射(XRD)模式是使用Kristalloflex获得西门子衍射仪与倪过滤和铜Kα辐射4°- 70°。傅里叶变换红外(ir)光谱得到的干粉状样品光谱珀金埃尔默2000傅里叶变换红外分光光度计。颗粒混合物的准备样品和KBr重量(1:100)。32扫描积累在4厘米的决议⁻¹。扫描电子显微镜(SEM)图像和能量色散x射线能谱(EDS)分析了FEG XL 30-Philips。EDS分析后,样品被涂上一层1纳米薄层金的60年代(3 kV和9.5μ一个)。

2.3。在活的有机体内实验

十八岁男性成年大鼠(鼠属Norvevicus Holtzman)被用于这项研究。医药学院的动物实验伦理委员会Araraquara-UNESP批准所有动物实验协议。全身麻醉诱导使用肌内注射盐酸氯胺酮(0.1毫升/ 100克;三氯化氮Uniao、巴西)和甲苯噻嗪盐酸盐(0.01毫升/ 100克;拜耳、巴西)。手术进行了使用标准的无菌技术。大约10毫米的切口是在每个胫骨前区。胫骨被暴露,一个非关键尺寸骨缺损(直径2毫米)约1厘米的每个胫骨远端肢体是基于之前的研究(23]。骨缺损进行手术钻(2毫米直径;Neodent、巴西),大量的盐水灌溉下,钻到大脑皮层的厚度和暴露骨髓。治疗组、左胫骨缺陷满心的血凝块和恢复BC-HA屏障复合膜(4毫米×4毫米)。在对照组,右胫骨缺损摆满了一个血块。襟翼与4 - 0 mononylon缝合(Ethicon、强生、巴西)。术后立即所有动物收到一封口服(单剂量)120 - 300毫克/公斤的水杨酸(Bayer-Brazil)。六个动物在那里进行评估后1、4和16周。标本被减少,保留骨膜。样本固定在Bouin 72小时前进一步分析。 Decalcification of the samples was performed with a solution containing equal parts of 50% formic acid and 20% sodium citrate. Routine histological processing for light microscopy was carried out, and 6 μ米部分是沾hematoxylin-eosin (h·e·)。部分分析了在光学显微镜下观察(Jenaval-Zeiss)耦合到数码相机(徕卡DFC425)。参数分析被研究人员检查是盲矿化骨质量的两个治疗组,包括成骨细胞细胞活动,类骨质,骨细胞以及任何证据缺陷网站内的纤维组织形成,血管生成过程,炎症反应,和膜的降解。退化的结果BC-HA膜使用BioEstast 5.0统计软件进行分析。双向方差分析进行评估测量值(ImageJ软件)从膜统计学意义在时间7日30,120天。建立了统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。BC-HA纳米复合材料的表征

图1显示了TG结果BC和BC-HA复合膜有或没有γ辐射消毒。热重量分析进行了估算热稳定性和退化的BC和BC-HA复合材料。

样品显示初始平滑减肥从环境温度高达230°C(5% - -10%)由于水和溶剂损失(5,24]。

在320°C - 350°C的分解样品导致一个重要的减肥。这些事件可以与纤维素降解过程包括解聚、脱水、分解glucosyl单位紧随其后的是成立一个烧焦的残渣(5,24,25]。

公元前的碳质残留物观察纯膜,大约10%在600°C。BC-HA复合材料提出了剩余60%左右,确认HA在公元前膜沉积,这意味着HA含量约为50%。

开始温度在公元前的TG曲线显示,热稳定性下降和HA的存在。的公元前的352°C,复合材料,BC-HA和消毒BC-HA 332°C和333°C,分别。这种行为可能会打破氢键和BC结晶度降低;因此,降低结晶度导致下降值(26]。根据Gao et al。26],HA晶体并没有显示出足够的屏障属性推迟公元前热量和气体扩散,因为HA纳米粒子没有覆盖整个表面纳米纤维(公元前26]。此外,伽马辐射没有促进BC-HA复合材料的特征温度的变化。这个结果允许我们推断伽马辐射是一个适当的治疗BC-HA复合杀菌。

图2显示了x射线衍射模式获得BC膜和BC-HA复合。典型的BC两样本观察晶体阶段。特征峰BC-HA晶体被确定为JCPDF 46 - 0905。衍射峰在2θ= 15°和22.5°被分配到的纤维素α和我β阶段(100_1α,110年_1β和010年_1β飞机在15°和110年_1α和200年_1β22.5°)[27]。HA晶体的主要特征衍射峰阶段观察到2θ= 29°,32°,40°,51°(图2(b))。XRD模式实际上是骨磷灰石的XRD模式非常相似,表明低结晶度(28]。根据Hutchens et al。7),减少纤维素的强度峰值相比,模式从公元前纯膜是由于获得HA沉积在BC纺锤。残留在热重量分析观察到的温度高于纤维素分解平均为50%,必须与HA重量平均水平。

公元前的傅立叶变换红外光谱干膜和复合膜BC-HA如图3。特征振动频率分配到纤维素被观察到在3500 - 3200厘米⁻¹(哦拉伸),2908厘米⁻¹(CH拉伸CH₂和CH₃组),2700厘米⁻¹(CH₂),1645厘米⁻¹(水哦弯曲),1435厘米⁻¹(CH₂对称弯曲),1370厘米⁻¹(CH弯曲),1160厘米⁻¹(反对称桥C-O-C拉伸),1111厘米⁻¹,1056厘米⁻¹(涉及切断的骨架振动拉伸)27]。乐队在该地区在3500 - 3200厘米⁻¹分配给纤维素羟基,观察到的减少相对强度复合与公元前纯膜相比。这种强度的降低表明HA晶体的存在影响了纤维素羟基。而且带的红移观察到分配到分子内氢键(~ 3500厘米⁻¹)确认哦组和磷灰石之间的强相互作用。公元前化学互动HA和稳定复合,这样就可以维持骨替换所需的机械完整性。红外波段观察BC-HA复合在1093,1020,962,570 - 600厘米⁻¹是由振动模式的阿宝吗₄³⁻离子(5- - - - - -8]。962厘米⁻¹峰值出现的肩膀更强的乐队在1020厘米⁻¹峰,疲软的乐队在1418和838厘米⁻¹(插入图片)对应的拉伸模式有限公司₃²⁻离子,说明吸收有限公司₂从空气中。阿宝的存在₄³⁻紧身上衣乐队在602厘米⁻¹和567厘米⁻¹(插图图)强烈建议HA的前兆阶段(OCP [29日]。因此,红外光谱分析显示carbonate-containing磷灰石(鱼骨磷灰石)公元前沉积在纳米纤维。

公元前的SEM图像和BC-HA复合材料如图4。图4 (c)显示了一个典型的扫描电镜图像公元前的干膜。一个超细网络结构形成的连续纳米纤维大约10 - 50 nm宽(“nanocelluloses”)可以观察到。这个nanometric结构导致大表面积粒子稳定(30.]。数据4(一)和4 (b)显示干BC-HA纳米复合材料的扫描电镜图像。HA纳米晶体沉淀在公元前纺锤的团聚体微晶的人物4(一);定期分布式毛孔被观察到膜表面。典型的HA晶体中的球状和观察杆形式,类似于HA晶体也被观察到的其他作者(31日,32]。这些晶体在纳米纤维横向生长。根据EDS分析,Ca / P BC-HA复合材料的摩尔比率是1.50建议calcium-deficient公顷(CDHA),这是一个生物磷灰石相类似。低结晶度的宽宏大量是一致的哈图所示的衍射峰2(b)。此外,该Ca / P摩尔比率有利于更快的解散Ca^{2 +}和阿宝₄³⁻离子。低Ca / P摩尔比率值导致更高的解散^{2 +}离子,与当地的pH值在生物材料/组织接口,促进理想的pH值碱性磷酸酶活性。因此,成骨细胞增殖和骨基质的合成可能增加。

钙磷酸盐有不同的溶解度和溶解的比较范围是:(OCP (Ca / P = 1.33)≫ß-tricalcium磷酸(ß-TCP) (Ca / P = 1.48) > calcium-deficient公顷(CDHA) (Ca / P = 1.5)≫公顷(Ca / P = 1.67)。这种差异繁殖磷酸钙组成和结晶性质的影响,由于化学计量HA是不溶于体液(33,34]。

3.2。组织学分析

数据5(一个)和5 (b)显示图像获得的控制和治疗组1周后,分别。BC-HA纳米复合材料膜、成骨细胞、骨样的,新形成的骨,与间充质细胞和髓空间中观察到的缺陷。然而,在对照组,观察纤维组织形成的缺陷。适度的炎症反应可能是观察两组在这一时期。在4周,新形成的骨组织包含髓空间与间充质细胞,骨细胞,和血管观察对照组;然而,新形成的骨不结合胫骨骨如图5 (c)。图5 (d)显示,4周后,观察骨缺陷是由新形成的骨与骨细胞,血管,和骨基质矿化的过程;BC-HA膜被观察到在这个时期。炎症反应并没有发现在这两个组在4周。16周后,观察BC-HA膜。骨缺损完全成熟的骨修复的两组数据5 (e)和5 (f))。

BC-HA纳米复合材料膜生物相容性和4周后没有促进炎症反应。文献显示,事实上,公元前衍生品仅用于软组织显示没有炎症或异物反应15,35]。必须提到HA-plant纤维素衍生品在大鼠骨缺陷显示炎症和异物反应。在另一项实验中,植物纤维素海绵由结缔组织和没有促进完整骨缺损成骨(36]。

取得了可喜的成果使用BC在过去牙周膜缺陷作为低成本resorbable障碍(16,17]。临床结果被观察到类似获得贵e-PTFE壁垒过去牙周缺损有效促进新骨形成(16]。研究已经证明,没有使用相关的额外优势相比其他异质成形的材料单独使用BC膜(18,19]。

在目前的研究中,没有观察到膜接触。多斯安若斯等人也观察到类似的结果。(16和Simonpietri et al。19]。然而,巴蒂斯塔et al。18)观察到膜接触使用BC膜引导骨再生率为15.38%前10天;但是,没有脓肿或急性炎症反应可以观察到。

骨缺损治疗BC-HA纳米复合材料薄膜缺陷展示由新成立的骨组织组织和合并胫骨骨在4周的时间。在对照组,观察新骨组织形成部分合并到胫骨骨在同一时间。16周后,可以观察到两组之间没有差异。骨缺损完全由成熟骨两组。

很少有研究报道的文献评估BC-HA复合材料的生物属性在体外(20.- - - - - -22]。此外,没有报告文学研究BC-HA复合材料在活的有机体内研究。然而,有一些研究在文献中评估BC膜的生物属性在活的有机体内(13- - - - - -19,35,37,38公元前)的研究表明,膜的生物材料在组织再生中的应用潜力由于他们伟大的生物学性质。因此,这项研究的结果是开创性的,因为它们表明BC-HA兼容检测结构的纳米复合材料,包括软硬组织。

方差分析表明,有显著的统计差异的退化BC-HA膜之间7和120天。此外,膜的降解效果取决于周期分析。膜的降解的平均值是显示在表1。梅洛et al。37公元前)观察到类似的结果的再吸收膜作为硬脑膜替代品的狗,和膜厚度显著减少30至270天。

生物材料重吸收与几个因素如粒度、孔隙度、化学结构(组成和结晶度)和体液的酸碱度34]。粒子nanometric尺寸重吸收速度比测微的粒子,因为破骨细胞或巨噬细胞在生物材料表面更容易采取行动。生物材料结晶度也再吸收速率变化,因为高度结晶结构抗再吸收比非晶态或半晶质结构。此外,化学成分也很重要。杂质如碳酸钙促进更快的重吸收。因此,BC-HA纳米复合材料膜的化学结构,公元前HA粒子,纳米纤维尺寸表明支持这个新生物材料的再吸收。

4所示。结论

BC-HA复合材料提出了HA纳米晶体结晶度低的膜与Ca / P摩尔率相似的生理骨头。BC-HA膜是有效的骨再生在大鼠胫骨骨缺损,由于膜加速新骨形成缺陷网站;此外,膜的再吸收缓慢,表明该复合所需时间是完全吸收。

确认

金融支持巴西机构FAPESP(项目必须占州政府没有。08-58776-6),CNPq承认。作者希望感谢路易斯·安东尼奥Potenza先生的技术支持。