乳腺癌亚型中淋巴结状态与雄激素受体、miR-185、miR-205和miR-21表达水平的关系

摘要

乳腺癌是女性中最常见的癌症。乳腺癌治疗的困难与疾病早期发生转移有关，导致其进一步发展。近年来的研究表明，雄激素受体(AR)和microrna表达的变化与乳腺癌变，特别是转移瘤的形成有关。因此，为了识别新的转移性标志物，我们评估了AR的表达水平;miR-185和miR-205，均被证实靶向AR;在乳腺癌样本中，miR-21的转录受AR调控( ）。在这里，我们表明乳腺癌的分子亚型在Ar和Ar相关的微大罗斯的表达谱不同。此外，AR和这些微小RNA的表达可以取决于PR，ER和HER2受体的表达。我们的研究结果表明，使用Ar和microRNA作为标记的可能性取决于肿瘤亚型：AR表达的降低可以是乳腺癌患者患者淋巴结转移的标志物，以及MIR的扰动-205，miR-185和miR-21表达可以是患有腔B Her2阳性亚型的患者的标志物。与非组织案例相比，这种类型的乳腺癌中的转移患者的转移含量较高，肿瘤组织中的miR-185和miR-21的较低水平。miR-185水平的降低也与腔B Her2阴性乳腺癌中的淋巴结转移相关。因此，Ar，miR-185，miR-205和miR-21的表达水平可以用作标记，以预测癌症扩散到乳腺癌的腔B-和Her2阳性亚型中的淋巴结。

1.介绍

乳腺癌（BC）是女性中最常见的癌症。根据国际癌症研究机构（IARC）估计，2018年在2018年检测到约200万个癌症类型[1］．

XX世纪结束标志着BC治疗的重大进步。然后，基于2000年提出的分子分类开始治疗方法。该分类根据雌激素受体（ER），孕酮受体（PR），HER2 / Neu受体和KI67的表达水平将BC分为亚型。2］．但是，尽管在疾病的诊断与治疗的进展，仍存在于公元前治疗显著的困难，在很大程度上是由于这样的事实，近30％的诊断患有早期乳腺癌患者将发展转移性疾病[3.］．淋巴结通常是转移的第一个位置。因此，为了成功地打击这种疾病，早期检测转移绝对必要。

许多研究表明，微大罗莎可以在癌症发展和进展中发挥重要作用。MicroRNA是短的非编码RNA（长度为19-25个核苷酸），其通过与mRNA-靶的相互作用来调节基因表达。MicroRNA可以进行肿瘤抑制和致癌功能，并影响与肿瘤发育相关的各种方法[4.-6.］．最近，许多出版物一直专注于雄激素受体（AR）的作用，BC和发展[7.-9.］．从这些研究，雄激素受体表达成为一个新的预后因素。

在这项研究中，我们研究了AR，MiR-185，MiR-205的表达水平变化之间的关系，其中AR确认为靶标，miR-21（其转录受Ar）和肿瘤亚型（和它的主要特征如T阶段，n阶段和ER，PR和HER2的表达水平）。

2。材料和方法

2.1。组织样品和乳腺肿瘤亚型的定义

在2017年新西伯利亚市预算医疗保健机构“市政临床医院”（Pulitipal Condical Hospital＃1）的手术期间获得了所有样品（BC组织和未转化的邻接组织样本）（）。将组织样品放置在RNAlater中™稳定化溶液（Invitrogen公司™，USA），并保持在-20℃直到进行实验。所有试验程序都经分子生物学和生物物理学研究所的生物伦理委员会批准。被审查的免疫组化检测结果的病历和报告获得临床病理信息。确定以下变量：T分期，N阶段，ER，PR，HER2的IHC得分，和Ki-67的表达（表1）。乳腺癌亚型根据圣加仑专家共识进行分类，如下[10.: luminal A (ER+和/或PR+， HER2−和），管状B HER2阴性（ER +和/或PR +，HER2-，和）luminal B HER2阳性(ER+和/或PR+， HER2+)， HER2阳性(ER -， PR -和HER2+)，三阴性(ER -， PR -和HER2-)。


特征	鲁米那( ）	Luminal B Her2-Digal（）	Luminal B Her2阳性（）	HER2阳性（）	三阴( ）

年龄(平均及范围，年)	61（41-78）	52（27-83）	55 (39 - 70)	52（42-61）	52（40-74）
T舞台
T1	9.	9.	7.	5.	7.
T2	15.	10.	12.	7.	4.
T3	-	-	-	-	-
T4	-	1	1	1	1
n阶段
N0	16.	11.	8.	7.	9.
N1	6.	6.	9.	2	1
N2	-	3.	1	3.	2
N3	2	-	2	1	-
呃得分
0-2	-	3.	1	-	-
3-5	2	5.	3.	-	-
6-8	22.	12.	16.	-	-
PR得分
0-2	1	2	4.	-	-
3-5	9.	9.	6.	-	-
6-8	14.	9.	10.	-	-
HER2得分
1	-	-	13.	5.	-
2-3	-	-	7.	8.	-

除非另有说明，否则将呈现为患者数量。ER和PR使用ALLRED进行分级[11.]得分方法。

2.2。RNA分离，cDNA合成和实时PCR

RNA根据制造商的方案使用TRIzol™试剂（Invitrogen™）分离。糖原（Thermo Scientific的™，USA）被用作RNA共沉淀。RNA完整性通过运行琼脂糖凝胶电泳检查。RNA concentration and purity were assessed using an Agilent-8453 spectrophotometer (Agilent Technologies, USA) at wavelengths of 260 and 280 nm. Reverse transcription was performed by using the RT-M-MuLV-RH kit (BiolabMix, Russia) according to the manufacturer’s protocol. RNA at concentration of 0.8 μG用于逆转转录反应。通过添加Biomaster HS-QPCR Sybr蓝（Biolabmix）反应混合物来测量AR mRNA的实时PCR水平，然后应用CFX96 TM检测系统（Bio-Rad Laboratories，USA）来测量Ar mRNA的水平。SYMPK和polr2a.作为内参基因。本研究使用了以下特异性引物:AR.5. -CCTGGCTTCCGCAACTTACAC-3 那5. -ggacttgtgcatgcggtactca-3 ;SYMPK5. -GCTGGAGAAGAAAGAGGTG-3 那5. -ACAGGTTGGTGGCTTTGATG-3 ;和polr2a.5. -gcatggcagaggagtttcggct-3 那5. -ATTTCCCCGGGATGCGCAATGG-3 。

各引物的最佳浓度为300 nM。

每个PCR反应通过使用0.3进行 μl cDNA，在最后卷20μ升，在下列条件下[12.]: initial denaturation for 5 min at 95°C, followed by 40 cycles of denaturation for 15 s at 95°C, annealing for 20 s at 62°C, elongation, and fluorescence data processing for 30 s at 72°C. Melting profiles were used to assess PCR specificity. In each experiment, one plate contained samples of analyzed cDNA with a primer for AR gene and the reference genes (3 replicates per sample). The relative gene expression level was assessed based on threshold cycle (Ct) values considering PCR efficacy (E) for both the analyzed and reference genes.

2.3。微小RNA分离，微小RNA反转录和实时PCR确定的MicroRNA水平

为了分离miRNA，将50mg的组织样品与500组合 μl胍基溶解缓冲液(4 M异硫氰酸胍、25 mM柠檬酸钠、0.3%肌糖基、0.1% 2-巯基乙醇和25 mM ch3cooa) [12.］．然后，将溶液混合并在65℃下孵育10分钟。将样品以10000g离心2分钟。将糖原溶液加入到得到的上清液中，将上清液与等体积的异丙醇，混合，在室温下温育5分钟，并在10000g以10000g离心10分钟。然后，倾析上清液，用500℃洗涤沉淀物 μL为70％ETOH和300 μL丙酮，干燥，溶解在200μL mq-h2o。

使用实时逆转录-PCR测量miR-205，miR-185和miR-21的相对表达水平。使用茎环 - 引物进行逆转录反应[13.]和RT-M-MuLV-RH试剂盒(BiolabMix，俄罗斯)，根据制造商的协议。根据生产商的方案，使用TaqMan探针和PCR试剂盒，结合BioMaster UDG HS-qPCR (2x)荧光探针(BiolabMix，俄罗斯)进行实时PCR。采用CFX96™检测系统(Bio-Rad Laboratories, USA)检测PCR产物。用小核RNA U44和U48对数据进行归一化处理。

用于MicroRNA的逆转录反应的引物：miR-205 5 -GTC gta TCC agt gca GGG TCC gag gta TTC gca CTG gat acg acc aga CTC c-3 那mir-185 5 -GTC gta TCC agt gca GGG TCC gag gta TTC gca CTG gat acg act cag gaa c-3 那mir-21 5 -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACT CAA CAT C-3 那U44 5. -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA GTC AGT T-3 那和U48 5 -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AGA CGGTСAG-3 。

引物序列基于从miRBase数据库中获取的成熟microrna序列。3 -引物用于逆转录反应的结束时，加入6-8个核苷酸的微小RNA-特定序列。正向引物是在3至14-16核苷酸互补 -逆转录产品的末端。

在每个实验中，分析的cDNA与靶和参考SNRNA特异的引物一起置于相同的96孔板（每个样品一式三份）中。考虑分析和参考基因的PCR功效（E），基于阈值循环（CT）值来评估相对表达水平。使用以下特异性引物：miR-205（前进）5 -gccgctccttcattcacc-3 那(探针)5 -（r6g）-tcgcactggatacgaccagactcc-（bhq1）-3 ;的miR-185（正向）5 -GCCGCTGGAGAGAAAGGCA-3 那(探针)5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGACTCAGGAAC - (BHQ1) 3 ;miR-21的（正向）5 -GCCGCTAGCTTATCAGACT-3 那(探针)5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGACTCAACATC - (BHQ1) 3 ;U44(向前)5 -gccgcttaattagctct-3 那(探针)5 -（R6G）-TCGCACTGGATACGACAGTCAGTT-（BHQ1）-3 ;和U48（前进）5 -ccctgagtgtgtcgctgatg-3 那(探针)5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGAGACGGTСAG - (BHQ1) 3 。在合成的cDNA靶向茎环区类似类型的反向引物的结果如下：5 -AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3 。

3.统计分析

数据表示为中值。组间比较采用非参数曼 - 惠特尼比较测试。一种被视为统计学显著。

结果

4.1。的miR-205的miR-185，miR-21的，和AR的表达水平的协会乳腺癌亚型

首先，我们根据乳腺癌亚型检测AR和microrna的表达。我们选择miR-205、miR-21和miR-185进行分析，因为之前有报道称AR是miR-205和miR-185的靶点[14.那15.虽然MiR-21的转录受AR [16.］．通过RT-PCR在89对肿瘤和健康组织中测定AR mRNA和上述微小RORNA的相对水平（表2）。我们观察到在管状B HER2阳性和管腔B型HER2阴性亚型中的miR-205和miR-185水平显著下降。的miR-205的表达也下降在BC三阴性5倍。miR-21的表达在所有肿瘤亚型增加。AR的mRNA的水平降低在三阴亚型8倍和在HER2阳性亚型3倍。


子类型	的患者数量	相对水平miRNA或mRNA和的价值
子类型	的患者数量	MIR-205.	价值	mir - 185	价值	miR-21	价值	AR.	价值

卢米纳A.	24.	0.25 (0.09 - -2.14)	0.070	0.55（0.12-2.03）	0.136	5.14（0.79-35.15）	<0.001	0.85（0.35-2.35）	0.295
腔的B (her2阴性)	20.	0.21 (0.06 - -2.91)	0.041	0.25（0.06-1.54）	0.005.	3.53 (0.87 - -37.83)	<0.001	0.91（0.44-2.35）	0.438
腔的B (her2阳性)	20.	0.25（0.03-1.56）	0.003	0.28（0.08-3.16）	0.035	13.98 (0.39 - -64.68)	0.002	0.88（0.29-2.40）	0.381
HER2阳性	13.	0.52（0.11-1.39）	0.115	0.48 (0.11 - -1.60)	0.115	6.68 (0.72 - -20.50)	0.018	0.33 (0.04 - -0.74)	0.001
三阴性	12.	0.19（0.03-0.94）	0.001	0.41（0.09-1.42）	0.104	5.02（0.81-21.54）	0.027	0.12 (0.01 - -0.31)	<0.001

乳腺肿瘤中microRNA或mRNA水平相对于配对正常(毗邻)组织的中位数和范围。

4．2．miR-205、miR-185、miR-21和AR的表达与肿瘤的临床病理特征的关系

接下来，我们评估了microrna或AR的表达与肿瘤临床病理特征的关系(表)3.）。我们发现MiR-205的水平与腔B HER2阳性BC型中的淋巴结转移相关。与患者的BC组织相比，淋巴结转移患者的BC组织的BC组织的水平较高。在腔B HER2阴性和腔B HER2阳性BC型淋巴结转移患者的组织中，MIR-185水平降低。在Luminal B Her2阳性乳腺癌中，MiR-21的水平在转移患者样品中也降低。AR mRNA的降低水平与HER2阳性BC亚型中的淋巴结转移相关，均为ER阴性，PR阴性和ER阳性，PR阳性。此外，倾向于降低患者在ER阴性，PR阴性亚型中具有较高KI-67的患者的BC组织的AR mRNA水平。


特征			相对水平miRNA或mRNA和的价值
			MIR-205.	价值	mir - 185	价值	miR-21	价值	AR.	价值

卢米纳A.

T舞台	T1.	9.	0.96	0.132	0.41	0.895	10.02	0.433	0.92	0.332
	T2.	15.	0.25		0.79		4.58		0.84

n阶段	N0.	16.	0.45	0.867	0.55	0.632	7.10	0.285	0.82	0.824
	N1-N3	8.	0.22		0.68		1.98		1.16

PR得分	0-5	10.	0.12	0.006	0.41	0.365	2.92	0.423	0.69	0.151
	6-8	14.	0.91		0.99		7.51		0.86

呃得分	0-5	2	0.37	0.412	1.30.	0.208	14.61	0.952	0.84	0.960
	6-8	22.	0.34		0.32		5.14		0.86

Ki-67的指数（％）	＜10	10.	0.22	0.594	0.18	0.082	6.68	0.689	0.81	0.765
	≥10	14.	0.34		0.99		3.60		0.85

腔的B (her2阴性)

T舞台	T1.	9.	0.46	0.082	0.22	0.138	4.17	0.832	1.17	0.399
	T2-T4.	11.	0.17		0.68		7.43		0.78

n阶段	N0.	11.	0.13	0.100	0.91	0.045	7.14	0.307	0.94	0.862
	N1-N2	9.	0.35		0.13		2.89		0.97

PR得分	0-5	11.	0.17	0.022	0.90	0.033	7.28	0.637	0.74	0.010
	6-8	9.	1.89		0.13		4.17		1.57

呃得分	0-5	8.	0.13	0.587	0.47	0.459	9.01	0.551	0.61	0.008
	6-8	12.	0.23		0.14		5.01		1.47

Ki-67的指数（％）	＜20	10.	0.14	0.958	0.19	0.452	7.14	0.916	1.41	0.810
	≥20	10.	0.17		0.88		4.17		0.89

腔的B (her2阳性)

T舞台	T1.	7.	0.32	0.725	1.58	0.040	20.33	0.248	0.88	0.895
	T2-T4.	13.	0.18		0.20		4.05		0.89

n阶段	N0.	8.	0.08	0.008	1.03	0.036	36.07	0.045	1.17	0.036
	N1-N3	12.	0.35		0.22		5．18		0.59

PR得分	0-5	10.	0.12	0.043	1.92	0.031	23.82	0.431	0.80	0.930
	6-8	10.	0.45		0.23		12.05		0.88

呃得分	0-5	4.	0.16	0.585	1.50	0.845	11.79	0.585	0.76	0.764
	6-8	16.	0.22		0.34		13.38		0.78

HER2得分	1	13.	0.35	0.116	0.31	0.018	3.05	0.006	0.88	0.693
	2-3	7.	0.15		2.50		46.55		0.88

Ki-67的指数（％）	＜20	9.	0.18	0.927	0.24	0.262	9.29	0.525	0.80	0.653
	≥20	11.	0.27		0.61		17.81		0.86

HER2阳性

T舞台	T1.	5.	0.15	0.156	0.73	0.777	3.85	0.366	0.33	0.915
	T2-T4.	8.	1.01		0.21		10.17		0.26

n阶段	N0.	7.	1.07	0.897	0.43	0.713	9.28	0.270	0.39	0.022
	N1-N3	6.	0.39		0.20		5.22		0.10

HER2得分	1	5.	0.18	0.167	0.27	0.167	5.53	0.915	0.12	0.362
	2-3	8.	1.17		1.09		9.28		0.34

Ki-67的指数（％）	＜40	6.	1.17	0.235	0.57	0.523	6.68	0.835	0.43	0.095
	≥40	7.	0.52		0.29		7.20		0.08

三阴性

T舞台	T1.	7.	0.05	0.136	0.41	0.749	12.79	0.391	0.13	0.056
	T2-T4.	5.	0.27		0.49		4.59		0.03

n阶段	N0.	9.	0.13	0.171	0.24	0.362	5.02	0.868	0.13	0.820
	N1-N3	3.	0.49		0.95		4.30		0.13

Ki-67的指数（％）	<70	4.	0.16	0.915	0.81	0.110	9.91	0.156	0.15	0.110
	≥70	8.	0.17		0.20		2.62		0.05

在乳房肿瘤与正常配对的（邻接的）组织的miRNA或mRNA水平的相对变化值。

我们还评估ER，PR和HER2的microRNA和AR的mRNA水平和表达之间的关系。我们发现，对于所有管腔BC亚型中，所述miR-205水平显著越高与PR表达的比具有0-5得分的表达值的高值（6-8根据IHC测定法评分）。与此相反，的miR-185的表达水平与PR表达的管腔乙HER2阴性和BC的管状B HER2阳性亚型的高值低。此外，我们检测到ER和PR的表达和AR的mRNA水平之间的关联在管状B HER2阴性亚型：AR的mRNA的水平在样品具有较高的ER和PR的表达增加。的miR-185和miR-21的表达水平与HER2的表达水平相关联。因此，在管状B亚型，是当HER2表达的评价具有2-3得分增加了这些微小RNA的水平。为ER阴性，PR阴性HER2阳性BC亚型中检测到类似的趋势，但在表达差异不可靠显著。

5.讨论

在人类恶性肿瘤的诊断和治疗方面已经取得了重大进展，但癌症仍然是世界范围内的主要死亡原因之一。乳腺癌约占女性癌症诊断的23% [17.］．这种状况的事实，大约有三分之一的妇女在不列颠哥伦比亚省的早期阶段转移复杂，它会导致疾病的进一步复发和进展[18.］．BC转移的早期检测是监测BC进展和预测疾病的结果非常重要。因此，识别标识，可以指示转移的存在仍然对这种癌症的斗争作为优先事项。小分子RNA都表现出极大的潜力作为一类新的癌症生物标志物的。然而，在乳腺癌的微小RNA作用的最新研究，而不管肿瘤亚型进行。

雄激素受体是治疗前列腺癌的重要治疗靶标，但最近的研究表明它也可以在BC中具有治疗性和预后值[19.］．通常，AR的表达与ER阳性肿瘤有利的预后相关，而AR在ER阴性中的作用的研究结果是有争议的。各种作者报道了乳腺癌三重阴性亚型的AR阳性之间的关系，以及淋巴结转移的高或低频频率[9;20]，高或低增殖活性[7;9]，肿瘤大小，生存率低[20.］．因此，AR可以清楚地在BC既发挥肿瘤抑制和致癌作用。

众所周知，AR在几乎所有er阳性肿瘤中都有表达;而在er阴性肿瘤中，AR表达主要见于HER2+分子亚型肿瘤[21.］．我们研究的结果与先前获得的数据一致。我们表明AR在腔亚型的高水平下表达，但受体表达在三重阴性亚型中降低了8倍，并且在HER2阳性亚型中的3倍。同时，在腔B肿瘤中降低了Ar调节MicroRNA（miR-205和miR-185）的水平。miR-205的水平在三负亚型中也减少，其对应于先前获得的数据[22.］．

然而，实际的任务是寻找与肿瘤临床病理特征相关的标志物。在我们的研究中，我们发现AR表达降低表明her2阳性肿瘤亚型的淋巴结转移。与其他亚型BC无淋巴结转移患者的肿瘤组织相比，转移灶患者肿瘤组织中AR的表达无变化。此外，管腔B HER-2阳性亚型中，N1-N3期患者组织中miR-205水平明显高于N0期患者组织。提示该microRNA可能在抑制该肿瘤亚型AR表达的机制中发挥作用。

微小RNA-185是在乳腺癌的充分研究的肿瘤抑制;其中的水平降低已被证明是与临床阶段和转移至淋巴结[相关联23.］．在这项研究中，在淋巴结转移患者中也观察到这种微小RNA水平的降低，但仅在腔B HER2阴性和腔B HER2阳性BC亚型中。该MicroRNA的降低水平也与腔B HER2阳性亚型中的T2-T4阶段相关。

microRNA -21是一种致癌microRNA，其启动子中有AR结合位点[16.］．的miR-21的表达通过AR激活在人类前列腺癌细胞，但在乳腺癌细胞中的雄激素的影响下降低[24.］．在我们的研究中，miR-21的水平在所有亚型的BC中均升高，但在腔内B her2阳性亚型的BC中，与无淋巴结转移的BC患者相比，有淋巴结转移的患者组织中显著降低。在其他亚型中也观察到类似的趋势。

此外，我们发现，AR表达依赖于在管状B HER2阴性亚型PR和ER表达水平：在AR mRNA水平在患者BC组织增加与这些受体的高表达的患者与BC组织相比PR和ER的低表达。的miR-205的水平还取决于PR表达水平。的miR-205的表达的患者与PR表达IHC分数6-8比的患者在所有的管腔亚型一个PR表达IHC分数0-5肿瘤组织肿瘤组织较高。与此相反，在管状B亚型，所述miR-185表达水平的患者谁具有高PR表达值BC组织下。按照TargetScan数据库，PR是的miR-185的潜在目标。因此，在与miR-185水平的降低可能是导致管腔亚型PR表达的干扰的机制之一。

miR-185和miR-21的表达水平与Her2受体表达有关，在患有腔B亚型中具有较高HER2表达的患者的肿瘤组织中显着增加。患者患有类似的趋势，逆阴性HER2阳性BC患者。

6.结论

因此，我们的研究表明，乳腺癌的分子亚型在AR及其相关的miR-205、miR-185和miR-21的表达谱上存在差异。此外，AR和这些microrna的表达可能依赖于其他对乳腺癌控制重要的受体——pr、ER和HER2的表达。使用AR和miRNAs作为标记物检测淋巴结转移的可能性也取决于肿瘤亚型- AR表达水平的降低可以作为her2阳性亚型的标记物，miR-205表达水平升高，miR-185和miR-21表达水平降低(与无转移病例相比)可能是腔内B型her2阳性乳腺癌转移的标志。miRNA-185水平的降低也与腔内B型her2阴性乳腺癌的淋巴结转移有关。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

伦理批准

所有程序均符合机构研究委员会的道德标准，并与1964年赫尔辛基宣言及其后修订或类似的道德标准。我们从所有患者的书面同意。

利益冲突

作者宣称没有在财务或其他任何领域的利益冲突。

致谢

我们感谢联邦国家预算科学机构分子生物学和生物物理学研究所(蛋白质组学分析)中心“联邦基础和转化医学研究中心”(IMBB FRC FTM)允许使用设备。这项研究得到了俄罗斯科学基金会的支持(批准号19-15-00319)。

参考

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国际乳腺癌杂志