文摘
目的。进行探索性研究识别机制,区分鲁米那(BT474和MCF-7)和三阴(mda - mb - 231和mda - mb - 468)乳腺癌细胞系(BCa)可能提供新的治疗靶点基于能源利用上的差异。方法。细胞培养在媒体包含[U -13(U - C]葡萄糖或13谷氨酰胺48小时。的媒体和细胞提取物进行了分析1H和13C NMR光谱。结果。MCF-7细胞消耗葡萄糖,产生乳酸,展示最伟大华宝effect-associated能源利用率。BT474细胞最高三羧酸循环(TCA)活动。大部分的能源利用模式MCF-7细胞更类似于mda - mb - 468细胞,而模式BT474细胞更类似于mda - mb - 231细胞。腔的细胞系,相比TNBC细胞系消耗更多的谷氨酰胺和更少的葡萄糖。BT474和mda - mb - 468细胞中产生大量13C-glycine从媒体(U -13C]葡萄糖融入谷胱甘肽,指示新创合成。结论。代谢组学利用稳定同位素解决13C基板提供了机械的能源利用的信息,很难解释1H数据。总的来说,细胞系有不同的激素受体状态有不同的能量利用率的要求,即使他们是由同一临床BCa亚型分类;优化治疗策略和这些差异提供了线索。
1。介绍
三阴乳腺癌(TNBC)被认为是一个最激进的亚型BCa根据其临床特点,包括增加增殖率、高转移潜能,和更短的生存结果(整体和无复发)1- - - - - -5]。它占所有BCa确诊病例的15 - 20% (6- - - - - -8),在非洲裔美国人和亚洲女性患病率增加(-65% ~ 30%)与其他种族相比9- - - - - -16]。TNBC缺乏定义的表达式的常见BCa标记,雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和表皮生长因子受体2 / HER2 / neu (HER2) [17),其他类型的BCa和分类作为目标特定的治疗;因此,靶向治疗的发展对TNBC已经严重阻碍。创新方法,识别相关的目标可能会导致新疗法能增强的效果目前的标准治疗手术,化疗,或者radiation-dependent干预措施(18- - - - - -20.]。
现在癌症的建立标志,异常的能量代谢提供了丰富的信息对肿瘤细胞发起、进步,传播(21,22]。例如,糖酵解测量活动是用来识别关键代谢扰动,显著影响肿瘤细胞生长和生存能力,通过比较改变葡萄糖摄取和乳酸生产、以及其他病原反应酶参与内源性通路。另一个重要的必需氨基酸,转移注意力从葡萄糖作为主要能源来源在过去的几年中是谷氨酰胺(23和glutaminolysis的过程24),(即可以提供重要的能源需求。NADPH)迅速增殖的细胞(25]。代谢组学方法利用稳定同位素标记化合物,如13比较或13C-glutamine,可以用来审问癌细胞赖以生存的能量通量,避免主机程序破坏。
在一项研究26),我们比较这些激素受体阳性的代谢和炎症反应(腔)和TNBC细胞系与广泛使用的化疗治疗后紫杉醇(紫杉醇®)。我们显示两种细胞之间的区别分类由同一亚型(BT474和MCF-7以及mda - mb - 231和mda - mb - 468)和两个亚型之间的细胞模型(鲁米那对TNBC) (26]。根据我们的研究,我们觉得代谢差异的进一步研究是必要的。当前的研究结果提出了帮助更好地理解这两种细胞的代谢差异模型不同的激素受体状态BCa亚型。这可能确定新的TNBC目标,揭示潜在点调制,最终提高能力设计疗法,扰乱他们的主要能源利用模式(27]。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和治疗
鲁米那BCa细胞株(BT474和MCF-7)和TNBC细胞系(mda - mb - 231和mda - mb - 468)是从写明ATCC买来的,在媒体DMEM培养(Gibco /生命技术)与10%的边后卫和1%的抗生素/抗真菌的补充。(即所有写明ATCC细胞系进行验证测试。,for mycoplasma negativity) during the accessioning process, which is described in the online ATCC brochure Maintaining High Standards in Cell Culture (http://www.atcc.org/)。细胞被维护在文化,在湿润条件下孵化有限公司37°C的5%2。
(U -13C]葡萄糖购买从剑桥同位素实验室(美国,MA)和[U -13C]谷氨酰胺是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。每个单元格线镀在10厘米菜肴DMEM增长媒体包含4.5 g / L谷氨酰胺葡萄糖+ 2毫米(Gibco) 24小时。媒体被与无菌细胞被洗了三次1 x PBS和治疗48小时在常规高葡萄糖DMEM DMEM (U -(葡萄糖)补充13C]葡萄糖或DMEM(谷氨酰胺)与(U -补充13谷氨酰胺。孵化后,媒体能整除的收集和储存在−1毫升80°C。剩余的细胞与冰冷的盘子洗了三次1 x PBS和提取使用修改后的Folch方法(28,29日]。简单,细胞被灭的50:50冰冷的乙腈:水、刮掉盘子,和收集到15毫升含有氧化锆珠管。冷氯仿添加,每个管大力涡在多管的vortexer三30秒脉冲。管在3700 rpm 60分钟离心机在4°C,和水分数被转移到cryotubes,而有机分数被收集到的玻璃小瓶。剩余的蛋白质层和残留水和脂质层被转移到Lo-Bind微型离心机管,冷氯仿:甲醇(2:1)补充道,和管快速涡流,然后在15000转离心20分钟在4°C。剩余的水和脂质分数被转移到集合管上面所述,和蛋白质颗粒为20分钟干Speedvac(没有热量),体重。所有样本存储在−80°C,除了水分数是立即冻干干燥,然后储存在−80°C到核磁共振分析做准备。每个条件进行了一式三份。
2.2。核磁共振样品制备和数据采集
媒体样本从−80°C和解冻在4°C。样本涡短暂离心18000 rcf和15分钟4°C, 200μL整除被微型离心机管。接下来,1毫升的冰冷的甲醇:氯仿萃取溶剂(3:1)添加和样本涡30秒和离心条件上面列出。上层清液被转移到新的微型离心机管和干一夜之间在温柔的N2。样品在700年重组μL氧化氘(D2O,奥尔德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)解决方案包含0.6毫米4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic酸(DSS-D6,化学位移指示器),0.6毫米咪唑(酸碱指示剂),和0.2%的南3和涡和离心机上面列出的条件。离心后,600μL整除被转移到5毫米核磁共振数据采集管。核磁共振光谱上获得力量皇冠三世600 MHz NMR谱仪(Bruker-Biospin Rheinstetten,德国)使用低温冷却5毫米态调查25°C。为1H光谱、1 d NOESY脉冲序列(noesypr1d)与水presaturation在延迟2秒放松和100 ms混合时间,和128年收集瞬变到16 k数据点的光谱宽度6602.1赫兹(ppm) 11日,收购时间2.48秒。
冻干细胞提取物在相同的核磁共振的解决方案用于重组条件的媒体。样本涡和离心机12000 rcf 3分钟;然后一个600μL整除的每个示例上层清液转移到5毫米NMR管(瑞士Bruker-BioSpin)数据采集。为1H光谱,同样的1 d NOESY脉冲序列如前款所述,除了瞬变的数量从128增加到256。为131 d C光谱13C脉冲序列(zgpg30)是使用一个512年代放松延迟和瞬态采集到32 k点,光谱宽度为36057.7赫兹(239 ppm)和收购0.9088秒的时间。此外,二维核磁共振谱是在几个选择帮助峰鉴别样本。这些2 d-hsqc光谱获得25°C使用16瞬变,256分13C维度,和512点1H维度。放松延迟1.5 s,光谱宽度是8012.8赫兹(13.4 ppm)和24997.3赫兹(165.6 ppm)1H和13C,分别收集时间是0.0639秒。
2.3。核磁共振数据分析
所有光谱导入MestReNova 10.0.1 (Mestrelab Sesearch SL,圣地亚哥德孔波斯特拉,西班牙)进行处理。1H光谱zero-filled 64 k点,apodized (0.5 Hz媒体和提取1 Hz),和傅里叶转换。光谱是手动分阶段和基线校正线性一级多项式和DSS的引用。光谱的峰被全球deconvoluted使用全球谱反褶积(德牧)峰选择常规(2拟合周期,优化平均峰值)。峰列表包含化学变化和峰面积出口到Microsoft Excel(微软公司,微软,WA)进行进一步分析。峰地区相应代谢物,并使用DSS的已知浓度的峰面积,计算代谢物的相对浓度。蛋白质颗粒质量被用于代谢物浓度数据的标准化。碳谱zero-filled 64 k点,apodized 10 Hz指数曲线,和傅里叶转换。光谱是手工分阶段和基线修正13-degree多项式和DSS的引用。光谱的峰值然后手动集成和峰值列表被出口到Microsoft Excel进行进一步分析。峰值区域对应于确定代谢物测定来确定相对浓度和蛋白质颗粒质量被用来正常化代谢物semiquantifications。 Media production and consumption values were calculated using the12C媒体实验复制,从新鲜的差异未使用的媒体被归一化颗粒的重量。如前所述,每个条件以一式三份,因此所有的测量细胞内浓度和媒体提出了生产和消费的平均值与标准偏差由括号表示在第一两个表。褶皱变化计算在所有成对的第三个表比较细胞系,相对于每个细胞株。没有进行假设检验,由于小样本大小的初步研究。所有原始代谢组学数据公开在美国国立卫生研究院共同基金代谢组学数据存储库和协调中心网站,代谢组学工作台:http://www.metabolomicsworkbench.org/data。
3所示。结果与讨论
3.1。Glutaminolysis,糖酵解和三羧酸循环
表1显示了一些不同的葡萄糖和谷氨酰胺利用率由每个细胞株,基于集成的1H和13C碳核磁共振信号从细胞中提取和培养媒体。在四个细胞系,glycolytic-dependent差异立即明显对光谱数据进行审查(补充图1),同样的谷氨酰胺的山峰13C-glutamine光谱(补充图1 b)。鲁米那MCF-7细胞最葡萄糖和使用,不足为奇的是,产生乳酸,表明Warburg效应(30.)是一个非常活跃的能源利用机制(数字1(一)- - - - - -1 (d))。此外,很少13从[U - C-aspartate产生13(U - C]葡萄糖或13C]谷氨酰胺,表明柠檬酸培养细胞的活动。同样,这个小天冬氨酸的生产也在三阴性mda - mb - 468细胞(数字1 (g)和1 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
另一方面,BT474腔的一个细胞株高丙氨酸和低乳酸生产,在细胞内和媒体样本(数据1 (c)和1 (d)),除了高13从[U - C-aspartate生产13(U - C]葡萄糖或13C]谷氨酰胺,表明高柠檬酸的活动。其较低的葡萄糖和谷氨酰胺利用率可能暗示的更高效的使用这些能源基质。一个同样高水平的13从[U - C-aspartate生产13(U - C]葡萄糖和13C]谷氨酰胺也出现在mda - mb - 231 (TNBC)细胞株(数字1 (g)和1 (h)),如预期的一样,我们看到一个更小的生产乳酸的媒体,相比其他TNBC细胞(人物1 (d)和1 (e))。也有媒体的高分解代谢mda - mb - 231细胞中谷氨酰胺(表2)。因此,高13C-aspartate,媒体乳酸低,降低葡萄糖的分解代谢,和更高的谷氨酰胺分解代谢似乎表明柠檬酸活动增加和更低的无氧糖酵解在这些细胞系,代表不同的亚型的疾病,和我们的数据提供了一种不同的方式对他们进行分类。有趣的是,在我们先前发表的研究中,我们描述了这四个细胞系的反应与化疗药物紫杉醇治疗,显示了无人监督的多变量分析(26),在没有药物的情况下,MCF-7和mda - mb - 468细胞聚集在一起,同样BT474和mda - mb - 231。这一观点似乎令人费解,因为它假定细胞系是最类似的基于激素受体状态,因此临床/分子亚型分类。事实上,在两个先前的研究,比较不同亚型BCa细胞系,我们展示了行集群由亚型基于基因组资料(31日间质巨噬细胞相互作用(后)和表达模式变化5]。因此,因为BT474 (HER2+)和MCF-7 (HER2- - - - - -)细胞表达ER和PR和作为代表接受腔的一个亚型,是不会BT474新陈代谢会更类似于mda - mb - 231,三阴线,同样MCF-7导管细胞新陈代谢更类似于三阴mda - mb - 468细胞。我们的数据表明,除了一个潜在的新方法分类BCa细胞系,HER2状态可能向依赖资源贡献更重要的代谢的作用机制。这些发现可能特别相关的在考虑应对不同类型的治疗,特别是当开发新颖的有针对性的策略。
3.2。核苷酸代谢
可以看到下面的核苷酸通过13C或1H NMR光谱:三磷酸腺苷mono - di -,或(AXP)(图1(我))、尿苷、UDP-glucose UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc)。(测量通过UDP-glucose和UDP-N-acetylglucosamine生产13分别为C浓缩在核糖和葡萄糖胺半个)由相反的镜像13C浓缩尿苷的趋势(通过测量13C浓缩核糖的一部分)。因此,尿苷池密切反映了生产核苷酸糖在这个意义上,作为其池减少,它是用于核苷酸糖生产。表3表明细胞内叠化差异、产生和消耗代谢物浓度从表1和2,而图2显示了这些关键路径的总体情况和相关代谢物的变化。
(一)代谢途径显示细胞内各种代谢物的13 c浓度从细胞生长13比较补充媒体。对葡萄糖-酒吧表示媒体消费
13 c浓度(b)代谢途径显示细胞内各种代谢产物从细胞生长13 c-glutamine补充媒体。谷氨酰胺的负面酒吧表示媒体消费
低浓度的13C标记尿苷和高浓度的标记AXP以及从[U -核苷酸糖13C]葡萄糖在媒体上BT474细胞可能的结果似乎更高的有氧柠檬酸活动中看到这些细胞相比其他三行。此外,更高的细胞内肌酸的浓度在BT474看到,催化ATP和ADP的形成。由于无氧糖酵解生成能量的低效率的方式从葡萄糖,其他细胞系可能优先为厌氧分解代谢葡萄糖。这似乎是MCF-7细胞。对于尿苷,核苷酸糖,AXP MCF-7细胞BT474细胞相比完全相反的趋势。此外,葡萄糖的消耗,总乳酸生产,13C(来自[U -天冬氨酸浓度13(U - C]葡萄糖和13C]谷氨酰胺)有相反的趋势这两个腔的线,展示MCF-7细胞表现出更高的无氧糖酵解和柠檬酸活动低于BT474细胞。
有趣的是,这两个TNBC细胞系,像在其他方面的代谢,也似乎是新陈代谢截然不同的核苷酸,核苷酸糖代谢。较低的mda - mb - 231细胞13从媒体(U - C浓缩13C]尿苷葡萄糖,AXP时更高的核苷酸糖,而相反的是对mda - mb - 468细胞。在我们的治疗反应差异相关研究中,我们使用的诸多代谢组学和评估循环炎症生物标记数据来识别这些线之间的差异,基于种族的妇女建立了。建立了mda - mb - 468细胞从一个样本来自一个非裔美国妇女,而mda - mb - 231细胞建立了从一个白人女人32- - - - - -36]。因为TNBC表明健康差异,种族,发病率,死亡率,和结果与响应性治疗(2,6,9- - - - - -15,37- - - - - -41),它是合理的,我们继续看到差异在能源利用水平。
3.3。氨基酸代谢
有同样高13从媒体(U - C-glycine生产13C]葡萄糖BT474和mda - mb - 468细胞,几乎没有可发觉的生产MCF-7和mda - mb - 231细胞。可以预见的是,这一趋势也见过的13甘氨酸的C浓缩一半的谷胱甘肽(γ-glu-cys-gly)。不幸的是,由于高峰重叠,我们无法分辨出谷氨酸谷胱甘肽谷氨酰胺和谷氨酸盐的一部分13C光谱。这新创谷胱甘肽生产BT474和mda - mb - 468细胞可能暗示的能力应对氧化应激和克服缺氧微环境条件,流程与治疗反应性降低,增加转移潜力,和凋亡功能(42- - - - - -44]。
还有其他不同的氨基酸浓度和生产讨论之外。特别感兴趣的是观察到的消费支链氨基酸(亮氨酸,异亮氨酸和缬氨酸)从媒体发生在趋势大致相反的葡萄糖。例如,MCF-7细胞葡萄糖消耗最高但缬氨酸最低消费,而BT474和mda - mb - 231细胞葡萄糖消耗最低但缬氨酸消费最高。消费的其他芳香氨基酸或蛋氨酸是不起眼的。细胞内的芳香和支链氨基酸浓度遵循大致相同的趋势,mda - mb - 231和BT474浓度最高,TNBC线浓度最高,但MCF-7和mda - mb - 468细胞相比,浓度较低。总的来说,从媒体反映细胞内浓度吸收。
4所示。结论
添加13C基质对媒体揭露了许多发现都不可能使用“传统”方法涉及12C基质。自葡萄糖和乳酸生产的多数是一个小得多的金额从谷氨酰胺,用的13C-glutamine在媒体上可以观察到从谷氨酰胺生产乳酸。同样,谷氨酸和谷氨酰胺葡萄糖的生产,以及生产的葡萄糖从谷氨酰胺,可以观察到使用媒体包含13比较或13分别C-glutamine。的13C测量,它代表的产量13C衬底,不同于他们12C同行,代表总池的代谢物。此外,新创合成的化合物被回收或部分退化可以观察到使用13C基质。13C测量AXP并从媒体含有谷胱甘肽13比较不同于他们12C。因此,13C测量表明新创合成,而不是这些大量回收的总池代谢物。最后,使用13C实验过程中,我们能够测量代谢物,尤其是脯氨酸和尿苷(图2),否则,难以集中,因为他们有1H NMR谱峰所掩盖了其他更大的山峰。
我们的数据证明稳定的效用isotope-resolved区分BCa细胞代谢组学行,由同一临床亚型分类激素受体状态的基础上,通过不同的能源利用率。这些特征差异应该考虑在设计有效的针对性的治疗策略。为此,未来的研究有足够的力量将统计测试中观察到的差异代谢物,扮演一个角色在细胞能量。接下来,我们可以确定不同的能源利用率BCa细胞系模型与基础能源利用需求使用正常的乳腺细胞,识别新陈代谢驱动机制和潜在的新药。
的利益冲突
研究支持单独从格兰特1 u24dk097193-01,上面详细。否则,没有利益冲突与本文相关的包括经济利益、活动、关系和从属关系是作者的任何披露。
作者的贡献
杰森·h·Winnike和Delisha a·斯图尔特的贡献同样工作和co-first作者。
确认
这项研究是由美国国立卫生研究院共同基金奖通过国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所NIH东部地区综合代谢组学资源核心北卡罗莱纳查普希尔大学期间,营养研究所(1 u24dk097193-01 PI-Sumner)。
补充材料
补充文件包含补充图 ,展示指定核磁共振光谱区域不同的腔的一个和TNBC细胞系(A)13比较或(B)13C-glutamine新陈代谢。(补充材料)