合成、结构表征和临床疗效的小说Paclitaxel-Loaded藻朊酸盐纳米颗粒对乳腺癌的治疗

文摘

目的。小说的抗肿瘤活性海藻酸(ALG)聚合物粒子含有紫杉醇(PTX)评估使用人类原发性乳腺癌细胞。材料和方法。PTX结合ALG在纳米粒子作为药物输送系统旨在提高乳腺癌肿瘤细胞死亡。PTX-ALG首次合成了纳米粒子nanoemulsification聚合物交联的方法提高了水溶性。PTX-ALG纳米粒子的结构和生物物理性质被确定通过透射电子显微镜(TEM)和高效液相色谱法(HPLC)荧光。影响细胞周期进程使用流式细胞术和细胞凋亡决心。结果。PTX-ALG纳米颗粒被紫外线(UV) /准备和特征明显(VIS)、高效液相色谱荧光和TEM。PTX-ALG纳米颗粒显示增加疏水性和溶解度PTX孤单。综合工程PTX-ALG纳米颗粒提升细胞循环逮捕,生存能力降低,诱导细胞凋亡在人类的主要患者乳腺癌细胞优于PTX孤单。结论。综上所述,我们的研究结果表明,PTX-ALG纳米粒子代表着创新,纳米级交付系统管理可以避免不良毒性的抗癌剂增强抗肿瘤效果改善乳腺癌患者的治疗。

1。介绍

乳腺癌是全球第二个最常见的癌症,第五癌症死亡最常见的原因,和女性癌症死亡的首要原因1]。乳腺癌的全球负担超过了所有其他癌症和乳腺癌的发病率正在增加2]。尽管重大进展,提高了乳腺癌的诊断和治疗,女性继续死于疾病即使疾病检测到处于初期阶段。尽管局部区域治疗已经有所改善,但几乎没有进步显著改善患者的诊断和治疗先进的疾病。目前,有限的治疗选择拥有先进的区域节点以外的疾病,患者。新颖的治疗策略,如纳米药物输送系统,提供机会增强抗癌疗法的交付为乳腺癌细胞和可能最终改善病人的结果。

纳米药物输送系统制定从生物相容性和生物可降解的聚合物构成一个不断发展的方法来提高药物输送和肿瘤靶向3]。ALG粒子提供承诺药纳米粒子由于生物相容性,水溶解度,一类属性,改善drug-binding。

ALG的优点还包括特定的肿瘤细胞吸收,对健康组织无毒作用,在肿瘤组织和积累明显抗肿瘤功效。PTX microtubule-stabilizing剂,促进微管蛋白聚合导致细胞死亡,破坏正常细胞分裂所需的动力。PTX是难溶于水的解决方案但溶于有机溶剂,例如,醇,这有助于先进制定策略。当前可用制定PTX包括Cremophor EL (polyethoxylated蓖麻油)和乙醇溶解。然而,Cremophor EL产生不必要的毒性作用以及不必要的副作用,例如,过敏反应,肾毒性和神经毒性4]。可生物降解的纳米颗粒配方使用保利(lactic-co-glycolic酸)(PLGA)显示类似的活动与更快的传统配方的管理(5]。PTX可以合并使用nanoprecipitation丙酮和PLGA近100%的效率。这些纳米颗粒直径范围从117到160纳米在体外发布了超过50%的药物加载在第一个24小时释放速度慢得多的释放,未来96 h。细胞研究显示高达70%的损失的可行性NCI-H69人类小细胞肺癌细胞在低至0.025水平µ克/毫升。另一组添加了维生素E tpg (D -α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸)作为乳化剂和矩阵组件PLGA纳米PTX释放。PSA-PEG纳米颗粒包含PTX作为模型药物也被nanoprecipitation准备和评估方法(5- - - - - -8]。

癌症纳米技术正成为一个新的跨学科研究领域将推动癌症检测,诊断和治疗(9]。NK105 PTX-containing聚合物胶束是由聚(乙二醇)化学与聚(天冬氨酸)10- - - - - -12]。NK105耐受性良好,表明抗肿瘤功效对胃癌症。Genexol-PM®(Samyang制药、大田市、韩国)是另一种聚合物胶束,其中包含PTX [12]。在第一阶段的一项研究中,Genexol-PM被用来提供PTX肿瘤没有额外的毒性和不良反应率增加在转移性乳腺癌患者相比,仅用紫杉醇治疗(13- - - - - -15]。保利(L-glutamic酸)-PTX共轭(ct - 2103)和聚(L -γ-glutamyl-glutamine) -PTX nanoconjugate (PGG-PTX)也对抗癌活性[PTX-containing聚合物被调查16- - - - - -22]。PGG-PTX表明抗肿瘤活性在活的有机体内这是优于Abraxane®(美国新泽西州Abraxis生物科学、峰会)小鼠模型。的药代动力学和组织分布PGG-PTX提高PTX孤独和活动自由的水平相比,等离子体和肿瘤增加PTX Cremophor-ethanol PTX混合物在轴承肺癌异种移植小鼠17]。

我们假设一个PTX-micelle共轭可以创建一个小说类抗肿瘤纳米粒子与提高治疗指数比PTX孤单。在这里,我们ALG-PTX纳米粒子生成和展示他们的能力来协调高效的药物输送和杀死乳腺癌细胞。为了实现这一目标,ALG-PTX在纳米粒子合成和准备使用一个简单的乳化方法(图1)。生成的纳米颗粒被使用UV / VIS方法相比,与未改性的PTX HPLC-fluorescence检测和TEM。我们的研究结果清楚地演示ALG-PTX纳米粒子有效的潜在目标,消除乳腺癌细胞。

2。方法

2.1。材料

PTX是σ(圣路易斯,密苏里州),从Cica-Reagent海藻酸钠,东京,日本,和所有其他试剂Sigma-Aldrich或默克。使用Milli-Q反渗透纯化水系统(EMD微孔、Billerica MA)。

2.2。准备Nanoemulsification PTX-Loaded藻酸盐纳米粒子的聚合物交联

PTX nanoemulsification制备的聚合物交联方法。简单地说,25µ5 L的药物(30毫克/毫升),在10毫升氯仿,声波降解法下乳化在30毫升的M 0.1% (W / V)的海藻酸钠水溶液作为乳化剂30分钟和甘油(15毫升)为稳定剂,同时加入一定量乳化剂混合物。混合物在室温下是治愈24 h (25°C)。纳米粒子被超速离心法分离(美国冷却离心,σ)在10000 rpm, 0°C 10分钟。删除nonincorporated药物,获得nanosuspension过滤(安全和“滤纸的圈子里,”孔隙大小1毫米)。纳米粒子是Milli-Q反渗透水清洗,然后在室温下干燥。

2.3。透射电镜样品的准备

TEM样本由下降涂层碳涂层的股票暂停铜网格。电影放在网格风干在薄纸之前测量。TEM照片显示纳米颗粒(比例尺代表500海里,80000年在x放大)。

2.4。细胞分离和制备

乳腺癌肿瘤组织标本的时候得到手术后通知书面同意按照南埃及癌症研究所伦理委员会的指导方针。组织从成年女性获得新诊断出患有乳腺癌。肿瘤组织是立即分解机械使用16-gauge不锈钢网(23]。

2.5。单克隆抗体和活力污渍

对流式细胞术分析细胞凋亡,propidium碘(π)和FITC共轭annexin-V(智商产品、荷兰)使用适当的老鼠同形像控制(圣地亚哥BD PharMingen CA)。所有抗体都使用浓度根据最佳的染色和使用标准化的协议进行。

2.6。流式细胞仪细胞周期分析

与抗癌药物治疗后表明,乳腺癌细胞与冰冷的70%乙醇固定和permeabilized至少1 h然后洗两次磷酸盐(PBS)。DNA被孵化染色细胞在37°C 1 h在40µg / mLπ和100µ在PBS g / mL DNase-free核糖核酸酶。荧光区域(FL2-A)是细胞周期的主要参数分析、直方图块FL2-A作为细胞周期图使用Modfit LT 3.0软件(美国BD,圣何塞,CA)进行分析。分析了细胞的表达annexin-V annexin-V和π识别早期和晚期凋亡,分别。

2.7。细胞凋亡的定量流式细胞术

流式细胞术进行与fluorescence-activated流式细胞术(流式细胞仪)石中剑系统(BD,圣何塞,CA)。Fluorocytometric结果随后被分析和显示与细胞追求软件(BD,圣何塞,CA)。每个分析包括测量至少10000个细胞。

2.8。透射电子显微镜法

纳米粒子的形态检查使用TEM进行。钨灯丝100千伏先进的高性能JEOL jem - 100 cxii系统(JEOL、东京、日本)被用来获得高分辨率透射电镜图像。

2.9。UV / VIS光谱学

使用斯派克紫外可见吸收光谱的解决方案记录双光束电脑扫描分光光度计uvd - 2950 (Labomed Inc .洛杉矶CA)与1厘米斯托帕德石英细胞。计算机数据系统UVWin5软件v5.0.5被用来测量波长和吸光度。

2.10。高效液相色谱法- - - - - -荧光检测器(HPLC-FLD)

高效液相色谱分析进行了使用安捷伦高效液相色谱法1200 (Santa Clara, CA)系统组成的脱气器,四元泵,荧光检测器。高效液相色谱chemstation软件(安捷伦科技公司)是用于仪器控制、数据采集和数据分析。ALG PTX, ALG-PTX纳米颗粒被筛选了使用Zorbax扩展C18柱(mm ID5µ米颗粒大小),发现在232 nm激发和353海里排放最小流量为1.5毫升⁻¹。列温度维持在25°C。流动相是由40%的水、35%的乙腈(ACN),和25%的甲醇。酸度是调整使用Jenway 3505米(伯灵顿,NJ)。

2.11。测量纳米电动电势的毛细管电泳(CE)

纳米粒子是准备和电动电势(ζ)是衡量使用安捷伦1600 CE体系(安捷伦科技、德国),配备二极管矩阵UV / Vis探测系统(190至600海里)。CE chemstation软件是用于仪器控制、数据采集和数据分析。裸露的熔融石英毛细血管(安捷伦)与总长度64.5厘米,有效长度56.0厘米,和50.0µ米内直径。应用电压维持在20 kV控制温度25.0°C给15的当前值µA少量的PBS溶液中添加获取费用和模仿人体中的离子浓度。总H₂O: PBS比率等于20:1是使用。这个解决方案然后添加到细胞来衡量ζ。一个新的毛细管被冲洗条件为1.0摩尔L⁻¹氢氧化钠为40分钟40.0°C和水为20分钟25.0°C。冲洗过程进行优化给冲洗0.1摩尔的精确分析L⁻¹氢氧化钠为2分钟,然后用水2分钟,然后平衡与缓冲运行5分钟。为了保持运行之间的过程重复样品纯度。

3所示。结果

3.1。PTX-Loaded ALG纳米粒子的表征

在股票分散纳米粒子的大小由TEM决定。声波降解法和稳定后,图2(一个)显示ALG纳米颗粒的透射电子故事和人物2(b)和2(c)显示PTX-loaded ALG纳米颗粒。最小的药物降解(0.1%)被存储在4°C后8个月表明polymer-generated PTX-loaded ALG纳米粒子保持稳定的矩阵。图3PTX的光度分析表明,ALG纳米颗粒,PTX-ALG纳米颗粒。转变为PTX-loaded ALG观察纳米粒子(红色)与PTX(黑)。也是从仅ALG纳米颗粒(蓝色)转向新的化合物的形成表明检测ALG纳米颗粒和PTX之间。

3.2。高效液相色谱荧光

荧光光谱是一种电磁光谱,然后测量荧光在给定样本。荧光光谱提供了有价值的信息关于PTX和ALG之间的交互。分子的大小和形状可以确定使用荧光光谱。监控的利益相互作用的荧光光谱变化是研究PTX可生物降解的分子,例如,ALG。在这些研究中,我们使用液相色谱结合荧光(图4)。

电动电势(级)被定义为测量静电电荷排斥或吸引两个粒子之间的决定。ζ是会影响稳定和允许洞察分散和聚合的原因。获得信息的静电势粒子在溶液中,以及他们的胶体稳定性,准备PTX-ALG纳米颗粒的测量。一个低值是想为了尽可能不带电的粒子,因此更少的干扰在活的有机体内。允许一个更好的流通到目标站点。同时一个值接近于零意味着不稳定和快速凝固。获得胶体稳定在一个值高于30 + mV或低于−30 mV。也正值不是理想的,因为它常常是毒性的迹象。是通过测量电泳淌度,粒子的速度当电场应用于他们。事实上,如果一个粒子带电,它将以一个恒定的速度(平衡)相反电荷的电极,当附近的电解质。电动电势的大小,的话,是 在哪里粘度,电渗迁移率,介电常数。计算-35 mV。ALG内化效率和目标能力的纳米颗粒被流式细胞术了。PTX-loaded ALG纳米颗粒显示细胞毒性显著高于商用PTX(紫杉醇)。

化学疗法已被证明能够抑制细胞增殖,阻止细胞周期进展,诱导癌细胞凋亡。因此,我们评估了PTX-ALG纳米颗粒对细胞周期和细胞凋亡的影响乳腺癌细胞的使用π和annexin-V染色。如图5是一个这样的实验结果。管理PTX-encapsulated ALG纳米颗粒导致肿瘤细胞凋亡和阻止细胞周期,与紫杉醇与观察。我们决定,在未经处理的细胞凋亡细胞的比例为11%,治疗后增加到83%的乳腺癌细胞PTX纳米颗粒。治疗ALG-PTX纳米粒子进一步凋亡细胞的比例上升到97%。

细胞周期分析来确定纳米颗粒对细胞周期的影响患者原发性乳腺癌细胞刚孤立的组织活检。观察细胞周期阻滞于G2期与PTX纳米颗粒。大量的碎片被发现在每个阶段细胞的确切比例很难计算Modfit软件。与PTX-ALG纳米颗粒治疗后,细胞周期阻滞于G2期显著增加()(图6)。

4所示。讨论

我们已经表明,PTX-ALG纳米颗粒抑制乳腺癌细胞的生存能力,并提供主要优势PTX或独自PTX纳米颗粒。PTX-ALG PTX纳米颗粒可能会减少不必要的副作用,增加药物的溶解性和可分散性,提供生物相容性,改善与其他生物活性分子的结合,增加药物的热和化学稳定性。纳米颗粒在这里准备也证明改进的光学特性和耐光性。由于亲水性纳米颗粒分散纳米颗粒在生物非常重要(水)系统与生物相容性有价值的替代传统的药物输送系统,易于合成的纳米颗粒在这里报道在未来bioapplications也起着重要的作用。

最近,PTX释放和微观粒子属性在体外和在活的有机体内药效学评价。基于生物可降解聚合物纳米颗粒在活的有机体内稳定性和安全性在人类患者,可以提供一种改进的抗癌药物(交付方法17,18,24]。癌症药物的释放保利(lactide-co-glycolide) PLGA-containing粒子是目前正在研究。PTX交付使用PLGA-derived纳米颗粒导致减少PTX腹膜腔的间隙以及更高的肿瘤暴露在PTX PTX [Cremophor解决方案相比,25]。未来的研究将解决ALG-PTX纳米粒子的精确分子机制抑制癌症细胞生长和诱导细胞凋亡。未来的研究还将调查报告的结果是否适用于其他癌症。深入的机械理解纳米颗粒之间的相互作用和肿瘤会导致新的战略,推进临床ALG纳米颗粒作为抗癌治疗的发展。

信息披露

詹姆斯·j·德里斯科尔是一个接受者的辛辛那提大学血液学肿瘤转化研究奖,也是导师Egyptian-US联合监督程序。默罕默德·a . y . Abdel-Malek是埃及文化和教育的接受者局授予Egyptian-US联合项目。

相互竞争的利益

没有利益冲突。

确认

作者承认埃及高等教育部门的支持,支持卓越的管理,卓越和竞争性项目的高等教育机构(项目:cep1 - 043 assu), 2014年格兰特。

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