超越DNA:一个集成和功能分类生殖系基因变异在乳腺癌的方法

文摘

遗传性乳腺癌基因检测是不可分割的一部分,个性化护理在精密医学的新时代。测定的准确性不仅依赖于技术和生物信息学分析利用还正确分类所需的经验和基础设施作为致病基因变异。解释生殖系变异的遗传性癌症的临床意义测试是复杂和有重大影响的管理病人增加癌症的风险。本文概述我们的临床实验室评估综合方法的变体。我们讨论的一些细微差别的评估应该考虑基因变体。此外,我们强调证据功能分析和结构分析等,可用于评估罕见的和复杂的变体。

1。介绍

景观的遗传性乳腺癌易感性基因检测变化很大的大规模并行测序为基础的测试在临床诊断中的应用。临床基因组实验室表现越来越多的大规模并行测序检测癌症易感性基因(1),这导致了一个强化应用这些化验在临床和研究环境2]。乳腺癌基因板和外显子组测序产生大量的遗传改变数据,从而提供一个重大的挑战,以确定哪些疾病或表型变异负责。乳腺癌基因尤其是板都很流行在过去的几年中,现在通常下令遗传学、肿瘤、乳腺外科诊所。这些测试可以同时分析众多癌症基因,突变时,可以产生重大影响患癌症的风险分层和管理(3]。临床分子诊断检测的重要组成部分是准确评估和遗传变异的解释。

橱柜遗传学”BreastNext癌症面板分析17基因(ATM、BARD1 BRCA1、BRCA2 BRIP1,背景,CHEK2, MRE11A, MUTYH, NBN公司禁止,NF1, PALB2, PTEN、RAD50, RAD51C RAD51D,TP53大规模并行测序)的所有编码外显子和至少5个碱基对的侧翼5′和3′末端所有内含子和翻译。此外,临床上重要intronic突变超过5个碱基对的启动子区域PTEN(c。-1300 - c - 745)总是测序和报告。测序进行150年Illumina公司HiSeq2500或NextSeq使用bp paired-end条件按照制造商的标准工作流程(Illumina公司)。初始数据处理后,所有临床样本必须通过最小阈值包括在分析中。三个参数如下:的意思是基本要求质量分数大于30岁的比例将达到30多了75%,和完美的比例匹配索引需要大于85%。对于每一个基因,候选人所需的最小覆盖20 x是变异。

为了帮助规范的解释和报告基因检测结果,组织如美国大学医学遗传学和基因组学(ACMG)、分子病理学协会(AMP),与国际研究机构和癌症(IARC)提出了序列变异的解释和报告标准7- - - - - -9]。这些标准衡量下多个证据分类变量five-tier分类算法使用术语如致病性(P)、变异,可能致病(车牌区域),意义不明的变体(VUS开头),变异,可能良性(长春花碱)和良性的(B)来表示与疾病的可能性。每ACMG指南,“可能”这个词指的是一个分类层,相当于> 90%的可能性被致病变种或良性7,8]。最近的临床效用ACMG指南在一群个体进行测序证明遗传癌症风险(10]。

虽然ACMG变体评估指南提供一个基本框架,基因和syndrome-specific外显率等因素,发病率,遗传模式、疾病机制、蛋白质结构和功能需要考虑。此外,当考虑到患者的表型变异的识别,一个人必须考虑疾病的患病率和如何确定病人占潜在拟表型。例如,许多基因遗传性乳腺癌电池板被认为是温和的外显率和相关联的2 - 5倍增加乳腺癌的风险。鉴于乳腺癌的患病率相对较高(1/8的女性在美国),传统的隔离方法由拟表型抱愧蒙羞,更难以使用和基因外显率减少。这些混杂因素表明这些基因需要大量的种族隔离事件提供了有意义的结果。还应该考虑gene-specific生殖系的频率等因素和躯体新创改变,额外的测试在杂合性丢失等肿瘤研究,nonsense-mediated衰减的变化和交替剪接。例如,在基因等TP53和PTEN,生殖系新创变异是已知的疾病是一种相对常见的原因(11,12]。然而,随着乳腺癌基因等自动取款机,CHEK2,PALB2,新创率是未知的。这是困惑的乳腺癌是一种常见的疾病,不能推断如果新创直接在这些基因与疾病或偶然发生。此外,尽管体细胞新创数据是可用的一些基因(13)并入生殖系变异分析尚未标准化,将需要执行gene-by-gene基础。

财团等证据解释的基础网络生殖系突变等位基因(谜)展示了一个协作的力量变体方法评估和执行的重新分类的vu方面已取得了很大的进步在乳腺癌基因致病或良性。然而,即使是这些团体由速率是有限的数据积累。开放数据库如ClinVar和莱顿打开数据库(源)变体(LOVD)可用于识别额外的情况下或出版物相关的变体。这些数据库也帮助标准化之间的变异解释实验室通过识别分类的差异。临床实验室包括橱柜遗传学合作努力下,GeneDx,芝加哥大学分子医学和实验室造成内部数据组成的隔离和共享的共存与相同基因的突变或其他基因和新创观察导致78%的临床可行的差异的决议(VUS开头与车牌区域/突变)和92%的VUS开头和可能良性/良性差异(内部数据)。尽管有这些努力,分子实验室和临床医生所面临的一个挑战是,很多是非常罕见的遗传变异和没有足够的执行数据分类之外的vu出版。我们在座的实验室的综合方法变异评估和审查工具用来评估变异对蛋白质功能的影响。

2。评估集成方法变体

橱柜遗传学发展和实施一个集成方法变异评估(表1),包括five-tier变体的分类算法提出的类似ACMG和研究。尽管橱柜遗传学的基础的分类算法是基于ACMG指南,我们采用了严格的阈值研究提出的类似,在“可能”是指致病变种的> 95%信心或良性9]。在该算法中,致病性和致病变种可能都解释为临床可行的医疗管理和家庭成员的建议测试。

橱柜遗传学的证据旨在评估算法包含多个行变异的影响在蛋白质的致病性变异与疾病表型(图1和表2)。这些证据加权作为独立的(类别和F),强(类别B和D),或支持(类别C和E)和结合时如表所示1,他们会导致分类可能良性的,良性的,可能致病,或致病。证据是有限的或冲突时,变异仍列为VUS开头。证据如它的位置、结构、功能和RNA研究反映了信使核糖核酸或蛋白质功能的影响。进化的保护,在网上如Polyphen和筛选模型,和一般人群频率反映健身,也就是说,繁殖成功率和生存以等位基因多样性的缺乏。中观察到的表型变异的cosegregation运营商和变异与疾病和共存与其他致病性变异反映的致病性变异(图1)。一些这方面的证据是通过数据库等现成的外显子组等位基因频率数据聚合财团(ExAC)或发表文献中的数据(14]。然而发表文献通常包含常见变异的数据和数据支持致病性罕见变异是稀缺的,经常只能在内部。

对于大多数基因在乳腺癌面板、计算数据在网上模型、进化的保护和蛋白质结构分析是现成的。人口频率数据积累快速增长,由于主要贡献从1000年基因组,NHLBI外显子组测序项目(ESP), ExAC。这些数据有显著影响的良性变异识别高频率太频繁的致病性仅根据疾病的发病率,尤其是对于历史上可以理解民族。乳腺癌的基因,这个阈值一直在保守组等位基因频率1%人口众多军团如果使用作为一个独立的证据支持良性分类(表1、类别)。仔细考虑人口群体大小是需要达到一个高的信心(低95%置信区间在1%以上值< 0.05),频率在1%以上。例如,一群60000等位基因的等位基因频率1.08%就足够了(95% CI =低1.01%;)而对于一群1000等位基因,等位基因频率为1.70% (95% CI =低1.15%;)是需要自信的95%;等位基因频率在1%以上。

尽管患者表型、共存和cosegregation数据公布的文献中可以发现,许多实验室也牧师内部数据用于变体的分类。病人的临床和家庭历史很难使用一条线的证据在临床实验室环境由于确定偏见。然而,当一个变异的基因与一种罕见的疾病(1/2000)标识在多个个人会议经典临床标准,从不在大型控制人群或人口群体对致病性这些数据可以作为证据使用。这是大多数的患者进行基因检测大量基因面板上测试所有已知的与疾病相关的基因都被排除了。然而,当定义我们使用经典的临床标准非常严格的指导方针和排除常见疾病如乳腺癌。例如,当评估一个TP53变体,表型是强大的李法美尼症候群病人是否满足经典标准:肉瘤诊断前45年的渊源者,一级亲属与任何癌症在45岁之前,和一个二级相对与任何癌症在任何年龄都在45岁之前或肉瘤(15]。常见疾病和温和的外显率基因贝叶斯分析,需要使用较大的表型数据集(16]。从历史上看,在体外研究主要发现在出版的文献。然而由于罕见变异的迅速积累,临床实验室橱柜遗传学等实施验证内部功能研究,如拼接和homology-directed DNA断裂修复(HDR)化验,可以纳入变体的分类算法。

3所示。功能实验室

执行许多变体被归类为的vu因为其功能的影响知之甚少或尚未研究。这些变异包括错义和拼接改变肿瘤抑制基因,需要损失函数来体现一种疾病(7]。临床基因组实验室传统上依赖的证据发表文献建立变异对基因表达的影响或蛋白质功能7]。这种方法有几个限制,包括发表偏倚,困难及时获得关于结果的额外信息和协议,以及缺乏证据发表一个特定的变更。临床基因组实验室的一个潜在的解决方案是实现一个功能实验室,可以生成化验敏感性和特异性高(> 99%),并提供公正的分子证据阐明执行功能的影响的vu(图2)。作为一个令人信服的例子验证试验,Guidugli和他的同事们决定的敏感性homology-directed DNA断裂修复(HDR)功能分析为100%(95%可信区间(CI): 75.3% - -100%),特异性为100% (95% CI: 81.5% - -100%)17]。

3.1。为执行拼接的vu RNA研究

虽然一些剪接变体,如规范±1或2接头地点,通常被认为破坏导致基因功能的异常等位基因的表达减少由于nonsense-mediated衰变(NMD) [18)或异常蛋白质截断(19),综合评价拼接的变化进行准确的临床解释是必要的。规范拼接站点±1和2变种,也必须考虑在坐标系删除/插入的可能性,从而保持蛋白质的关键区域,因此导致轻微、中性或功能的效果。此外,变异,预计将影响拼接但不位于权威网站(±1和2)需要额外的强有力的证据(见细节部分2)归类为致病性或良性7]。生物信息学软件开发预测假定的拼接网站(20.]。一般来说,这些在网上工具更敏感(~ 90 - 100%)比被特定的(~ 60 - 80%)在预测变量的影响在拼接21,22]。然而,通过自然在网上工具只能提供证据限制他们的使用7]。从RNA拼接结果,数据分析,旨在提供成绩单的定量和定性描述,通常需要评估这些变异的致病性。自出版RNA数据不可用每一个变体,临床基因组实验室可以更精确地分类通过实现自己的RNA剪接改变协议和化验提供准确拼接的分类变化。

的可靠性,分析收益率在重复试验相同的结果,是一个关键的问题在实现mRNA分析在临床功能执行实验室评估的vu。为了提高可靠性,谜财团进行了多中心调查比较信使rna剪接分析其成员所使用的协议(23]。该财团提供一些建议的最佳实践在临床测试的拼接改变,包括协议的标准化和分析敏感检测方法的使用23]。检测方法的评估,毛细管电泳(CE)是产量最高的灵敏度分析。然而,CE的主要限制是它无法收获,随后执行rt - pcr产物的序列分析。为了执行序列分析和完全地描述或者拼接成绩单,该财团认为克隆单一PCR产品到一个向量系统是一个有用的替代方案隔离单记录排序,提高了灵敏度在乐队切除和测序。在出现的情况下,简单,该财团推荐使用在活的有机体内,在体外和临床分析预测有99%的可能性是良性的变体或致病23]。例如,尽管大多数规范剪切位点变异被认为是先天的至少可能致病,天然存在的可变剪接,模仿一个致病性改变对拼接和结果在一个类似的影响(例如,外显子跳过)需要仔细评估,因为它可能会导致丧失致病性。必须注意是否记录存在于正常对照组。随着功能实验室获得更多的数据在每个基因,更准确的照片拼接模式将会出现,从而导致改善接头网站的分类变化。

3.2。为执行错义的vu功能化验

错义突变而不影响拼接可以评估利用湿实验室化验或实验数据结构。虽然功能研究可以支持致病性的一个强大的工具,并不是所有的功能性研究准确预测对基因或蛋白质功能的影响。为此ACMG / AMP为评估功能的有效性分析,提供建议以确认功能测定准确地衡量一个函数,它会导致疾病(7]。人们必须考虑如何密切的功能分析反映了生物环境。这是重要的,当决定是否测试患者样本或执行在体外化验。是很重要的考虑已知蛋白质的生物功能,同时检查这些功能是否真的有助于致瘤性。例如,许多功能化验了审问乳腺癌易感基因1VUS开头(24]。一些化验关注BRCA1的已知DNA修复功能,如HDR试验(25,26)和辐射电阻测定(27]。其他检查BRCA1本地化(28,29日)和细胞的能力乳腺癌易感基因1变异生成Rad51焦点(30.,31日在DNA损伤的存在为BRCA1函数。额外的分析集中在一个功能组件BRCA1代替完整的蛋白质,包括转录活化试验,采用c端BRCT域,和泛素连接酶测定,利用氨基地区(32- - - - - -35]。这两个化验是无法限制占整个蛋白质的影响,和其他人指出,某些变异,失去了泛素连接酶活性并未被归类为致病基因研究[36,37]。同样,蛋白质或肽绑定可能分析解决的能力变量绑定到一个蛋白质的目标在体外,但这些数据应该被纳入一个多因子的模型,考虑其他的功能在活的有机体内数据(38,39]。此外,验证数据,评估的分析性能试验和占标本的完整性是重要的考虑因素在实现功能在功能基因组实验室和临床分析中使用这些结果变异的分类(7]。

调查的效果错义在BRCA1变异函数,陆等人68个错义变异使用一个测试在体外HDR试验(26]。分析表明,HDR缺陷或部分有缺陷的错义变体BRCT域的定位中心的结构或表面上负责蛋白质-蛋白质之间的关系,而HDR-WT BRCT域的变异表面暴露或部分表面暴露的变体(26]。这个亮点解读错义生殖系的复杂性变异,表明一个集成方法,通过编译功能化验的结果,结构评估,分析临床参数,应该确定最功能和临床相关的改变。

3.3。分析的总重复插入断点

最总删除在高危癌症基因,大于3 ~ 5 megabases,属于微阵列报告准则和报告是有害的38,39];然而,没有断点信息总重复主要是执行报告为的vu。而阵列比较基因组杂交(aCGH)方法用于检测染色体畸变(gdp)的癌症研究的癌症基因,它不能准确地确定确切的基因组断点的放大40- - - - - -43]。映射的插入断点,paired-end可以使用高通量测序。总基因组的扩增可能发生在癌症基因内部串联重复,导致一个新颖的功能,或作为一个nontandem重复基因组的位置插入一本小说。因此,识别的具体断点串联重复执行高风险的癌症基因可以导致的vu被重新归类为可能的致病或可能是良性的。

识别的具体断点串联重复,橱柜遗传学是目前利用paired-end测序方法进一步描述总重复。探针集是用来捕获目标的地区建议由aCGH断点标识。捕获由paired-end大规模并行测序DNA测序和映射到人类基因组。橱柜遗传学管道标识读双错了方向,表明一个串联重复(图3(一个))。集群的读双软限幅跨度断点可以表明重排断点的确切坐标(图3 (b))。作为一个例子,一个外显子11重复乳腺癌易感基因1执行之前列为的vu可以重新归类为可能致病如果断点标识导致基因转移(图3)。

4所示。计算结构分析

计算结构算法提供了一个独特的解决方案评估一个变种对蛋白质功能的影响在他们的速度比实验研究和经常使用的数据从许多学科(44]。然而,计算分析所提供的信息的质量取决于不同的信息来源。例如,主要使用进化序列分析工具可以识别一个变种可能带来的影响。通过比较一个改变了人类的序列与类似的主要蛋白质序列或相关结构形状,健身的变体可以预测基于位置的变化和化学等方面相似的野生型和变异氨基酸。橱柜遗传学依赖多种工具,包括“排序不能容忍宽容”(筛选)和Polyphen2项目40]。我们通常使用两个项目的共识,筛选Polyphen2并在适用时,只考虑整合的结果作为证据。如果只有一个程序适用如Provean [45]indels我们将预测与保守的阈值由单一项目的分析我们的内部数据。另外,分析蛋白质的二级和三级结构增加解释的可靠性。最可靠的计算算法关注生物物理学方法更直接面向仿真的物理过程发生在蛋白质46- - - - - -48]。在许多方面,计算方法是最多样化的属性,可以量化;然而,他们的费用计算需求和准确的属性可以被派生的速度。最常见的一种,容易确定的来源中断引起的一个变体是影响蛋白质稳定性(46,47,49- - - - - -51]。可以以多种方式影响蛋白质稳定性,如错误折叠或展开的蛋白质结构,这通常导致功能丧失或过早退化和haploinsufficiency。作为一个例子,蛋白质稳定性已经被Karchin等人来生成一个预测工具的可能性的影响乳腺癌基因的改变BRCA2(52]。有其他重要方法,发挥他们的致病效应可以通过结构描述。例如,一个变体可能不会明显影响静息状态结构的蛋白质,而是影响的运动过程中其功能。它可能会影响与其他目标蛋白质绑定或基质或可能引发聚合47,48]。详细了解生物物理原则照亮通过结构是至关重要的评估和解释变化的影响。

5。三级和四级的乳腺癌基因序列

使用生物物理的方法来预测蛋白质的一个变种的影响通常需要的可用性目标基因的结构或效益显著。的17个基因中代表在BreastNext癌症面板中,总共有247实验推导出结构,每个基因列表在pdb分子(蛋白质数据库文件)列的表2用核磁共振(NMR)或x射线晶体的方法(5,53]。上述范围对应的总范围残留物覆盖所有实验测量除以总长度的蛋白质。虽然有明显的例外,没有实验结构已经确定,大部分的基因已经被部分的情况TP53完全阐明实验。的结构TP53整个蛋白质是高度有序的,允许完整的测量一个低能量的形式;然而一些蛋白质组等乳腺癌易感基因1和BRCA2是由地区没有固定的结构特征。要求区域内结构性蛋白,如在N(有趣的新基因,即。、环域)和C末端(BRCA1 C末端,即。、BRCT重复)乳腺癌易感基因1定义领域界限,提供更高质量的手段。这些可以分析折叠功能单位而不是通过保护技术,用于蛋白质的家庭(包含)数据库(54等)或使用元预测InterPro [55]。基因的结构覆盖表2没有考虑长一些蛋白质没有内在的球状结构,所以这些数字可以被视为一个非常保守的估计可用残留物覆盖的范围。此外,仍有一些蛋白质,如自动取款机或NBN公司禁止,没有实验测量(或低分辨率的结构5,6]。对于这些系统,结构分析包含了使用相同的模型建立在已知相关的蛋白质的结构。这大大增加了结构的有效范围覆盖和可用的见解。

中断一个域的折叠蛋白质的错义致病变种是众所周知的导致的损失函数。临床观察到改变c。5509T>G (p.Trp1837Gly) (ClinVar: SCV000077040) represents a case where structural features explain the disruption of the BRCT repeat region in乳腺癌易感基因1。c端部分乳腺癌易感基因1包含一对BRCT重复域,BRCT1 BRCT2,原子详细地描述,包括氨基酸组成的安排这些域,由26个不同的晶体结构(56- - - - - -59]。氨基酸的侧链Trp 1837 (W1837;洋红色棍子)被埋在BRCT2域的核心包围疏水氨基酸(绿棒),而骨干参与一个螺旋参与绑定BACH1(图4)[56]。变更W1837 G1837 (W1837G)将导致大的损失稳定疏水侧链和预期非常不稳定。介绍的不稳定的变更已经被计算折叠算法定量计算表明它非常不稳定5]。的确,大肠杆菌表达了与在体外突变体的p。W1837G产生的蛋白质,在场只有在包涵体不能复合(60]。在生化、细胞转录的另一组实验中,这种改变导致受损蛋白质水解和phosphopeptide-binding39,58,59,61年]。在一起,这些功能的定性和定量结构观测数据支持变体将创建一个非常不利的腔在这个领域中,从而扰乱折叠和蛋白质功能。这个例子演示了如何公开可用数据的详细结构分析可以促进改变的理解和解释蛋白质的功能,可以支持计算和实验观察。

6。结论

虽然癌症基因检测历来是限于高度渗透和良好的易感基因,基因的应用面板使用大规模并行测序稳步变得越来越普遍在遗传癌症风险评估由于降低成本和提高效率。基因面板,反过来,往往会导致更多的变异个体的识别,需要评估的临床意义使用多个行加权证据。我们提供了一个完整的方法评估变异对遗传性乳腺癌观察面板和相信这可以提高患者的临床管理个人和家庭历史的乳腺癌分类更准确的变体。综合评估程序集成多个变体证据旨在评估一个变种对蛋白质功能的影响,健身,和致病性促进高质量和高效的变体的分类,为病人提供增加效益和可靠性。

相互竞争的利益

橱柜遗传学corp .)是一个CLIA批准临床遗传学测试实验室。本文的作者都是全职带薪员工橱柜遗传学。

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