文摘
作为研究的一部分合成一种更直接的化疗,我们已经开始评估不同的潜在的毒素的功效,可以发表在本地而非系统性。在这一过程中,我们希望减少系统性副作用一般观察,同时保持高水平的毒性和消除代谢改变的必要性。在寻找更高效的方法杀死癌细胞,我们已经开始研究斑蝥素,毒素用于中药,作为潜在的化疗。使用MTT细胞生存能力分析,斑蝥素的毒性与环磷酰胺和紫杉醇在三个不同的乳腺癌细胞系:MCF-7, mda - mb - 231和SK-BR-3。增加化疗药物的浓度并减少细胞生存能力在所有的细胞系斑蝥素和环磷酰胺;然而差异对于紫杉醇是特异性的。此外,斑蝥素表现出最高的减少细胞生存能力不管细胞类型,表明它可能是一个更强有力的和特定的化疗。这些结果将帮助我们前进发展中可能更有效的治疗乳腺癌可能消除subtype-specific治疗的需要。
1。介绍
乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大原因(1]。而一些有针对性的化学疗法已经被开发出来,这些药物的使用是有限的患者表现出适当的细胞,如三重阴性或HER2阳性(2- - - - - -7]。代替这些靶向治疗,必须利用更多的非特异性治疗。环磷酰胺和紫杉醇是两个常用的乳腺癌化疗(8]。环磷酰胺是一种烷化剂类的氮芥茉破坏DNA,从而阻止癌细胞的繁殖(9,10]。紫杉醇干扰细胞通过改变微管细胞骨架重排(11]。紫杉醇是第一个紫杉烷用于临床试验,发现用于卵巢癌和乳腺癌耐化疗和被使用在活的有机体内研究抑制乳腺肿瘤的生长,延缓乳房腺癌,减少肿瘤血管生成(12]。使用紫杉醇与辐射,在初始治疗,改善生存(13]。
总的来说,这两种毒素产生好的结果;然而当这些毒素用于静脉注射,传遍全身,不加选择地致人死亡两癌和非癌变细胞(14- - - - - -17]。常见的副作用包括脱发、膀胱损伤,关节痛,贫血18,19]。此外,尽管这些药物通常用于非特异性治疗乳腺癌,他们可能实际上显示混合功效取决于肿瘤的遗传背景,现在有些肿瘤显示紫杉醇耐药(20.- - - - - -22]。我们的长期目标是识别化合物可能会表现出更高水平的细胞死亡,减少特异性和发展的机制更本地化的交付这些化合物减少系统性毒性。
因此,我们决定研究斑蝥素,天然毒素能诱发细胞凋亡。斑蝥素是萜类化合物分泌芫菁科家族的几个种类的甲虫,主要是斑蝥,红衣主教甲虫,和士兵甲虫,西班牙苍蝇狂犬病实验(23]。它已被广泛用于中药作为MCV感染和局部治疗疣(24]。最近的研究表明,斑蝥素可能通过抑制蛋白质磷酸酶我和花絮,激活p53, CDK1抑制,活性氧的生产(24- - - - - -27]。然而,随着斑蝥素是一种有效的诱导的细胞凋亡,其安全性作为抗癌剂是有问题的。李等人。28斑蝥素选择性报道在诱导细胞死亡在胰腺癌正常胰腺癌细胞系,并斑蝥素显示潜在的用于治疗结肠癌和肝癌(29日,30.];这也是剧毒的胃肠道和肾脏可能导致死亡率(31日,32]。
我们的长期目标是创建一个可以利用局部化疗杀死癌细胞而离开周围组织和快速分裂的细胞,如毛囊和红细胞完好无损。作为这一目标的一部分,我们试图确定一个化合物,更快、更完全的毒性比当前可用的选择。我们的假设,我们正在研究的毒素之一显然会比其他两个更有毒,因此将是一个理想选择前进发展的新的化疗。比较这些潜在的细胞毒性化疗,因为背景不同的细胞毒素暴露可能导致不同的反应,我们使用三种癌细胞模型:MCF-7细胞mda - mb - 231细胞,SK-BR-3细胞。我们应用斑蝥素、环磷酰胺或紫杉醇对这些细胞长达96小时,评估细胞的可行性。这些研究的结果提出了。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
三个乳腺腺癌细胞系利用:SK-BR-3细胞,Her2基因过表达,mda - mb - 231细胞,嗜荷尔蒙,MCF-7细胞,表达雌激素受体。SK-BR-3和mda - mb - 231细胞在DMEM / F12媒体(生活技术,大岛,纽约)补充用抗生素(青霉素50国际单位/毫升、50µg / mL链霉素,5µg / mL硫酸庆大霉素)和10%的新生牛血清(生活技术,大岛,纽约)。MCF-7细胞保持在鹰的修改基本培养基(HyClone,通用电气医疗集团生物科技、匹兹堡、PA)含有抗生素,5%小牛血清(PAA,通用电气医疗集团超Corp .),皮斯卡塔韦,NJ)。所有细胞都维持在37°C公司5%2湿润的环境。
2.2。MTT试验
confluency当细胞达到至少75%,他们与哈佛商学院洗,使胰蛋白酶化,在媒体resuspended,镀成一个96孔板/ 75厘米3瓶。24小时后,镀一组细胞治疗在一式三份各自媒体包含1到100μM斑蝥素,0.1到10µ紫杉醇,或DMSO车辆控制,或10到1000人μM环磷酰胺或H2O车辆控制。这种治疗后反复对新鲜细胞24日,48和72小时。
最多96小时的治疗后,MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化,σ,圣路易斯,密苏里州)基于细胞生存能力分析进行的萨金特和泰勒(33]。短暂,MTT添加最后一个0.5毫米的浓度,并在37°C细胞孵化有限公司5%2孵化器。3小时后,MTT的解决方案在200年被删除和细胞可溶性μDMSO的L。染色的数量是量化使用微型板块读者在570海里。数据记录代表可行的细胞的数量和规范化的治疗控制井为每个实验。至少四个实验进行了复制。单变量方差分析(方差分析)进行了使用SPSS (IBM SPSS统计21日,IBM公司,阿蒙克,纽约)。
3所示。结果与讨论
mda - mb - 231、SK-BR-3 MCF-7乳腺癌细胞暴露在单一化疗药物浓度的范围跨越IC50长达96小时。可行的细胞与MTT染色染料,转换为甲瓒的活细胞中线粒体(33]。甲瓒的数量然后使用标量化。结果相比,适当的控制,DMSO溶液或H2o .的统计分析结果数据使用SPSS进行。单变量方差分析表明cross-interactions之间的所有细胞类型的多因子的组合,毒素,浓度,和曝光时间,因此小交互(毒素、浓度和曝光时间加多因子的组合)检查在每个细胞类型在适当的时候。
环磷酰胺通常用于治疗一些癌症和最有效的转换后其活性形式由肝脏(34]。我们选择一个治疗10到1000的范围µ米或水车辆控制,因为这些水平重叠或超过集成电路500.2 -17µ米(35,36]。细胞与环磷酰胺治疗显示最小的细胞死亡(图1)。没有观察到显著差异高达1000µ环磷酰胺在mda - mb - 231细胞(图1(一))。相比之下,在这个浓度最高,SK-BR-3和MCF-7细胞显示减少细胞生存能力相比,水的控制。观察在SK-BR-3细胞,只有30%死亡一直在最高浓度(图1 (b))。类似的差异只是观察到MCF-7细胞(图最长的治疗1 (c))。因此,MCF-7和mda - mb - 231细胞比SK-BR-3细胞抗环磷酰胺。这有点期望与我们直接应用的毒素,如环磷酰胺不是有毒没有被肝脏代谢(37]。因特网et al。38)表明,细胞凋亡在MCF-7细胞治疗近一倍0.001和1µM control-treated细胞相比,然而收效甚微mda - mb - 231细胞中观察到。即使有更高浓度的环磷酰胺,我们未能发现类似水平的细胞死亡。
(一)
(b)
(c)
紫杉醇(紫杉醇)是另一个化疗,广泛用于乳腺癌治疗(39- - - - - -41]。紫杉醇表明混合效果依赖于细胞类型,IC500.02 -100海里(42- - - - - -45]。因此,我们觉得是更合适的目标区间的高端,确保在我们三个细胞系细胞死亡。然而,即使在这个更高的剂量,紫杉醇显示有限的毒性(图2)。没有观察到显著差异可行性24或48小时时间点的三个细胞系,不管使用的浓度。在mda - mb - 231细胞中,我们观察到轻微减少生存能力在72和96小时,尽管这是在中间的浓度1µM(图2(一个))。SK-BR-3细胞,观察复苏后暂时在72小时(图生存能力下降2 (b))。MCF-7细胞,观察的时间产生重大影响,因为生存96小时治疗显示低于车辆的低浓度的控制。最近的研究表明,一些细胞类型可能对紫杉醇耐药的差别将对这些LZTS1 [45,46]。毒性反应我们检测,结合耐紫杉醇目前观察,紫杉醇不似乎是一个很好的选择局部化疗。
(一)
(b)
(c)
斑蝥素已经找到了以前作为一个潜在的化疗药物,因为它显示了一个高水平的毒性在各种癌症细胞系(24,26,27,47,48]。然而,目前化疗直接比较有限。Chang et al。49报告一个集成电路5050µM MCF-7斑蝥素的细胞,因此我们选择1到100的范围µ为我们的研究。与紫杉醇和环磷酰胺,我们的数据表明,斑蝥素能够显著降低生存能力在所有三个细胞株(图3)。在1µM斑蝥素,高达百分之三十的细胞死亡在mda - mb - 231细胞(图3(一个)),有超过百分之五十的细胞死亡后至少72小时的治疗浓度越高。在其他两个细胞系,统计上显著的细胞死亡相比,车辆控制持续观察,直到100年µ米的浓度。然而,这是观察细胞死亡明显多于其他两种毒素细胞系的研究;当浓度不计入,统计死亡为所有三个细胞株斑蝥素比环磷酰胺或紫杉醇()。
(一)
(b)
(c)
而环磷酰胺和紫杉醇显示有限的毒性报道IC50的水平,我们的数据表明斑蝥素可以显著降低可行性不管细胞环境。因此,斑蝥素拥有更好的潜力与多种癌症的化疗选择遗传背景。斑蝥素是有效的没有被肝脏代谢,它可以是本地注入肿瘤而不是给系统。然而,我们必须考虑,即使局部剂量,仍有毒性的系统性风险。相互矛盾的报道斑蝥素毒性的胃肠道和肾脏系统做出选择利用斑蝥素一个难以解决的问题。有研究表明,在两种在体外环境使用胰腺细胞和一些临床试验,斑蝥素毒性癌细胞比非癌变(28,50,51]。然而,历史证据表明,肾脏和肝脏显示特定的对斑蝥素的敏感性,在间隙(由于其生理作用31日,32,52]。减少斑蝥素的潜在毒性非癌变细胞,我们的下一个目标是与化学家在我们机构合作开发一种药物传递机制将保护正常组织,允许直接细胞死亡的面积只在肿瘤。作为封装剂(纳米粒子起太大作用53,54]。此外,纳米颗粒减少的严重程度的许多传统化疗的副作用(55,56]。因此,未来的研究将集中在创建一个无毒的壳从脂质体和中空的金纳米粒子,将封装斑蝥素减少其毒性应该接触nontumor细胞。一旦合成,释放机构将被识别,确保交付的毒素只肿瘤。理解这些纳米粒子与癌和非癌变细胞的相互作用将允许改进诊断和治疗在癌症研究,包括化疗和靶向的肿瘤的交付。
4所示。结论
在我们每一个细胞类型检查,mda - mb - 231, SK-BR-3,和MCF-7细胞,我们观察到高细胞生存能力下降后斑蝥素应用在比较未经处理的控制,达到80%以上的细胞死亡的细胞类型与100年96小时的治疗后µ斑蝥素。这是更多的死亡比观察紫杉醇或环磷酰胺、两个常用的化疗药物。因此,我们已经确定了一个更强有力的毒素,可能用于当地,而不是系统性,剂量。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢Millikin大学生物学系资助这个研究,包括资金通过格雷维特赋予椅子(青年队)。作者感谢y女士答:Nardulli博士和齐格勒(伊利诺斯)提供乳腺癌细胞系。作者还要感谢博士t Wilcoxen寻求帮助和建议在我们的数据的统计分析。