文摘
癌症和炎症在肿瘤恶性肿瘤的预后密切相关。乳腺癌MCF-7细胞侵入性表型不佳,尽管,il - 1β刺激,获得入侵特性。细胞反应异质性杜绝恶性转变的准确评估。MCF-7A3细胞il - 1选择灵敏度高β刺激,制服的趋化因子受体CXCR4的表达,和IL1-RI的稳定。结构变化、集落形成能力、扩散率,趋化作用,基底膜基质入侵,钙粘蛋白mRNA表达和蛋白质定位确定这些细胞和MCF-7亲代细胞il - 1的刺激下β。选择MCF-7A3细胞对il - 1显示统一回应β刺激增加入侵细胞的功能,如散射,集落形成、扩散、化学运动性和入侵。基底粘附蛋白mRNA的表达是更高,il - 1β细胞因子的刺激没有进一步的影响在早期暴露。在亲代细胞总钙粘蛋白水平保持不变,而水平下降,当MCF-7A3细胞成或分散。特里同x - 100可溶性和不可溶性钙粘蛋白比例在这些细胞高度增加,同时,在MCF-7pl细胞比率不能与形态学变化。MCF-7A3对il - 1细胞统一回应β允许特征变化的细胞因子诱导没有评估当使用异构细胞系。
1。介绍
乳腺癌是一个重要的全球公共卫生问题出现了高达120万多起有报道的病例和死亡的每年400000例。关于这一主题的研究,主要是进行在体外模型表明,乳腺上皮细胞容易接受管制的环境刺激的影响下的细胞周期。这种放松管制会导致细胞增殖和肿瘤的发展。发展为癌症恶性肿瘤发生在转化细胞迁移到其他组织和发展二次肿瘤。在转移的过程中,肿瘤细胞进行epithelial-mesenchymal过渡(EMT)允许通过组织和血管细胞迁移。EMT的出现,信息或cell-stroma癌细胞的连接中断后的离域分子连接的组件。移位的上皮钙粘蛋白等蛋白质标记desmoplakin,和ZO-1导致退化,而逐渐增加的间叶细胞标记,如N-cadherin波形蛋白和核β发生连环蛋白(1]。这些变化在分子标记肿瘤细胞的恶性程度相关(2和患者预后nonfavorable3,4]。慢性炎症在肿瘤微环境被认为是一个因素参与恶性肿瘤的几种类型的癌症的发展;此外,促炎细胞因子已经被提议作为重要的致癌电感,侵袭性和转移(5]。白介素1β(il - 1β)在乳腺肿瘤,和它的高表达的肿瘤微环境表明其在转移可能的作用[6,7]。最近在体外我们小组发布的工作证明乳腺上皮癌的不良入侵MCF-7细胞系获得一些特性的入侵表现型il - 1的刺激下β(8,9]。在这种情况下,损失等主要结构变化的信息接触,收购成细胞结构和细胞散射观察。此外,增加细胞的迁移和入侵细胞外蛋白矩阵发生与更高的CXCL12趋化因子受体的表达,趋化因子受体CXCR4。尽管如此,显著降低il - 1的钙粘蛋白水平β刺激细胞在不被察觉的情况下(8,9]。相比之下,以前的报告表明,侵袭性和转移与移位和损失的上皮细胞蛋白质标记在活的有机体内和在体外模型(10]。进一步研究使用乳腺癌和腹膜肿瘤细胞显示,钙粘蛋白损失,诱导IL -β需要一定的条件,如更高的培养基中葡萄糖的浓度或保持细胞subconfluent条件(11- - - - - -13]。最近,据报道,花生四烯酸促进EMT-like过渡nontumorigenic乳房MCF-10A细胞没有引起钙粘蛋白表达的变化(14]和侵入性乳腺癌细胞(mda - mb - 435)转染过度表现钙粘蛋白保留其侵入性表型(15]。上面的乳腺细胞il - 1的反应的差异β刺激可能是由于已知的癌症细胞系异质性和不稳定可能会阻碍使用这些细胞的解释结果。考虑这个问题,我们选择了一个MCF-7细胞亚群和il - 1敏感性增加β刺激和统一表达的趋化因子受体CXCR4受体分子,细胞迁移和恶性肿瘤的一个因素。我们的结果显示,超过90%的回应这群细胞因子刺激与制服,编程细胞形状的变化,散射、扩散、化学运动性、侵袭性与序列移位的上皮细胞膜,细胞质中的积累,其退化。Upregulation的钙粘蛋白mRNA表达nonselected MCF-7细胞il - 1 (MCF-7pl)β与早期的刺激时粘附在一些细胞开始分离的膜进入细胞质。然而,在这些细胞,刺激的反应是异构的,最初的增加钙粘蛋白mRNA水平随后降低,而蛋白质含量仍然没有变化。相反,在MCF-7A3细胞,钙粘蛋白mRNA表达在早期减少,降低蛋白质的只是明显约72 h。在以后的时代里,当大多数细胞,四散,钙粘蛋白mRNA水平显著下降,非常低水平的钙粘蛋白被发现。
尽管肿瘤是由不同的亚种群,引出一个特定的表型,我们的研究结果表明,选择癌细胞亚种群,对特定刺激的反应一致,可以可靠的策略来研究特定信号通路和微分阶段诱导il - 1β在表型转变为恶性肿瘤。
2。结果
2.1。选择MCF-7细胞对il - 1程序一致响应β刺激
趋化因子受体CXCR4受体的高表达的趋化因子CXCL12癌症细胞系侵袭性相关,恶性肿瘤,归航16]。低侵入性乳腺上皮癌MCF-7细胞不转移,尽管他们表达基础水平的趋化因子受体CXCR4 (17]。它已被证明在体外接触这些细胞的促炎细胞因子il - 1β诱发高表达的趋化因子受体CXCR4紧随其后的是惊人的细胞形态和行为模式的变化,像那些预计在细胞经历一个过渡到一个侵入性表型(8,9]。然而,这些变化不均匀的只有一小部分细胞群对细胞因子的刺激作出了回应。这种异质性,广泛培养中观察到癌症细胞系,已经受损的解释结果,导致争议(18]。寻找一个合适的方法来克服这个问题,MCF-7细胞后得到选择的分组人口的更高和统一表达的趋化因子受体CXCR4与il - 1刺激后β。为此,父母MCF-7细胞(MCF-7pl)与细胞因子刺激后48 h和排序用荧光标记anti-CXCR4抗体。第一轮选择显示,26%的细胞在一个数量级增加趋化因子受体CXCR4的表达上面的表达式显示nonstimulated细胞(图1(()),盒)。细胞表达高水平的趋化因子受体CXCR4被找到并受两轮的选择。最后选定的细胞,MCF-7A3(图1((b)),盒),由人口的43%,显示增加的趋化因子受体CXCR4表达接近两个数量级以上表达式MCF-7pl细胞中观察到。父母和选定的细胞被培养在相同条件下准备银行相同的细胞通道,用于所有的实验报告。在缺乏il - 1β,10%的MCF-7pl细胞表达趋化因子受体CXCR4的基线水平低,而77%的MCF-7A3细胞显示表达的受体高两个数量级(图1(B))。接触的细胞il - 1β24小时增加到82% MCF-7A3细胞受体的表达水平较高,但只有24%的MCF-7pl细胞。在48 h,几乎100%的MCF-7A3细胞对细胞因子的刺激,而回应MCF-7pl细胞的比例保持在26%。这时,刺激MCF-7A3细胞表达趋化因子受体CXCR4水平值超过一个数量级高于刺激MCF-7pl细胞。这些结果表明,所选MCF-7A3细胞亚群基线水平的趋化因子受体CXCR4表达不仅高于nonselected细胞,但选择的细胞对il - 1反应均匀β通过表达高水平的细胞表面上的受体。
2.2。表达的il - 1βMCF-7A3细胞受体
对il - 1受体IL-1RIβ在许多类型的真核细胞表达。绑定的il - 1β这种受体激活细胞外领域的几个信号通路(19,20.]。我们先前的研究与nonselected MCF-7细胞表明il - 1β激活信号通路诱导引人注目的肌动蛋白细胞骨架重组的细胞形状的变化和增加活性(8]。这些结果和观察到的增加在这些细胞趋化因子受体CXCR4的表达,也引起他们的接触il - 1β(9),建议IL-1RI表达式可以通过il - 1进行调制β,在人类颗粒淋巴细胞(21]。因此,我们评估的表达IL-1RI MCF-7pl MCF-7A3细胞,nonstimulated和il - 1β刺激条件。细胞被贴上anti-IL1-RI抗体和FITC标记。荧光强度和阳性细胞的数量通过流式细胞仪测定。如数据所示1(C (a))1(C (b)), MCF-7pl MCF-7A3细胞有类似的基底的表达IL-1RI nonstimulated条件下在细胞表面。然而,当与il - 1细胞被刺激β48 h, MCF-7pl细胞失去了从他们的表面受体的抗体荧光降低近一个数量级,而MCF-7A3细胞。在分析相对应的平均荧光强度IL1-RI呈现在细胞表面,在MCF-7pl细胞减少了大约9倍,而在MCF-7A3细胞,仅下降了1.19倍。这些结果表明,il - 1β可能移植受体的表达在MCF-7A3细胞或诱导其更快的回收。
2.3。增强细胞散射和MCF-7A3细胞的集落形成
证明了不同灵敏度的MCF-7A3和MCF-7pl细胞il - 1β刺激,这些细胞的能力接受上皮形态的变化和散射形成的殖民地,如预期的那样从细胞表型转换,分析nonstimulated和il - 1β刺激细胞48 h。如图2(()),MCF-7pl与典型的上皮细胞生长形成紧凑的殖民地彼此密切接触的多边形形状。一些细胞,在殖民地的边界,显示成形状和质量已经远离殖民地。相比之下,殖民地由MCF-7A3细胞(图2((b)))不紧凑,他们没有显示与邻近细胞紧密接触,和他们中的很多人已经离开了父母的殖民地,单独或成群。当MCF-7pl与il - 1细胞被刺激β48 h,更被分散成细胞从殖民地的边界和显示细胞质预测暗示迁移表型(图2((c))),由我们组之前报道(8]。这些结构性变化显然是明显的绝大多数MCF-7A3与il - 1细胞的刺激β(图2(B (d)))。此外,在这些文化中,许多小卫星殖民地接近大殖民地观察(图2((e)),箭头)。在一些剩余的殖民地,细胞被认为在互相分离的过程(图2((f)),箭头)。这些结果表明,il - 1的选择分组人口统一回应β感应的结构性变化。
观察到的差异形成的殖民地提出的两种类型的细胞可能与更高的容量MCF-7A3细胞对il - 1β。因此,第一种方法,我们评估这些细胞形成的殖民地的能力。MCF-7pl MCF-7A3细胞被播种在非常低的密度(200细胞/ 100毫米)和培养获得明确的殖民地。殖民地的数量在每道菜前后il - 1计算β刺激。缺失的细胞因子,MCF-7A3细胞的数量会增加高于2倍殖民地上形成由MCF-7pl细胞(图2(B))。与il - 1刺激后β48 h, MCF-7A3细胞显示出进一步提高三倍比亲代细胞(图2(B))由于数量的增加卫星殖民地形成这些文化(数字2((e))2((f)))。量化的殖民地MCF-7A3细胞,含有分散细胞与il - 1刺激后β显示,96%的人包含这种类型的细胞,而MCF-7pl文化只包含56%。这和上面的数据显示一个明确的增加在MCF-7A3细胞的数量激增,从最初il - 1后形成的殖民地β刺激而MCF-7pl细胞和建议MCF-7A3细胞均匀激活迁移和扩散机制,而nonselected细胞对il - 1反应不均匀β。
2.4。MCF-7A3细胞的增殖率更高
为了测试il - 1β刺激细胞增殖,增加subconfluent文化MCF-7pl MCF-7A3细胞(5000细胞/ 60毫米板)和il - 1刺激β和培养96 h。24、48、72和96 h, calcein-AM添加新鲜媒介2 h。文化不是暴露于il - 1平行β维持在相同条件下与荧光染料也孵化。发出的荧光钙黄绿素(只由活细胞处理)在每个条件由氟量计和量化值获得归一化值在零和插值控制曲线准备决定细胞的数量对应于建立荧光值。图2(C)表明,MCF-7pl细胞增殖率缓慢增加达到一个值2倍在48 h与il - 1刺激时β。相比之下,MCF-7A3细胞的细胞因子刺激增殖率增加到3.5倍(图在同一时间2(C))。当细胞培养也获得了类似的调查结果在同一条件计入纽鲍尔钱伯斯(没有显示)。这些结果表明,尽管il - 1β刺激诱导MCF-7pl细胞的增殖率大幅提高,在MCF-7A3细胞,诱导增幅高出3.5倍。
2.5。MCF-7A3细胞趋化性和侵袭性增加
MCF-7细胞已被列为低侵入性肿瘤细胞(22];然而,以前在其他研究证明il - 1β刺激他们获得迁移和侵袭性特征;刺激细胞走向趋化因子CXCL12梯度和侵入细胞外基质蛋白(8,9]。评估可能的趋化性和入侵MCF-7pl和MCF-7A3细胞之间的差异,他们与il - 1刺激β24、48和72小时之前被播种在Transwell迁移单位无血清培养基,并允许24 h迁移到众议院的单元包含相同的介质与CXCL12补充。通过8细胞迁移μ米孔隙过滤器,把上部和较低的房间,固定了PFA和DAPI染色。染色细胞核的数量在每个滤波器计算在数字图像获得的10个随机选择的字段在每个实验条件。图3(一)描述了在不同的时间核的细胞迁移。数据3(())和3((b))显示,一些MCF-7pl或MCF-7A3细胞迁移nonstimulated条件。Prestimulation与il - 1β诱导趋化性逐渐增加(数据3((c))3((d)))在MCF-7A3更高的细胞和达到最大值之前暴露于il - 1β48 h(数字3((e))3((f)))。以前接触il - 1β72 h,然而,并没有走向CXCL12增加细胞的数量,但它大大降低(数字3((g))3((h)))。后者结果可能可以解释,因为细胞已经在没有血清的培养基对很多小时或由于趋化因子可能是灭活后长时间细胞迁移试验所必需的。箱形图在图3(B)显示趋化性的量化结果从三个独立的实验。
测定了细胞的入侵能力相同类型的房间,覆盖一层人工基底膜的过滤。prestimulation后il - 1β24、48、72 h MCF-7pl MCF-7A3细胞被转移到参议院无血清培养系统包含新鲜培养基没有il - 1β并允许为36 h入侵蛋白质层。的细胞达到较低的一侧的过滤器被算作表示趋化性分析。图3(C)显示representative-acquired细胞入侵人工基底膜的图像在不同的时间,可以欣赏更多MCF-7A3细胞在基底条件比MCF-7pl入侵基底膜基质细胞(数字3(C (a))3(C (b)))。侵袭性之前MCF-7A3细胞暴露于il - 1β24小时没有进一步增加(数据3(C (C))3(C (d)))。当细胞获得的最高价值是先前刺激48 h(数字3(C (e))3(C (f)))。长时间没有增加侵袭性细胞因子刺激下,否则(数字3(C (g))3(C (h)))。观察到的减少的原因可能是同样的已经迁移化验。箱形图在图3(D)显示量化侵袭性的三个独立的实验。这些结果表明,MCF-7A3细胞对il - 1反应更有效β刺激通过显示趋化性增加CXCL12和增加蛋白质降解细胞外基质的能力,尤其是在接触48 h il - 1β。
2.6。钙粘蛋白的表达在MCF-7A3细胞信使rna和蛋白质
第一个变化,一直在观察nonselected MCF-7与il - 1细胞的刺激β相邻细胞之间接触的损失和非局部化的蛋白质形成细胞间连接(8,23]。当连接紊乱,形成的蛋白质也杂乱无章,搬迁,或退化。假定在EMT,钙粘蛋白丢失和取代N-cadherin获得间充质细胞的表型(24]。然而,当这个替换发生和钙粘蛋白被替换或退化尚未明确。最近的报告表明,这两种类型的钙粘蛋白可以同时表达细胞,N-cadherin不存在在所有入侵癌细胞(15,25]。此外,有矛盾的报道移位细胞膜的钙粘蛋白,其一生在细胞质中,降解,其可能进入细胞核(10,15,25]。分析如果选择的细胞可能是一个合适的模型来确定时间和序列的分子变化导致过渡到一个侵入性表型,MCF-7A3细胞被用来衡量钙信使rna和蛋白质水平的表达il - 1之前和之后β刺激。定量rt - pcr结果图4(一)表明,钙粘蛋白mRNA表达MCF-7pl与il - 1刺激后细胞迅速增加β并在24小时达到最高水平。表达式仍然没有显著变化,直到72 h,显著减少96 h。相比之下,基线水平的钙粘蛋白mRNA表达MCF-7A3已经高出4倍,保持48 h慢慢减少2倍在96 h。
从IL-I免疫印迹分析蛋白质β刺激MCF-7pl MCF-7A3细胞提取并没有透露重要MCF-7pl总钙含量的变化,然而,在MCF-7A3细胞,减少启动之前72 h在96 h(图变得清晰明显4(B))。这些实验还表明,所有在场的蛋白质在细胞实验条件下采用粘附在细胞与蛋白质的成熟形式(120 kDa),这是一个产品的处理N-glycosylated前体(130 kDa)。损失的钙粘蛋白表达被认为是癌细胞发展成恶性肿瘤的一个重要标志(26)等几种机制激活protooncogenes调解钙粘蛋白的磷酸化来标记它后降解去除从细胞膜进入胞浆27]。探索是否il - 1β细胞质中钙粘蛋白的诱导易位,特里同x - 100可溶性和不可溶性亚细胞从il - 1分数了吗β刺激MCF-7pl和MCF-7A3细胞。可溶性和不可溶性细胞提取分离,涂抹,挑战anti-E-cadherin抗体。图4(C)显示了归一化光密度量化这些细胞钙粘蛋白的亚细胞获得的分数在不同的时间下与细胞因子的刺激。在MCF-7pl细胞的比例Triton-soluble钙粘蛋白/ Triton-insoluble钙粘蛋白略有增加在24 h和减少比例接近1:1在稍后时间。然而,这两个分数并没有显著的区别。在il - 1β刺激MCF-7A3细胞,增加近2倍是注册在可溶性钙粘蛋白保持48 h,然后慢慢下降到非常低的水平在96 h,一个时间Triton-insoluble钙粘蛋白也大幅下降。钙粘蛋白的亚细胞分布的差异显然MCF-7A3细胞的观察表明,新合成的钙粘蛋白的可溶性形式并保持在同样的水平的不溶性钙粘蛋白至少72 h。经过这一次,它是退化的不溶性形式,表明钙粘蛋白mRNA表达可能是由离域钙粘蛋白在细胞的水平。为了进一步探索钙粘蛋白的细胞定位,il - 1β刺激细胞,关联与mRNA表达和蛋白质含量在不同时期,不同条件下细胞与anti-E-cadherin抗体固定和染色。一群MCF-7pl细胞(图4(D (a)))显示普通多边形细胞边界相互密切联系和钙粘蛋白只局限于外围(箭头)。后il - 1β刺激(图4(D (b))4(D (e))),蛋白质是分散细胞的细胞质中发现了一个不同的形态,不过仍存在于细胞的边缘相互保持联系(箭头)。图4(D (c))显示了一个殖民地MCF-7A3细胞钙粘蛋白是本地化的外围只有那些细胞在与他们的邻居密切接触,而在许多细胞脱离殖民地和收购了一个扩展的形状,占据更大的区域(箭头所指),钙粘蛋白主要定位在细胞质中。在殖民地的中心,聚集细胞显示上皮细胞外围本地化。刺激MCF-7A3细胞il - 1β诱导大细胞形态学的变化,可以看到许多延长细胞钙粘蛋白是显示在细胞质中,偶尔在膜中细胞之间还连接或胞质颗粒小,拴在细胞膜(数字4(D (D)),4(D (e))4(D (f)))。这些结果显示明显关联时间之间的粘附蛋白退化发生在细胞和其他进程(暗示细胞过渡到一个侵入性表型)发起的。此外,他们显示精确计时的il - 1诱导的几个现象β刺激可以确定,特别是瞬态变化,如预期的那样在一个动态的转变发生在一个相对短的时间内。
3所示。讨论
乳腺癌是一种复杂的疾病表现出不同的组织病理学特征,遗传和基因组变异,其预后的差异。出于这个原因,没有一个单独的模型,简要概括疾病的阶段和乳腺癌细胞系被广泛用于研究调查细胞迁移、增殖、凋亡;都是过程,成为肿瘤恶化[期间不受监管的28,29日]。尽管许多见解对于癌症恶性肿瘤的发病已经获得使用细胞系,这些可以进行基因型的变化在文化和一段时间后往往加剧了不同的亚种(29日- - - - - -31日]。因此,目前使用的许多细胞系不同类地回应一个特定的刺激,使解释和比较的结果非常困难。
许多研究表明,在大多数肿瘤的微环境,一些细胞感受器和炎症介质存在(5]。其中,高水平的促炎细胞因子il - 1β已经与入侵,血管生成和促进恶性肿瘤(6]。在乳腺癌中,高水平的il - 1β也与侵略性的肿瘤和高复发的患者(32]。
最近,我们的团队已经证明贫穷上皮乳腺浸润性癌的风险敞口MCF-7细胞il - 1β产生一种肌动蛋白的成形态和重排模式Rac1信号通路的激活;与特定的分子变化,提升细胞散射,迁移和入侵8]。额外的il - 1诱导的分子变化β刺激,分泌增加metalloproteases和增加,表达的趋化因子CXCL12受体,也报道,趋化因子受体CXCR4 (9]。在目前的工作中,这种受体的高表达是利用父母的选择标记获得分组人口MCF-7细胞可以以一种统一的方式回应il - 1的刺激β获得一个清晰的评估il - 1的强度和时间β全身的和/或激活流程;这个日期仍有争议。
MCF-7亲代细胞保持自然上皮表达特定的分子标记层如钙claudins和ZO-1等蛋白质,构成了细胞间连接。这些结构都必须保持结构完整性和描述正常上皮细胞的屏障功能22,29日]。评估选择MCF-7A3细胞亚群表明他们对il - 1的反应β刺激明显更高和更均匀的异构MCF-7pl细胞。这些特性是保持至少在五个文化通道。响应的增加可以解释观察到稳定的MCF-7A3细胞表面的受体IL-1RI水平,这将提供更多机会的绑定和激活细胞因子的信号机制。
在il - 1诱导的细胞过程βMCF-7A3绝大多数的细胞包括分离和散射的细胞从最初建立殖民地和二级或卫星殖民地的形成,所有这些都包含细胞彼此没有严格遵守。不同组织细胞之间在这些殖民地赋予MCF-7A3细胞分开他们的邻居更高的能力,改变形状,远离殖民地。殖民地由MCF-7A3细胞的数量越高,更高比例的殖民地一起包含分散细胞il - 1β刺激,建议可能与更高的增殖率的相关性。相当大的增加细胞的数量与荧光标记calcein-AM注册为接触il - 1β支持发展随着时间的推移,MCF-7A3细胞的增殖率增强了细胞因子刺激。
趋化性由il - 1的显著增加β对趋化因子CXCL12 MCF-7A3细胞中,已知靶器官的浸润性乳腺细胞分泌细胞和被认为是恶性肿瘤恶化的标志33),可以直接与趋化因子受体CXCR4的增加水平和较高的稳定的IL-1RI注册后,这些细胞il - 1β。此外,更高的ECM分解蛋白质MCF-7A3细胞入侵期间人工基底膜层可以解释为蛋白酶分泌增加MMP2和MMP9的介质刺激细胞,这种现象已经报道发生在MCF-7细胞刺激与il - 1β(8]。所有这些收购或增加功能和活动与il - 1 MCF-7A3细胞的刺激β在场的绝大多数,所以结果是代表选中的人口,而不是一个统一回应不同的反应,与异构癌症细胞系。获得额外的证据使用选定的细胞群所提供的优势像mcf - 73细胞,这些都是用来衡量钙粘蛋白mRNA表达和蛋白质含量与il - 1细胞的刺激β不同长度的时间。钙粘蛋白经常报道非定域化的膜和转译后的修改在癌转移性细胞。它放松管制在乳腺癌的进展与不良预后相关(34]。我们的研究结果表明,钙粘蛋白基线mRNA表达已经高MCF-7A3细胞与基线水平相比MCF-7pl细胞。高表达水平与il - 1刺激后维护β至少48小时,虽然总钙粘蛋白的水平差异不显著。蛋白质的亚细胞分布分数显示,特里同比例x - 100可溶性分数。在细胞在这些条件下,钙粘蛋白被集中在分散细胞的细胞质膜剩余几个连接细胞间,如细胞图所示4。这些结果表明,钙粘蛋白mRNA在MCF-7A3稳定和il - 1的刺激β,导致积累可溶性蛋白质在细胞质中,调节钙粘蛋白mRNA表达。一旦细胞质中的钙粘蛋白的总蛋白质含量开始下降72 h后,信使rna的表达也下降和特里同x - 100可溶性蛋白质的比例迅速下降的不溶性蛋白质在细胞。相反,在MCF-7pl细胞总蛋白质含量仍没有显著变化96 h和细胞保持1:1的比例soluble-insoluble蛋白质,虽然72 h后钙粘蛋白mRNA水平明显下降。如先前的报道所示,非定域化的绒毡层细胞质中钙粘蛋白是退化的10]。我们目前的研究结果显示蛋白质的损失,发生在MCF-7A3 il - 1的影响β刺激措施;说明降解机制被激活钙粘蛋白的积累在稍后的时间在细胞质中。过渡到一个侵入性表型显然需要激活的其他机制,其中许多目前正在调查几组,超出了目前的工作范围。
目前的研究主要集中在初始阶段的过渡后il - 1的顺序变化引起的β一致反应的细胞群,已经证实il - 1的重要作用β。我们还表明,非可行性区分反应和异构nonresponding细胞的细胞群阻碍的可能性达到一个适当的解释,已经被Uchino优雅表示和讨论和合作者(31日]。MCF-7A3细胞对il - 1显示统一回应β刺激,使精确的形态学特征、生化和功能差异cytokine-stimulated细胞。可以建立时间和启动之间的相关性和激活的事件发生在细胞开始过渡到更高的侵袭性,无法评估在异构的细胞系。尽管目前的方法不能被认为是乳腺癌的一个模式,它提供了一个优势研究癌细胞的反应和行为。特别是,一个刺激的影响,与促炎细胞因子il - 1一样β,它将很难分析和解释在异质种群。然而,使用选定的人口呈现严重的缺点,要记住很重要。在一个肿瘤,形成鲜明对比在体外细胞模型,不仅是异构的,但是他们都沉浸在多样的生态系统,与其他细胞间通信,许多信号可以参与决定肿瘤表型和癌症进展(35]。
4所示。材料和方法
4.1。细胞培养
MCF-7细胞系是写明ATCC(弗吉尼亚州纳娑)获得。细胞培养在DMEM-F12 1: 1 (v / v)补充10%胎牛血清的边后卫。实验6×103细胞/厘米2被播种文化菜肴和培养48 h。然后,文化与PBS洗和转向dmem - f12 - 1%的边后卫18 h。经过这段时间的血清饥饿、文化转向DMEM-F12无血清,补充了20 ng / mL的il - 1β有限公司,培养不同时间的5%2和37°C的气氛。
4.2。流式细胞术
MCF-7细胞收获的pbs - 0.5% EDTA在30分钟37°C。细胞悬液被三次冰冷的pbs - 2%在1500 rpm的边后卫和离心5分钟。之后,细胞被孵化与PBS冰补充2%的边后卫和16.5μ人类免疫球蛋白g /毫升(Pisa laboratorio瓜达拉哈拉(墨西哥)。细胞被挑战的抗体:鼠标反趋化因子受体CXCR4(圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯,CA),或山羊反IL-1RI(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,明尼苏达州)60分钟在4°C。二次抗体是FITC-labeled anti-mouse免疫球蛋白和抗体FITC-labeled免疫球蛋白(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。流式细胞术进行了正欲在FACScalibur (Becton Dickinson,山景,CA),排序的细胞用MoFlo高性能细胞分选仪(贝克曼库尔特,沥青,CA)。数据分析软件v5.1峰会。
4.3。细胞增殖实验
细胞培养的密度在96 -孔板5×103细胞/厘米2。血清剥夺后,细胞被传递给DMEM-F12中补充了20 ng / mL il - 1β。细胞培养2 h与膜渗透荧光染料calcein-AM (1μM,英杰公司)作为细胞增殖标记在时间为零,在24和48 h后细胞因子刺激。发出的荧光细胞内化和加工calcein-AM测量在Biotek协同HT荧光计(Winoosky VT)在485 nm波长激发和发射520海里。Calcein-AM-derived荧光与活细胞的数量在每个插值中的值标准曲线。
4.4。趋化性和入侵检测
文化MCF-7细胞后24、48和72 h il - 1β刺激与pbs - 0.05% EDTA,收获和105个细胞被播种的内室Transwell单位(康宁墨西哥,圣尼古拉斯,墨西哥)填满DMEM-F12自由血清。的外室Transwell单元加载与血清DMEM-F12补充100 ng / mL CXCL12化学引诱物。细胞被允许迁移为24小时37°C。包含细胞迁移的多孔膜通过它被从内部钱伯斯和3.4%多聚甲醛固定(PFA) 30分钟。固定细胞permeabilized pbs - 0.2% Triton x - 100与DAPI染色。膜被安装在Vectashield(向量实验室,伯林盖姆,CA)。细胞迁移的速度在每一个条件是评估通过计算荧光核随机选择10个领域的膜。MCF-7细胞侵袭性的测量以类似的方式,但使用Matrigel-covered聚碳酸酯过滤器作为入侵细胞降解的底物和使用无血清DMEM-F12介质在众议院没有CXCL12和让细胞穿越基底膜基质36 h。
4.5。定量基因表达分析
从细胞培养试剂盒(提取的总RNA表达载体;卡尔斯巴德,CA)。总RNA被使用上标转换为cDNA II工具包(表达载体)。定量rt - pcr进行使用由于“快速上手”项目SYBR绿色大师(火箭)(罗氏应用科学;美瀚,德国)实时7000热循环(应用生物系统公司;卡尔斯巴德,CA)。列出特定寡核苷酸上皮和家政rplp0基因在网上补充材料(见表S1http://dx.doi.org/10.1155/2012/609148通过使用2)相对表达水平计算−ΔΔCt方程。
4.6。sds - page及免疫印迹
蛋白质提取得到溶解细胞解决方案包含50 mM Tris-HCl pH值,7.5,5毫米EDTA, 150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学美瀚、德国),1毫米氟化钠,钠原钒酸盐和1毫米。蛋白质提取是用采用3脉冲10 s振幅40%,,在12000转离心后3分钟,上层的恢复。30微克每车道的蛋白质被加载,在10% sds - page分离,在硝化纤维膜涂抹。阻塞后tbs - 0.1%渐变20 - 6% BSA膜与anti-E-cadherin挑战抗体(圣克鲁斯生物技术)。加载控制,反β肌动蛋白抗体(请提供的j·m·埃尔南德斯博士;CINVESTAV-IPN、墨西哥)是利用。HRP-conjugated二级抗体都从σ(圣路易斯,密苏里州)。积极的乐队被增强化学发光显示。特里同x - 100不溶性和可溶性细胞分数准备之前报道(36)和分离、玷污和挑战与anti-E-cadherin抗体完成总蛋白提取。
4.7。免疫荧光
所有的细胞都准备免疫荧光检测作为MCF-7细胞被描述在以前的报告从我们组8,9]。钙粘蛋白的抗体是一样的一个用于西方的屁股,但利用1:50稀释。第二抗体是一个anti-mouse免疫球蛋白和FITC标记用于1:200稀释。图像是用一个奥林巴斯第九50倒置荧光显微镜。所有图像都采用LC收购计划FL 40 x客观和软件Image-Pro + (v.5.0)从媒体控制论(马里兰州银泉)。
4.8。统计分析
Mann-Whitney测试比较两个数据组和克鲁斯卡尔-沃利斯检验三个数据组的选择分析统计差异。数据提出了均值+ / -标准差或中值和范围。设置有统计学差异值等于或低于0.05。每个结果代表了至少三个独立的实验。
确认
作者感谢m . c . Dominguez-Robles e·佛朗哥诉罗萨莱斯和a . Trejo技术援助。这部分工作是支持CONACyT(墨西哥)批准号79765我就e·a·Perez-Yepez和a . m . Reveles-Espinoza CONACyT博士前的家伙(号。235080年和219102年,分别地)。