文摘
Auraptene正在调查其chemopreventive效应在许多模型的癌症包括皮肤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌。许多行动的机制包括抗炎、抗增殖和凋亡的影响正在建议auraptene chemopreventive属性的。我们以前所示N-methylnitrosourea诱导乳腺致癌作用模型,饮食auraptene (500 ppm)显著推迟肿瘤延迟。延迟时间与肿瘤的细胞周期蛋白D1蛋白表达显著减少肿瘤。由于细胞周期蛋白D1是细胞周期的主要监管机构,我们进一步研究了auraptene对细胞周期的影响,在MCF-7细胞与细胞周期相关的基因。在这里,我们表明,auraptene显著抑制igf - 1刺激MCF-7细胞S期的细胞周期,显著改变了许多基因的转录参与细胞周期。
1。介绍
乳腺癌是女性最常见的癌症之一在美国。估计2012年乳腺癌226870例新病例和39510例死亡由于女性乳腺癌[在美国1]。除了发病率和死亡的女性,乳腺癌发病率的2190例新病例和410例死亡,预计2012年在男性(1]。目前的治疗方法有严重的副作用包括子宫内膜癌,毒性,白血病,血液凝块,恶心、呕吐,1]。因此,化学预防的癌症可能是一个更好的策略。
癌症化学预防的理念得到了更多的关注因为乳腺癌的推广阶段通常是一个漫长的过程,可能是可逆的2]。许多天然产物在研究预防癌症包括乳腺癌。其中之一是auraptene从柑橘类水果3]。先前的研究与其chemopreventive auraptene显示效果在许多癌症的啮齿动物模型包括结肠(4- - - - - -7),食管(8],舌头[9),肝脏(10,11)和皮肤(3]。我们的研究证明了chemopreventive auraptene对乳腺癌的影响(12]。这些研究在人类乳腺癌细胞株mda - mb - 231和柑橘auraptene MCF-7表示anti-proliferative效应。随后一个在活的有机体内研究表明,饮食auraptene饮食(500 ppm)减少乳房癌发病率和延迟时间肿瘤中值N-methylnitrosourea (MNU)治疗大鼠。高效液相色谱法分析auraptene治疗大鼠的乳腺组织中检测到auraptene低μ浓度在200年和500 ppm剂量(12]。
许多机制归因于chemopreventive auraptene的影响。他们包括聚胺合成的抑制9,13),感应解毒酶(14,15),诱导细胞凋亡(3,16),抑制金属蛋白酶(17,18,抑制胆固醇酯化(19)等等。最近,麦地那和他的同事报道,auraptene调节基因的转录控制下雌激素(19]。在我们的在活的有机体内研究中,大鼠的乳腺组织的进一步分析表明,细胞周期蛋白D1蛋白显著减少在auraptene 500 ppm对待动物(12]。细胞周期蛋白D1是一个关键的调节蛋白在细胞周期(图1)。细胞周期蛋白控制G1型年代过渡过程中细胞周期以及细胞周期蛋白[e20.]。在多达50%的原发性乳腺癌细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白的过度表达已经观察到(20.]。因此,细胞周期蛋白D1的过表达在人类乳腺癌的癌基因。细胞周期蛋白D1过度主要是雌激素受体阳性乳腺癌,这是一个主要的人类乳腺癌亚型(20.]。
从细胞周期蛋白D1蛋白表达减少auraptene治疗大鼠的乳腺组织中,我们探讨了auraptene对细胞周期的影响在人类乳腺癌细胞系MCF-7,雌激素受体阳性的。结果进一步证实了抑制机器auraptene对细胞周期的影响。
2。材料和方法
2.1。化学物质
Auraptene购买从LKT实验室Inc .(圣保罗,明尼苏达州)。重组人类igf - 1是来自Peprotech Inc .(落基山,新泽西)。
2.2。细胞培养
人类MCF-7乳腺腺癌细胞从写明ATCC购买(弗吉尼亚州马纳萨斯)。这些细胞被种植在无菌湿室保持在37°C和5%的公司2:95%的空气。MCF-7细胞生长和传播在完整的DMEM培养基。
2.3。细胞周期分析
的影响auraptene在MCF-7细胞细胞周期进行了研究。简单地说,1×106细胞被镀在八个菜10厘米,每组重复的菜。有四组:控制(DMSO), igf - 1, igf - 1 + auraptene, auraptene。细胞是电镀的血清饥饿的第二天。22 h血清饥饿后,igf - 1 + auraptene auraptene只使用10组μM auraptene在DMSO (0.1% v / v)。控制和igf - 1组收到车辆。在血清饥饿24小时,只igf - 1和igf - 1 + auraptene组收到10 ng / mL的igf - 1。8 h和24小时的igf - 1治疗后,这些细胞被收获,离心机,上层的删除。丸是然后用冰冷的PBS洗两次。这些细胞被计算,然后用冰冷的70%乙醇固定和保存在4°过夜。第二天,细胞被离心机,乙醇被和细胞与冰冷的PBS洗两次。然后,每个管500μL propidium碘加入了混合溶液(propidium碘溶液混合是通过添加10准备的μ股票L Triton-X 100(10%), 200年μL 10毫克/毫升的核糖核酸酶解决方案,和400年μL(0.5毫克/毫升propidium碘溶液10毫升PBS)和在室温下孵化30分钟,其次是使用流式细胞仪分析细胞周期。实验重复3次。流式细胞仪进行使用BD LSRII (BD生物科学)研究LSUHSC-Shreveport核心设施。488海里的仪器有一个连贯的蓝宝石激光激发,633 nm激发JDS Uniphase HeNe激光器,以及一个连贯的VioFlame 450 nm激发。数据分析与流式细胞仪女主角(BD生物科学)和ModFit LT软件(验证软件的房子)。
2.4。中存在
存在数组做是为了分析细胞周期相关基因的基因表达变化auraptene。对于这个实验,1×105细胞被镀在八个菜6厘米,每组重复的菜。有四组:控制、igf - 1, igf - 1 + auraptene, auraptene。细胞是电镀的血清饥饿的第二天。在22 h血清饥饿,igf - 1 + auraptene auraptene只使用10组μM auraptene在DMSO (0.1%, v / v)。控制和igf - 1组收到车辆。在血清饥饿24小时,只igf - 1和igf - 1 + auraptene组收到10 ng / mL的igf - 1。8 h和24小时的igf - 1治疗后,这些细胞被处理为RNA隔离按照制造商的指示(试剂盒,RNeasy minikit)。实验进行了一式三份。孤立的RNA DNAse处理以消除任何基因污染按照制造商的建议协议(Promega)。DNA自由RNA然后在安捷伦分析仪分析质量。确认后的质量RNA, 1μRNA的g转换为互补脱氧核糖核酸的方向从制造商(量子生物科学)。1:10稀释cDNA用于放大与正序连赢SYBR绿色快速混合智商(量子生物科学)PCR数组(托克斯人类细胞周期和癌症96 StellARray qPCR数组,Lonza)。所有实验的结果进行了分析使用全球模式识别软件从巴尔港生物技术,可用Lonza网站上(http://array.lonza.com/stellarrays/)。实验重复3次8 h也在24 h后IGF治疗。探地雷达褶皱的变化被认为是重要的。
2.5。统计分析
细胞周期的分析数据是由单向方差分析其次是图基/克雷默事后测试,。从数组中存在研究结果进行了分析与全球Lonza网站上可用的模式识别软件(http://array.lonza.com/stellarrays/),。
3所示。结果
3.1。没有显著变化的百分比在S期细胞igf - 1 8 h后治疗
8 h的igf - 1治疗后,收获细胞由流式细胞分析仪来分析细胞的百分比在细胞周期的不同阶段(图1和表1)。大多数在G1期细胞对照组(92%),和没有明显差异的百分比之间的G1期细胞治疗组。igf - 1并没有产生任何显著增加细胞的S期细胞的比例周期8 h和无显著减少auraptene治疗细胞S期被发现。细胞G2的比例控制和治疗组也几乎相同。auraptene在细胞周期的影响igf - 1的缺席没有不同于对照组8 h。同样,没有明显的差异在G1 / G2的比率。
3.2。Auraptene显著降低S期细胞的比例经过24小时的igf - 1治疗
igf - 1治疗24小时后,收获细胞由流式细胞分析仪来分析细胞的百分比在细胞周期的不同阶段。igf - 1治疗导致显著降低的G1期细胞比例相比,所有其他的组织控制的87%到46% igf - 1治疗组(图2和表2)。有相应增加的百分比在S期细胞igf - 1治疗组在对照组(从10%到57%的igf - 1治疗组)。Auraptene预处理显著降低的百分比在S期细胞igf - 1细胞和治疗似乎恢复细胞G1的控制水平。auraptene在细胞周期的影响igf - 1的缺席没有不同于对照组24 h。同样,没有明显的差异在G1 / G2的比率。
3.3。Auraptene预处理MCF-7治疗的igf - 1细胞显著调节多个基因参与细胞周期调控,而igf - 1单独治疗细胞igf - 1 8 h后治疗
在表3基因转录水平的显著变化,auraptene预处理仅在igf - 1细胞相比,igf - 1治疗治疗细胞8 h时间点所示。在9基因有重大改变,6表达下调和3调节的。表达下调基因E2F1(E2F转录因子1),CDC45L(细胞分裂周期45同族体),E2F2(E2F转录因子2),MCM3(3)minichromosome维护复杂的组件,MCM6(6)minichromosome维护复杂的组件UHRF1(ubiquitin-like博士和无名指域1),调节基因包括CDKN2B(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2 b),DDIT3(DNA-damage-inducible记录3)小君(小君致癌基因)。igf - 1单独治疗导致增加的只有2基因的转录,MCM6和ORC1L(来源识别复杂,亚基1)细胞复制的关键调节因素复杂。
3.4。Auraptene预处理MCF-7治疗的igf - 1细胞显著调节多个基因参与细胞周期调控,而igf - 1单独治疗细胞igf - 1治疗24小时后
在表4基因转录水平的显著变化,auraptene预处理仅在igf - 1细胞相比,igf - 1治疗治疗细胞24小时时间点所示。有14个基因显著改变。十个基因表达下调而4调节。表达下调基因CDC45L(细胞分裂周期45同族体),CDC2(细胞周期蛋白依赖性激酶1),CCNA2(细胞周期蛋白A2),KIF20B(驱动蛋白家族成员20 b),CHEK1(CHK1检查点同族体),CDKN2C(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2 c),CHEK2(相关的检查点同族体),E2F1(E2F转录因子1),UHRF1(ubiquitin-like博士和无名指域1),和CCNB2(细胞周期素B2)。调节基因DDIT3(DNA-damage-inducible记录3),CDKN2B(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2 b),GADD45A(增长逮捕和DNA-damage-inducibleα),DUSP1(双特异性磷酸酶1)。E2F1, CDC45L, UHRF1, DDIT3, CDKN2B调制在8 h和24小时。
4所示。讨论
在这里,auraptene对细胞周期的影响,描述了基因在哺乳动物细胞周期。这个研究发现auraptene抑制作用的细胞周期蛋白D1蛋白表达在MCF-7细胞和大鼠乳腺肿瘤。我们之前在MCF-7显示细胞10μM auraptene减少了细胞周期蛋白D1蛋白表达与igf - 1治疗后40%。在随后的动物研究中,在500 ppm剂量auraptene饮食显著延迟时间肿瘤相比只MNU组。从auraptene 500 ppm组大鼠乳腺肿瘤显示,细胞周期蛋白D1蛋白表达显著减少(12]。自细胞周期蛋白D1是一个关键的调节蛋白在细胞周期G1 / S过渡(21),我们假设auraptene会抑制细胞周期的进展。据我们所知这是第一个研究显示的详细auraptene对igf - 1诱导刺激乳腺癌细胞株细胞周期。Auraptene显著降低S期细胞的比例在24小时的时间点。并没有观察到这种效应8 h时间点,即使auraptene减少在MCF-7 8 h后细胞周期蛋白D1的表达式(12]。这可能是由于这样的事实,抑制细胞周期蛋白D1的早期事件,后来导致减慢细胞周期的进展。igf - 1的促有丝分裂的活动并不是在8 h,由于没有显著增加的S期细胞比例相比,控制细胞。在24 h,显著增加在S期细胞的比例被观察到。相应地,显著减少的百分比的G1期细胞igf - 1只。igf - 1是用来刺激血清饥饿MCF-7细胞因为igf - 1已被证明是在老鼠处理高浓度MNU [22),也就是致癌物auraptene(我们在老鼠中使用研究12]。igf - 1水平升高还发现在人类乳腺癌患者(23]。肥胖女性,乳腺癌绝经后,风险也较高的血igf - 1水平(24]。它可能是有趣auraptene在存在其他的有丝分裂原的影响。
auraptene预处理后,在当前的研究中我们看到了与时间有关的变化与细胞周期相关的转录机械以及抑制S期。8 h时间点,重大的改变在9基因和观察24小时14个基因。在这些基因中,4个基因的褶皱变化时间点。因此,从这些基因仍转录减少的事实,得出auraptene对细胞周期的影响可能会持续至少24小时。这可能是母体化合物或其活性代谢产物的影响。的主要代谢物auraptene umbelliferone和7-ethoxycoumarin也已被证明具有chemopreventive效应(25]。
细胞周期蛋白D1基因也是一个细胞周期基因的变化进行了分析和其他提到的基因。我们发现没有重大改变的细胞周期蛋白D1的mRNA水平细胞igf - 1和auraptene(数据没有显示)。因此,auraptene对细胞周期蛋白D1的影响可能是转录后的。以前的研究已经表明auraptene cox - 2蛋白水平的改变,进气阀打开,pro-MMP-7不改变他们的转录水平(18,26]。在人类大肠癌细胞腺癌行HT-29, auraptene扰乱了翻译proMMP-7蛋白质合成减少磷酸化水平的4 e结合蛋白1 (4 ebp)和真核翻译起始因子(eIF) 4 b [18]。这些数据在我们的研究结果指出,auraptene可能作用于细胞的转化机械。
许多基因被auraptene调制已被证明在许多癌症相关。大多数前列腺癌和乳腺癌细胞系研究降低了拷贝数CDKN2B基因(27),而在这项研究中我们发现它调节auraptene预处理后随着时间的推移。CDKN2B,细胞周期蛋白D1的抑制剂诱导细胞周期进展从G1期到S期,可能导致auraptene诱导抑制细胞周期G1期。CDKN2B被发现增加了auraptene几乎相似程度8 h和24小时而S期抑制明显在24小时。这可能是由于监管的CDKN2B可能是一个早期事件导致进一步抑制细胞周期机械在稍后的时间点。细胞周期蛋白的E2F摆脱复审委员会D-CDK复杂上调基因的转录参与dna复制MCM组件,cdc 6,和细胞周期素E(28]。的E2F在许多癌症基因是管制各种机制超表达细胞周期蛋白D1、复审委员会,和人类乳头状瘤病毒(HPV)的表达肿瘤蛋白E7,等等(29日]。CDC45蛋白质已被证明是在各种人类癌症细胞系,包括MCF-7 [30.]。UHRF1 E2F1转录因子的转录控制下(31日]。UHRF1已被证明是调节在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌,等等31日- - - - - -33]。因此在更早的时间点在这项研究中,细胞周期蛋白D1的差别,对这些可能会导致降低e2f转录及其下游目标UHRF1和MCM复合物导致细胞周期阻滞的起始。6月或c-Jun是一个组件的组合转录因子激活蛋白1 (AP-1)和促进细胞增殖34,35]。C-Jun在许多人类癌症和有助于人类乳腺癌细胞的侵袭性(36]。在这项研究中,我们发现小君调节8 h时间点只在24小时时间点,而不是相对应的抑制S期在auraptene 24小时。
在随后的时间点auraptene预处理导致更大的基因表达的变化CDC45L, E2F1, UHRF1, DDIT3, CDK2NB。auraptene调节的其他基因也已被证明在许多癌症的管制。DUSP1成绩单是显著下降与正常细胞相比,结肠直肠癌(37,38]。李和他的同事们(38]表明DUSP1 (MKP1)是一个转录p53的目标,抑制MAPK途径激活细胞周期的进展。在雌激素依赖性乳腺癌细胞,雌激素可以增加细胞周期素B2蛋白质的表达和促进细胞增殖(39]。CHEK1超表达已经在人类大肠癌与先进的肿瘤和不良预后相关(40]。CDKN2C的编码基因是细胞周期蛋白依赖激酶4 C或p18抑制剂。突变p18被发现在一些人类乳房肿瘤(41]。类似于CDKN2B,CDKN2C还能抑制细胞周期蛋白诱导G1 / S过渡。因此表达的增加CDKN2C也可能起着重要的作用在auraptene诱导抑制细胞周期G1期。有类似的功能,但是这两个基因auraptene调制不同的8 h和24小时。KIF20B kinesin-6家族的成员(42]。它参与了胞质分裂43]。麻醉品家族的一些成员是调节癌症。在肺癌中,观察KIF4A基因高度transactivated [44]。在大多数胶质瘤细胞系3基因过表达:KIF1C KIF3C,和KIF21B(45]。KIF20B被发现大多数人类中高度表达的浸润性膀胱癌(46]。因此整个基因变化带来的auraptene预处理抑制细胞周期的进展在MCF-7 G1期细胞。
一些上述基因已经被鉴定为抗癌治疗的目标。CDC2也称为CDK1。CDK调节器进行了调查在临床试验中对许多癌症。、CDK1 Flavopiridol CDK2抑制剂(47),是临床检测对胃癌、白血病、头部和颈部癌症(48]。另一个CDK1调制器目前在临床试验中是UCN-01 [49]。在一个细胞周期基因阵列实验与etodolac MCF-10F细胞,cox - 2抑制剂,CCNA2是一个显著的改变基因(50]。在前列腺癌细胞曲泽,毛地黄黄酮减少的转录CCNA2连同其他细胞周期基因和抑制这些细胞的增殖(51]。因为auraptene调制这些基因,进一步分析其潜在的膳食chemopreventive代理需要执行。
5。结论
我们调查的角色auraptene在人类乳腺癌细胞系的细胞周期进展,MCF-7,我们表明,抑制MCF-7 auraptene对细胞周期的影响。Auraptene显著降低的百分比进行S期细胞igf - 1治疗24小时后。有几个基因参与细胞周期与auraptene预处理明显调制。更多的基因被调制在24小时时间点和相应auraptene预处理抑制细胞周期进展。总的来说,auraptene预处理产生显著增加基因的mRNA水平之前,调节细胞周期阻滞和细胞凋亡。有显著减少基因的mRNA水平促进G1 / S过渡和DNA复制。进一步研究auraptene对细胞周期的影响发展和蛋白质不同的乳腺癌细胞系转化机械将为我们提供更多的信息关于其chemopreventive属性。然而,获得的结果与auraptene MCF-7细胞把更多的光在细胞周期抑制其chemopreventive机制之一。因为乳腺癌是一种多因素疾病,药物的组合应该为化学预防研究和尝试auraptene可能的候选人之一。
利益冲突
作者没有任何利益冲突与本文的内容。
承认
作者收到Feist-Weiller癌症中心的支持下,药理学,毒理学和神经科学。本文也支持,部分由国家癌症研究所资助1 k22ca102005-01a2 (HKH)。内容完全是作者的责任,并不一定代表官方观点的国家癌症研究所和美国国立卫生研究院。