评价抗增殖活动《红高粱》麸皮花青素在人类乳腺癌细胞系(MCF-7)

文摘

乳腺癌是全球女性死亡的主要原因在发达国家和发展中国家。因此有效的治疗乳腺癌的潜在的抗肿瘤药物是很重要的。摘要人类乳腺癌细胞系MCF-7被用来评估《红高粱》麸皮花青素的抗增殖活动。目前的调查显示,《红高粱》麸皮花青素在显著水平诱导MCF-7细胞的生长抑制作用。生长抑制作用是剂量依赖和不可逆转的。当MCF-7细胞治疗与《红高粱》麸皮花青素由于花青素活动观察形态学变化。形态学的变化被确定通过apoptopic体的形成。DNA的碎片,这些花青素oligonuleosomal-sized片段,是细胞凋亡的特征,观察到浓度。因此,本文明确表明人类乳腺癌细胞MCF-7高度敏感,《红高粱》麸皮花青素MCF-7细胞诱导凋亡的结果。

1。介绍

在印度的城市女性,乳腺癌患者的数量每年增加,人口老龄化和增加在不同年龄组的发病率1]。病例对照研究在孟买和钦奈已经确定的因素如零平价、婚姻、年龄和第一次怀孕后期年龄是重要的风险因素。(2,3]。它也表明,西方饮食的影响改变了都市女性的生活方式可能是一个乳腺癌的发病率逐渐上升的主要原因在印度(1]。因此早期发现和寻找潜在的抗肿瘤化合物是重要的控制乳腺癌。

我们从《红高粱》麸皮中提取花青素由甲醇和酸化甲醇和评估MCF-7细胞系的抗肿瘤活性。抗肿瘤化合物的效率似乎倾向相关的肿瘤细胞应对这些高粱anthocaynins细胞凋亡。最近,相当大的注意力一直集中在事件的序列称为凋亡和中介的作用,这个过程的致命影响乳腺癌细胞抗肿瘤的药物。细胞凋亡是一个高度管制的过程,特点是细胞收缩膜起泡,染色质缩合,形成多个片段的DNA梯internucleosomal DNA裂解造成的180 - 200个基点(4]。花青素的一些最近的研究已经证明了一个重要的增长抑制某些肿瘤细胞包括人类结肠癌、宫颈癌,人类白血病,前列腺癌细胞(5- - - - - -8]。

考虑一些花青素在某些肿瘤细胞的抗增殖活动,尝试评估相对高粱的生长抑制活性花青素MCF-7细胞,这可能对乳腺癌的治疗提供了一些新信息。

2。材料和方法

2.1。样品

的麸皮高粱二色的(l)《红高粱》收集从农民在泰米尔纳德邦,印度和储存在−20°C。

2.2。花青素提取

花青素提取协议涉及的10毫升溶剂(1%盐酸甲醇)0.5克的样品50毫升离心管和低速震动样品2小时(75 rpm) orbitory瓶(Neolab)。样本然后储存在−20°C一夜之间允许的最高在黑暗中扩散的酚醛树脂细胞矩阵。样本然后平衡至室温,在7000转离心10分钟并进行分析。残留与10毫升的溶剂冲洗两次用颤抖的5分钟,10分钟,然后离心法在7000 rpm的进行分析。最后,提取混合好,存放在−20°C在黑暗中,直到进一步的生化分析(9]。

2.3。细胞培养

人类乳腺癌细胞系,MCF-7,细胞在DMEM包含10%的边后卫,额外补充谷氨酰胺(0.03%)和100年μg / mL苄青霉素、链霉素100 U /毫升、和2.5μ克/毫升两性霉素。细胞可以生长在组织培养瓶(美国康宁公司),在公司₂孵化器在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂和95%的空气。实验目的,细胞指数增长的文化。所有的实验都重复三次。

2.4。细胞生存能力分析

细胞生存能力分析进行了描述(10]。简单,细胞被播种密度3 - 104细胞/到24-well板块。24小时后,GA提取物添加到介质在不同浓度和孵化24或48小时表示。最后孵化,3 - (4 - 5 dimethylthiozol-2-yl),溴化2-5-diphenyl-tetrazolium (MTT)(2毫克/毫升)/添加,和甲瓒晶体形成可溶性酸化异丙醇在吸气的媒介。MTT还原程度的测量spectrophotometrically在570 nm,和表达的细胞生存在未经治疗的比例控制。

2.5。细胞形态学研究

高粱麸皮的甲醇和酸化甲醇提取物MCF-7细胞的细胞形态学研究。MCF-7细胞生长在6-well板治疗不同提取物的花青素在37°C 24 h。形态变化发生在相差显微镜下观察细胞,使用CCD相机拍摄在TE 2000 E显微镜(尼康)。

2.6。通过琼脂糖凝胶电泳DNA碎片

细胞内的核细胞凋亡的形态学变化与独特的生化事件:核DNA的endonuclease-mediated乳沟。事实上,oligonucleosomal大小的DNA片段的形成(180 - 200个基点)是细胞凋亡的特点在许多细胞类型。

本协议提供了一个方法DNA分离分散,完整的DNA分数和琼脂糖凝胶电泳分析。在凋亡细胞特定DNA乳沟变得明显在电泳分析作为一个典型的阶梯模式由于多个DNA片段。然而,尽管该协议简单,一般能够提供好的结果,只有定性的因为它的局限性在DNA复苏和溶解。为了获得一个更干净的DNA, DNA制备的其他方法是必需的(在某些情况下使用除蛋白的蛋白酶K推荐)。

2.6.1。材料

在1 -细胞悬液细胞/毫升完全MEM培养基TTE的解决方案:TE缓冲pH值7.4与0.2% Triton x - 100(存储在4°C)氯化钠5 M,冰冷的异丙醇,冰冷的乙醇为70%,冰冷的TE缓冲pH值7.4加载缓冲区10 x此种缓冲区电泳溴化乙锭解决方案electrophoresis-grade琼脂糖分子量DNA标记细胞冷冻离心机凝胶电泳仪紫外线透照器。

2.6.2。方法

(1)分配0.5毫升的细胞悬液(不少于DNA,否则将不会被摄影的溴化乙锭染色的凝胶,并且不能超过,以避免困难的处理太大量的不溶性DNA)管标记B(底部)。(2)离心细胞在4°C 200×g 10分钟。(3)转移上层清液仔细在新管标记(上层清液)。(4)增加了颗粒在管B 0.5毫升TTE和涡积极的解决方案。这个程序允许分散从细胞核染色质的释放,细胞溶菌作用后(由于存在TTE Triton x - 100的解决方案)和破坏的核结构(毫克^{+ +}EDTA螯合的TTE的解决方案)。(5)从完整的染色质DNA片段分离,离心管B在20000 g×10分钟在4°C。(6)小心转移上层清液在新管标记T(上)。(7)增加的小颗粒在管B 0.5毫升TTE的解决方案。(8)添加到0.5毫升卷出现在管B, S和T、0.1毫升的冰冷的5 M氯化钠和涡大力。盐的加入应该能够把histons从DNA。(9)添加到每个管0.7毫升的冰冷的异丙醇,涡大力。(10)允许降水进行隔夜−20°C。这一步可以缩短把样品的乙醇/干冰浴1小时。(11)沉淀后,恢复成粒DNA的20000×10分钟g在4°C。(12)丢弃上层的愿望或迅速倒相管,小心地删除任何下降或管的剩余液体附着在墙上用纸巾。这可能是一个关键步骤,因为颗粒可以放松和透明的,很难被看到。(13)冲洗丸通过添加到每个管0.5 - -0.7毫升的冰冷的70%的乙醇。(14)离心管在20000 g×10分钟在4°C。(15)丢弃上层的愿望或迅速倒相管。小心地删除任何下降或剩余液体附着在墙上倒相管的管在一个30分钟的吸水纸毛巾。让空气干燥管在直立位置至少3小时之前。(16)溶解DNA通过添加到每个管20 - 50 l (TE方案和管道在37°C 1 - 3天。再溶解的DNA可能是一个关键的步骤,实际上这取决于样品中DNA的数量和大小。因此,nonfragmented DNA包含在管,可能需要更高容量的TE和更长的潜伏期时间为了resuspended。(17)混合样品的DNA与加载缓冲区增加10倍加载缓冲区最后1 x的浓度。添加加载缓冲区样品允许加载凝胶更容易井和监测样本的运行。(18)样品在一个加热块在65°C 10分钟,立即加载10 - 20 l的每个标准的1%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭0.5 mg / mL。适当的DNA分子量标记应该包括。溴化乙锭是一种潜在的致癌物质:戴手套,小心轻放。(19)运行标准中的电泳后此种缓冲设置电压到所需的级别。电泳可以监控迁移期间溴酚蓝染料迁移后的样本中包含加载缓冲区。(20)停止电泳当染料达到约3厘米的凝胶。(21)可视化的DNA,将凝胶紫外凝胶的透照器和拍照。穿保护眼睛和皮肤在紫外线。

3所示。结果

3.1。形态的变化

在目前的研究中,抗增殖效果的《红高粱》麸皮花青素在乳腺癌细胞系,MCF-7研究在不同浓度。《红高粱》麸皮花青素对MCF-7细胞文化产生显著形态学改变。这些细胞在正常生长条件下(控制)是常规的形状和大小,有古怪的细胞核和细胞质(图一块相对较小1(一))。治疗后与1000年μ克/毫升的花青素,细胞变得不规则的形状和大小的改变核:细胞质比率,增加数量的核仁和多个细胞质液泡(图1 (b))。大多数的细胞与长多个细胞质流程相对扁平的外观形成横桥与邻近细胞(图1 (c))。这表明,花青素可能呈现一些变化在细胞表面与坚持相关的基础,因此,治疗细胞倾向于坚持表面生长,肿瘤细胞和相反的行为在活的有机体内系统(11]。花色素甙治疗后出现的多核巨细胞也MCF-7细胞(图中观察到1 (d))。

3.2。分析增长的抑制作用

结果表明,从15增加高粱花青素的浓度μ克/毫升到1000μ21.31 g / mL的百分比增长抑制花青素甲醇提取后24小时的曝光。它同样明显的是,花青素含量的百分比增长抑制浓度(表增加而增加1)。因此,详细分析显著增长造成的结果清楚地表明,花青素抑制MCF-7细胞在剂量依赖性的方式(图2)。

相似的结果观察到当MCF-7细胞治疗与酸化甲醇从高粱麸皮中提取的花青素。结果表明,从15增加高粱花青素的浓度μ克/毫升到1000μg / mL的百分比增长抑制MCF-7细胞逐渐从11.47%上升到86.88%在24小时后酸化甲醇提取花青素的曝光(表2),与甲醇相比,酸化甲醇提取物显示出更高的增长抑制(图3)。

最后,我们报道,高粱花青素引起显著增长的抑制人乳腺癌细胞系甚至在1000年μ克/毫升浓度。没有早可以在这方面的报道。Pouget et al。12和汉族等。13]报道等黄酮类化合物的抗癌活性黄烷酮类、大豆苷、染料木素、槲皮素,通过使用MCF-7木樨草素在人类乳腺癌细胞系。

3.3。DNA碎片

《红高粱》的显著增长抑制活动麸皮花青素使我们调查的影响花青素也扮演了一个角色在细胞凋亡的诱导。如图4oligonuceosomal-sized碎片的数量MCF-7细胞接受《红高粱》麸皮花青素花青素含量增加时,增加从62.5μ克/毫升到125μ克/毫升。Katsuzaki et al。14)报道,在白血病细胞DNA碎片脱毛4 b花青色素3葡萄糖苷隔绝皮肤黑大豆。

另一方面,我们已经观察到类似的结果在甲醇和酸化甲醇提取物的红高梁麸花青素。慕克吉et al。15)评估的抗增殖活动enoxacin在人类乳腺癌细胞系显示药物暴露的重要结果后5天。

正确的句子:目前的研究表明,这些红色高粱麸皮花青素有明显的生长抑制作用对人类乳腺癌。

4所示。结论

上面的结果清楚地表明,花青素具有诱导乳腺癌细胞显著的抗增殖活动。此外负责抗增殖活性的化合物,这些化合物的作用机制尚未详细研究。在这些方面需要进一步的调查。

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