17α-ethynyl-5α-androstane-3α17β-diol MNU-Induced治疗乳腺癌的老鼠

文摘

N-methyl-N-nitrosourea (MNU)诱发estrogen-dependent乳腺肿瘤在女性刘易斯老鼠。我们研究了合成雄烷衍生物的抗肿瘤的活性,17岁α-ethynyl-5α-androstane-3α,17β二醇(HE3235),作为一个代理或结合多烯紫杉醇与他莫昔芬相比,anastrazole,多西他赛单方对MNU-induced乳腺肿瘤在女性刘易斯老鼠。治疗HE3235迅速减少肿瘤负荷,它莫西芬和阿那曲唑相似的效果。的组合HE3235比单药多西他赛是更有效的,虽然没有明显的毒性。只有HE3235 HE3235 +多烯紫杉醇停止治疗后继续抑制肿瘤的生长。HE3235治疗细胞凋亡和免疫组织化学标记增加proapoptotic基因的表达雌激素受体β和凋亡基因的表达减少,雄激素受体,雌激素受体α。这些数据保证HE3235乳腺癌治疗的临床研究。

1。介绍

乳腺癌是女性最常见的癌症之一,和全球乳腺癌的发病率正在增加1]。每年大约有200000名妇女被诊断为乳腺癌,在美国一个相关的死亡率为40000 (2]。目前,很少有激素依赖性乳癌治疗,与他莫昔芬和anastrazole被最广泛使用的治疗方法(3]。虽然一般耐受性良好,这些疗法可以关联到重要的发病率(4),和发展的阻力是常见的5,6]。

致癌物N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induc-es乳腺激素依赖性肿瘤的老鼠。这种模式曾被用于开发它莫西芬治疗患有乳腺癌的妇女(7),被认为是适合研究新颖化合物的潜在有用的治疗乳腺癌。大量证据表明,这种啮齿动物模型系统模拟人类乳腺癌:癌症的启动主要在同一地点发生在人类和老鼠,大多数肿瘤雌激素和孕激素受体表达,与肿瘤发展依赖于生殖历史,饮食,和荷尔蒙环境(8]。因此,模型提供了一个机会来检查的因果关系原位环境完全受到系统性因素的影响(9]。

17α-ethynyl-5α-androstane-3α,17β二醇(HE3235)是合成雄烷衍生物抑制5-androstene-diol [10),睾丸激素和雌激素(未发表)刺激前列腺癌细胞系(LNCaP)扩散,因此被选为临床前候选评价对激素敏感的乳腺癌。一个定义良好的分子基础的明显的作用机制(s) HE3235尚未阐明。在人类前列腺癌异种移植,HE3235并不transactivate雄激素受体(AR)和不基于“增大化现实”技术对抗睾酮的作用,但刺激雄性激素响应元素和PSA表达而降低AR表达,诱导细胞凋亡,抑制雄激素合成(10,11]。HE3235的药理特性,包括核激素相互作用的HE3235及其主要代谢物已发表(12]。HE3235和代谢物17α-ethynyl-5α-androstane-3β,17β二醇,17α-ethynyl-17β-hydroxy-5α-androstan-3-one没有强大的性激素雌二醇和睾酮相比,但有可能绑定和transactivate AR,雌激素受体α(ERα),雌激素受体β(ERβ)不同程度,提供潜在的复杂的相互作用在细胞占有核和/或膜性类固醇受体。在啮齿动物和狗毒理学研究,HE3235一般耐受性良好,与厌食症新兴在两个物种的高剂量(12]。

后MNU鼠乳腺肿瘤模型中进行试点实验表明抗肿瘤活性,我们评估HE3235作为一个代理,结合多烯紫杉醇对肿瘤生长和耐用性治疗后停止响应。我们报告中HE3235鼠MNU乳腺癌模型展览一个强有力的和持久的抗肿瘤活性,这在我们的手是优于阿那曲唑和多西他赛和不伴有明显的毒性。HE3235和多西他赛没有加强毒性,和发现抗肿瘤活性优于他莫昔芬单药治疗。这些数据提供了一个理由继续调查这个小说的潜在的荷尔蒙治疗乳腺癌的药物。

2。材料和方法

2.1。致癌作用

所有动物进行了程序在德州理工大学健康科学中心。批准的程序都健康科学中心的动物保健和使用委员会,按照联邦和地方规定执行。维珍刘易斯老鼠从哈伦购买的雄性sd(中印第安纳波利斯,圣地亚哥,CA)。老鼠被安置在一个温控房间,12小时的光明与黑暗的时间表和美联储一个标准实验室饮食提供食物和水随意。在七周的年龄,所有的老鼠都接受一个腹腔内注射(IP) 50毫克/公斤N-methyl-N-nitrosourea(σ,圣路易斯,密苏里州)如前所述[13,14]。

2.2。制定测试化合物和药物治疗方案

当老鼠发达明显肿瘤(约5毫米×5毫米,90天后MNU)他们被分成7个治疗组13动物每个:(1)控制,(2)6.6毫克HE3235(高剂量HE3235),(3) 4毫克HE3235(低剂量HE3235),(4)高剂量HE3235多西他赛+ 1.5毫克,(5)1.5毫克多烯紫杉醇,(6)2.5毫克anastrazole,(7) 0.25毫克三苯氧胺。额外的组动物治疗两周与车辆或6.6毫克HE3235 (/组)为目的的组织病理学评价、免疫组织化学染色法和基因表达。

HE3235剂量的选择进行28天治疗后雌性大鼠实验与建立MNU肿瘤4和8毫克每天HE3235。一个完整的剂量滴定法确定最佳剂量没有进行。当前研究预期的高剂量每天8毫克,但分析测试的文章指出只有6.6毫克。多烯紫杉醇被选为一个模型紫杉烷与HE3235联合治疗的常用紫杉烷在乳腺癌的管理和潜在的添加剂或协同活动从代理不同的作用机制。

水溶液HE3235的准备β环糊精sulfobutyl醚(Captisol, CyDex, Lenexa,堪萨斯)。17α-Ethynyl-5α-androstane-3α,17β二醇(HE3235) (Hollis-Eden制药、圣地亚哥、CA)是制定一个解决方案的环糊精20或33毫克/毫升30% (w / v)。HE3235日常管理由腹腔内注射(IP)为4周(4或6.6毫克,1毫升/公斤)。HE3235治疗结合多烯紫杉醇同期注入的单独的测试文章。多烯紫杉醇(泰素帝,国家药品代码0075-8001-20,赛诺菲-安万特美国LLC)连续稀释水13%乙醇和0.9%盐水根据制造商的指示收益率0.74毫克/毫升的解决方案,这是使用后立即准备。两毫升生理盐水稀释多烯紫杉醇的(1.5毫克,6毫克/公斤,8.1毫升/公斤)是由IP为4周每周注射一次。Anastrazole (AK科学公司,山景,CA)准备10毫克/毫升溶液30%水环糊精和日常管理IP注入(2.5毫克/天;1毫升/公斤)为四个星期。它莫西芬(游离碱,Tocris生物科学、Ellisville Mo)准备1.25毫克/毫升溶液在橄榄油,并由皮下注射(SC)每周1次(0.25毫克,1毫克/公斤,0.8毫升/公斤)为四个星期。Vehicle-treated动物收到1毫升/公斤30%水环糊精每天4周。含水乙醇和橄榄油车辆用于紫杉醇和三苯氧胺,分别是每周只进行一次,认为最小的可能影响肿瘤的生长。

2.3。肿瘤体积测量

动物被触诊每周两次开始接触致癌物质,直到一个月后结束实验监测乳腺癌发展。肿瘤的尺寸长度()和宽度()用游标卡尺测量,和肿瘤体积估计公式(毫米³)[15]。石蜡切片的组织病理学检查的动物从一个子集(治疗2周)确认的癌的性质明显的癌症。

2.4。免疫组织化学

治疗两周后(车辆或6.6毫克HE3235)和确认样品的癌的本质后,肿瘤部分染色了保利(ADP-ribose)聚合酶(PARP)和雌激素受体α(ERα使用标准的免疫组织化学技术)表达式。细胞核与迈耶的苏木精复染色(σ)和光学显微镜检查。积极染色细胞的百分比确定积极染色细胞的数量除以总数量的细胞数,乘以100。

2.5。实时聚合酶链反应

少量的基因与细胞增殖,细胞凋亡,和转移潜力量化了rt - pcr: amphiregulin(沙土荒漠)、雄激素受体(AR),肿瘤蛋白质53 (p53)、Bcl2拮抗剂的细胞死亡(坏),细胞凋亡调节器伯灵顿(伯灵顿),b细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2 (bcl - 2)、半胱天冬酶3 (Casp3),半胱天冬酶8 (Casp8),半胱天冬酶9 (Casp9),细胞周期蛋白D1 (Ccnd1),雌激素受体α(ERα),雌激素受体β(ERβ)、孕激素受体同种型(PR-A)、血管内皮生长因子(VEGF)和β肌动蛋白。冷冻组织总RNA提取使用胍盐thiocyanate-phenol-chloroform提取过程和处理DNAse [16]。RTPCR进行一式三份样本,使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的建议,和基因表达的相对定量计算使用比较Ct方法(17]。数据表示为均值褶皱差异相比,车辆控制规范化β肌动蛋白的表达。

2.6。统计方法

之间的差异的重要性意味着使用学生或成对值计算以及。肿瘤死亡卷审查过去观察发扬光大(LOCF)用于数据分析的目的。治疗影响动物生存的意义取决于确切概率法使用SAS软件(卡里,NC)。

3所示。结果

HE3235高剂量和HE3235结合多烯紫杉醇显著抑制肿瘤的生长没有明显的毒性的迹象。HE3235结合多西他赛是优于其他治疗方法。没有动物的组合处理HE3235 +多烯紫杉醇被牺牲,因为肿瘤负荷(仅与多西他赛);一种动物牺牲在每个治疗组与高或低剂量HE3235单一疗法或他莫昔芬(仅与多西他赛);六是牺牲多烯紫杉醇组和七阿那曲唑组;所有动物都牺牲在汽车集团(图1)。

所有的动物都至少有一个明显的肿瘤治疗的起始。在治疗的第一天(101天),意味着肿瘤体积为0.38±0.05毫米³(范围0.31毫米³0.46毫米(anastrazole组)³(高剂量HE3235-docetaxel组合))。vehicle-treated动物肿瘤迅速增长,与动物牺牲人道的原因这一组开始139天,最后动物安乐死在153天。符合试点实验,用大剂量治疗HE3235单独有一个快速和有效的抗肿瘤效果显示在开始治疗后肿瘤体积急剧下降(图2)。所有积极治疗组相似的cytoreductive活动前两周的治疗,但肿瘤烧蚀低剂量HE3235活动,多西他赛,下半年anastrazole减弱的治疗时期。此外,肿瘤体积大幅增加紫杉醇和anastrazole组治疗后观察期间停止。这些三个治疗结束时显示统计上显著的抗肿瘤活性的治疗时期相比,启动()。在所有的三个实例,治疗似乎是更有效地减少或消除小肿瘤,而更大的肿瘤通常是更强的抵抗力。相比之下,高剂量HE3235 ()或他莫昔芬()积极切除肿瘤的体积通过治疗期结束后,用温和的体积增加观测期间。高剂量HE3235结合多烯紫杉醇阻止肿瘤的生长通过观察的最后一天(195天),更有效的治疗比剂单独使用(与高剂量HE3235和和多西他赛)。平均肿瘤负荷联合治疗组没有明显不同于它莫西芬治疗结束时)或在观察期结束()。

每个治疗的相对有效性得分为肿瘤发病率在研究治疗结束,结束与基线(图3)。肿瘤发病率急剧增加(从1.23到4.31,)vehicle-treated-group剂量期间(101 - 128),正如所料,减少针对所有积极的治疗()。单药治疗组肿瘤发病率没有明显高于HE3235-docetaxel结合在治疗结束,除了多西他赛()。停止加药后,肿瘤发病率急剧上升的多西他赛(0.92到2.1,)和anastrazole(0.69到1.77,)组和三苯氧胺组略有增加(0.15到0.77,),而肿瘤发病率与HE3235单药治疗或多烯紫杉醇组合持续下降,尽管不是统计低于治疗结束。

无病的发病率动物HE3235和三苯氧胺组相比在治疗结束。8他莫昔芬老鼠无病,而在低收入和高剂量HE3235 6和7组分别和十HE3235-docetaxel组(图3)。在观察期结束,三苯氧胺组的肿瘤发生率增加了两个13(6动物疾病免费),而肿瘤发病率下降了两个低剂量HE3235组(13)8,一个高剂量HE3235组13(8),和一个HE3235-docetaxel组(11 13,与三苯氧胺;不显著与高或低HE3235单一疗法)。

HE3235在肿瘤组织的影响,通过免疫组织化学方法检测与车辆或高剂量治疗组在卫星HE3235 2周。HE3235 PARP双重染色细胞的频率增加(2590年3123年(82.9%)HE3235治疗3079年和1212年(39.4%)车辆处理,),ER的频率下降α染色大约4倍(603 3058 (19.7%)HE3235治疗3051年和2349年(77.0%)车辆处理,)(图4)。与细胞增殖相关基因的表达,细胞凋亡,转移可能与免疫组织化学结果(图一致5)。Proapoptotic基因调节:Casp3(9倍),Casp8),“碳足迹”(11倍,Casp9(5倍),p53(15倍),坏(13),伯灵顿(10倍),ERβ(4倍),而与肿瘤相关基因,转移和逃避治疗表达下调:AR(25倍),ERα(三倍),PR-A(5倍),VEGF(4倍)。自分泌生长因子的表达,amphiregulin和抗凋亡蛋白bcl - 2,也减少了约4倍。

4所示。讨论

HE3235小说雄烷衍生物,最初被确定为一个代理来治疗前列腺癌。之前的研究与激素敏感LNCaP细胞系证明HE3235可以减少发病率和androstenediol刺激异种移植的发展(10]。使用MNU-induced鼠乳腺癌模型,我们表明,HE3235也积极与这些estrogen-dependent肿瘤。这个活动似乎与诱导细胞凋亡和抑制雄激素和雌激素(α)核激素受体表达。HE3235单药治疗的活动是与他莫昔芬和优于阿那曲唑。当结合多烯紫杉醇,HE3235优于两种。没有任何迹象表明毒性观察治疗,并与多烯紫杉醇HE3235的结合没有加强毒性。剂量的comparitor疗法是改编自先前的报道18- - - - - -21]。药物动力学的一项研究估计,每天6.6毫克剂量的照射HE3235大约12765 ng *人力资源/毫升,这类似于最大曝光没有严重的毒性(包括厌食)28天中观察到的毒性研究老鼠和大大高于观察I / II期前列腺癌临床研究(12]。HE3235是口服生物利用率,但管理非肠道在这项研究(和以前的前列腺癌模型)来减少口服环糊精车辆的影响。

HE3235积极建立肿瘤萎缩,防止出现新的肿瘤。肿瘤体积减少的速率和程度的肿瘤抑制治疗后停止是类似的高剂量HE3235单一疗法和它莫西芬。HE3235结合多西他赛的时候,不仅是tumor-ablative活动增强,但肿瘤抑制也维持治疗停止后60天。潜在的肿瘤再次出现在这些动物并不确定,但这并不削弱的含义明显大幅提高无病生存。

17岁的HE3235及其主要代谢物α-ethynyl-5α-androstane-3β,17β二醇,17α-ethynyl-17β-hydroxy-5α-androstan-3-one作为绑定和/或转录受体激动剂和拮抗剂的基于“增大化现实”技术,公关,ERα,呃β核激素受体在体外(12]。HE3235及其代谢物的药理学性激素依赖性癌症是复杂的。HE3235抑制雄激素和雌激素LNCaP增殖细胞,但似乎并不妨碍雄激素反应元素(是)转录10]。从力学上看,这并不排除这种可能性,HE3235和代谢物也与细胞表面受体介导的信号转导途径。发展疲软ER受体激动剂治疗乳腺癌的治疗,除了ER阴性变体如三阴性乳腺癌,必须解决担心潜在的癌细胞增殖的影响。临床开发HE3235必须基于示范proapoptotic效应主导潜在增殖的影响。MNU模型中我们的研究结果表明,这确实发生,至少在大鼠乳腺肿瘤,尽管使用其他肿瘤模型进一步探索这个问题可能是必要的。

报道,HE3235降低AR、ERα表达以前曾有报道称,老鼠MNU模型和AR表达减少hormone-independent前列腺癌异种移植模型(11]。如果发现HE3235对人类乳腺癌是活跃的,降低ERα和AR表达与改善预后、减少逃避治疗(22]。HE3235也减少了循环雌鼠和雄狗的性类固醇水平没有明显的扰动的血清促性腺激素浓度和降低睾丸激素在LuCaP35V前列腺癌异种移植被阉割的老鼠(11,12]。然而,HE3235引出这些活动在人类的能力,和这些观察HE3235的抗癌活性的关系尚不清楚。多西他赛,通过稳定微管的23],HE3235由于加强proapoptotic基因的表达和细胞生存基因的表达减少,都是proapoptotic代理,这样他们的联合抗肿瘤效果增强,虽然我们的研究不是为了证明协同作用。HE3235-docetaxel组合活动的增加也可以解释为内源性雌二醇的减少,因为雌二醇可以减少通过激活ERK taxane-induced凋亡通过质膜受体,虽然其他ERK-independent途径也可能有助于这些雌激素介导效应(24]。阿那曲唑是一个标准的治疗减少内源性雌二醇在乳腺癌患者一线治疗失败。尽管活跃在MNU模型,anastrazole不如HE3235在我们的研究中。

基因表达分析显示HE3235 proapoptotic基因的表达增加,恶性肿瘤和肿瘤生存基因的表达减少,符合免疫组织化学分析和观察对肿瘤生长的影响。恶性肿瘤的对比效应促进基因,AR, PR-A, ERα(下调),prodifferentiation维护基因相比,ERβ,结合影响凋亡相关基因,突显出HE3235分化剂,因为它诱导细胞程序性死亡在乳腺癌(报道)和前列腺癌模型10]。

相对于人类,啮齿动物被积极地和不同代谢本机肾上腺类固醇(25,26),但这不是观察合成HE3235 androstanediol导数。在雌性老鼠,在男性人类,弱雌激素HE3235代谢物,17岁α-ethynyl-5α-androstane-3β,17β二醇代谢物,17岁α-ethynyl-17β-hydroxy-5α-androstan-3-one出现在等离子体(丰度相对较低12]。此外,HE3235是占主导地位的非结合的分子物种在老鼠和人类,减少担心活跃分子实体的临床前模型将不会出现在临床设置。消除人类的半衰期大约是14个小时,这是兼容QD和投标管理安排;然而,半衰期只有1 - 2小时在小鼠或刘易斯大鼠12]。这种差距临床前期大鼠模型和人类需要的使用不均衡地高剂量在啮齿动物模型,以弥补快速消除与人类相比。

许多不同的方法正被临床和实验调查研究预防和治疗乳腺癌。目前只有三个接受治疗乳腺癌预防高危女性:卵巢切除,全乳切除乳房肿瘤切除术,并与三苯氧胺长期治疗。这些是普遍接受的,由于相关的物理、心理和生理的副作用。乳腺癌治疗而言,选择基于表型的核激素受体在病人的肿瘤(ERα、公关)[27]。当前使用的所有治疗对这些目标有明显的副作用,和良好的分享(选择终止治疗的患者28,29日]。

目前,第三代口服芳香化酶抑制剂被认为是理想的候选人提高它莫西芬的活动或取代它完全预防绝经后妇女的乳腺癌复发。肉搏战的手臂的ATAC(阿那曲唑、三苯氧胺单独或组合)试验,在100年-月分析,无病生存优势的激素受体阳性人口4.8%赞成阿那曲唑三苯氧胺(30.]。芳香化酶抑制剂有重叠,但不相同的它莫西芬的副作用。最令人不安的芳香化酶抑制剂的副作用之一是新兴影响骨骼,显著增加骨折ATAC试验过程中,早期骨密度损失增加,更早增加骨代谢标记(31日]。显然,新的药物治疗乳腺癌没有这些有害的副作用会对这种疾病的管理产生积极影响。

在癌症治疗设置明显,药物经常结合使用,HE3235没有明显的肝,造血,或心肺毒性目前认为是cytoreductive剂量(12]。阿那曲唑相比,HE3235可能对骨骼有积极的影响,发现骨矿物质密度的增加相对于车辆在一个intratibial前列腺癌异种移植研究[11]。这可能与乳腺癌相关的考虑骨转移在这个疾病的高发病率(32]。因此,安全及活动的状况HE3235从而提供了一个依据其结合经典的细胞毒性药物,如紫杉烷。这样的组合将导致辅助抗肿瘤的机制,以降低发病率的治疗逃跑。乳腺癌辅助治疗使用的各种组合蒽环霉素,紫杉烷,环磷酰胺(33]。本文提供的数据表明,如果在啮齿动物存在于人类的活动,增加HE3235辅助治疗方案可以显著提高治疗中获益。以其良好的临床前安全性和小说的作用机制,HE3235是一个有趣的对荷尔蒙药物候选评价乳腺癌。

公开声明

这项工作是由港生物科学公司c . n . Ahlem作者j·m·Frincke c . l .阅读,s . k .白色,和r . j . Trauger受雇于或股权在海港生物科学。

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