文摘

祛风类Zhitong胶囊(QZC),中国专利药品在中国官方认可的治疗类风湿性关节炎(RA)和其他疾病,具有消除风的主要影响,缓解疼痛,并促进血液循环,其临床应用局限由于其化学成分的不完整的说明和底层RA的治疗的分子机制。在这项研究中,61种化合物,包括16糖类,15有机酸、13生物碱,七个黄酮类化合物,六环烯醚萜苷,一个糖,两个醛,和一个皂素QZC同时识别和追踪到他们的草药起源超高液相色谱串联Q-Exactive Orbitrap高分辨率质谱(UHPLC / Q-Orbitrap-MS), 31人明确确定的参考化合物,和其他30初步特征。除此之外,所有这些化合物被证明在RA的治疗有潜在药理活动基于网络药理学分析。总之,本研究首次调查潜在化学成分和药理作用的主要化合物在QZC,这将有助于生物活性化合物的启示在QZC和临床应用提供依据。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性的慢性炎性关节疾病自然,持久炎性滑膜炎,其发展受到多种因素的影响,包括环境、遗传、感染因素(1- - - - - -3]。加速的生活节奏和工作压力的增加,患风湿性关节炎的人数每年都在增长,在中国很难愈合,容易复发,严重影响他们的身心健康和生活质量。除此之外,非甾体类抗炎药和药物治疗风湿病的动作缓慢,主要是采用西医,通常导致胃肠道副作用和心理障碍。RA属于类别的“顽固风湿”在中国传统医学(中医),通常被移除风和冷,消除湿和清除热量,消除血瘀,促进血液循环的功效[4),祛风类Zhitong胶囊(QZC)是一种有效的药物列入国家基本药物治疗类风湿性关节炎(5]。

QZC,一个有效的专利药品治疗RA,由七个草药,扮演不同的角色。草Geranii (Laoguancao HG)和川乌研究Cocta (Zhicaowu RAKC)君主草药,主要发挥的影响消除风和湿、舒筋活血,缓解疼痛。红花(红花,FC)和基数独活(Duhuo、说唱)作为部长药物消除风能和疏浚络脉的功能,激活血液循环,刺激穴位,并减少肿胀和缓解疼痛。续断(Xuduan RD)基数等根茎Clematidis (Weilingxian ReRC),和草Visci (Hujisheng高压)作为助理药物具有消解的影响风和湿、疏通络脉,缓解疼痛,爽快的肝脏和肾脏,加强肌腱和骨6]。草本植物的综合影响,QZC可广泛用于减轻风湿性关节炎的症状,如肢体麻木、腰和膝盖疼痛,由于这些草药的合作(7]。

目前大多数研究QZC专注于其临床应用与一些分析研究其化学化合物,导致缺乏澄清的化学物质。此外,很少有人注意到整个医疗产品的标识和质量评价。QZC,中药处方,也有多组分的特点,多目标,multipathways,及其对RA的综合作用机理尚不清楚。李等人报道,QZC皮质骨有积极影响,可以防止骨质流失在RA患者(8]。与生物信息学的快速发展、网络药理学特点是中医的整体观念,已成为一个强大的工具,已成功应用于预测的复杂作用机理的中医治疗多种疾病通过构造和分析生物网络。使用现有的数据库,可以预测中药的潜在机制,可为深入研究提供一个理论参考中药处方的潜在机制9]。

在这项研究中,一个快速和有效的方法开发的化学表征QZC使用超高液相色谱串联Q-Exactive Orbitrap高分辨率质谱(UHPLC / Q-Orbitrap-MS)。系统的药理机制QZC治疗RA的预测通过网络药理学。这是第一个研究重点的分析化学类型,草本植物的起源,和潜在的药理作用的主要化学成分在QZC,其结果可以为未来的研究提供一个参考的化学成分,药理作用,临床应用QZC。

2。材料和方法

2.1。试剂和材料

甲醇和甲酸买来费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。二甲亚砜(DMSO)从子午线获得医疗技术(MREDA,纽约,纽约,美国)。UHPLC / Q-Orbitrap-MS分析用水由Milli-Q纯化水净化系统(美国微孔,Billerica的)。QZC陕西Buchang药业有限公司提供的样本有限公司(陕西,中国)。参考化合物来自上海原液生物技术有限公司有限公司(上海,中国),包括没食子酸、原儿茶酸、新绿酸,绿原酸,cryptochlorogenic酸,loganic酸,corilagin,马钱子苷,isochlorogenic酸−C, angelol, columbianetin醋酸,osthole, columbianadin,木通属皂苷D, 5-hydroxymethyl糠醛,4-hydroxybenzoic酸,咖啡酸,hydroxysafflor黄色,syringin,阿魏酸,secoxyloganin,鞣花酸,columbianetin angelol G, isoimperatorin。Benzoylmesaconine、benzoylaconine benzoylhypaconine取自上海Acmec生化有限公司有限公司(上海,中国)。Kaempferol-3 -O-rutinoside得到从成都Pufei德生物技术有限公司有限公司(中国成都)。这些参考化合物的纯度都是98%以上的决定UPLC分析。

2.2。标准溶液制备

31个标准准确称重和溶解使用甲醇体积烧瓶获得个股的解决方案。一定数量的每个股票的解决方案是放置在一个10毫升容量瓶稀释为准备一卷以10%甲醇水溶液混合标准溶液最终浓度为0.0603 mg·毫升⁻¹没食子酸、0.0323 mg·毫升⁻¹原儿茶酸、0.0714 mg·毫升⁻¹新绿酸、0.0451 mg·毫升⁻¹绿原酸、0.0506 mg·毫升⁻¹cryptochlorogenic酸、0.0603 mg·毫升⁻¹loganic酸、0.0537 mg·毫升⁻¹corilagin 0.0539 mg·毫升⁻¹马钱子苷、0.0498 mg·毫升⁻¹isochlorogenic酸B·毫升0.0499毫克⁻¹isochlorogenic酸,0.0399 mg·毫升⁻¹isochlorogenic酸C·毫升0.0543毫克⁻¹angelol, 0.0502 mg·毫升⁻¹columbianetin醋酸、0.0494 mg·毫升⁻¹osthole 0.0320 mg·毫升⁻¹columbianadin 0.0467 mg·毫升⁻¹木通属皂苷D, 0.0500 mg·毫升⁻¹5-hydroxymethyl糠醛、0.0500 mg·毫升⁻¹4-hydroxybenzoic酸、0.0501 mg·毫升⁻¹咖啡酸、0.0501 mg·毫升⁻¹hydroxysafflor黄,0.0500 mg·毫升⁻¹syringin 0.0505 mg·毫升⁻¹阿魏酸、0.0498 mg·毫升⁻¹secoxyloganin 0.0503 mg·毫升⁻¹鞣花酸,0.0506 mg·毫升⁻¹benzoylmesaconine 0.0500 mg·毫升⁻¹kaempferol-3 -O-rutinoside 0.0505 mg·毫升⁻¹benzoylaconine, 0.0504毫克毫升⁻¹benzoylhypaconine 0.0502 mg·毫升⁻¹columbianetin 0.0498 mg·毫升⁻¹angelol G和0.0498 mg·毫升⁻¹分别isoimperatorin。所有的解决方案都是储存在4°C不使用的时候。

2.2.1。样品溶液制备

准确称重QZC粉(0.5 g)转移到25毫升容量瓶和超声提取一定数量的75%甲醇水溶液为30分钟60°C,而随后稀释比例75%甲醇水溶液后冷却到室温。

分别Weilingxian和Duhuo粉均匀粉末。然后,0.5 g分别称重和超声提取75%甲醇水溶液(25毫升)60°C为30分钟。红花(10克),Laoguancao(10克),Hujisheng(10克),Zhicaowu(10克),和Xuduan(10克)分别加入80毫升水和提取与回流提取两次(每次3 h)。

QZC、Weilingxian Duhuo示例解决方案与水稀释25倍,而红花,Laoguancao, Hujisheng, Zhicaowu, Xuduan示例解决方案稀释25倍和10%甲醇水溶液UHPLC / Q-Orbitrap-MS分析,分别。

2.3。UHPLC / Q-Orbitrap-MS分析

定性分析进行UHPLC / Q-Orbitrap-MS(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)与色谱分离实现使用一个ACQUITY UPLC®本·C18(2.1×100毫米,1.7µ米,水域,米尔福德,妈,美国)在40°C。流动相系统是由0.1%的甲酸溶液(v / v)(一个)和甲醇(B)为0.3毫升分钟⁻¹根据优化后,执行梯度程序:0 - 5分钟,3% - -9% B;5 - 9分钟,9% - -15% B;9 - 11分钟,15% - -17% B;第11 - 15分钟,17% - -27% B;15—18分钟,27% - -28% B;18-26 min, 28% - -50% B;26-31 min, 50% - -66% B;31-35 min, 66% - -74% B;35-36分钟,74% - -3% b质谱仪进行了积极和负离子模式与质心女士和女士²光谱记录从100年到1500年m / z完全和dd-MS女士²(TopN)模式在70000年和17500年的一项决议,分别。最大注射时间被设定为50和100 ms ms¹和女士²,分别。自动增益控制(AGC)的目标¹和女士²是3 e⁶和1 e⁵,分别。女士最优参数如下:喷涂电压、−2.5 kV在负离子模式下和3.5 kV在正离子模式下;35 Arb鞘气体流速;辅助气体流量,10 Arb;毛细管温度、350°C;辅助气体加热器温度,350°C;碰撞能量在20、40和60 eV。所有的数据获取和处理的热科学™Xcalibur™系统。

2.4。网络药理学分析

的结构公式和IUPAC-NIST化学标识符(InChIs)的化合物从PubChem获得数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),上传SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/)和BATMAN-TCM数据库(https://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)获得他们的目标。所有的目标是减少,然后导入到创新路径分析(IPA)岩心分析,确定典型化合物的途径和网络,目标,和疾病。

3所示。结果与讨论

3.1。表征的化学成分祛风类Zhitong UHPLC / Q-Orbitrap-MS胶囊

QZC的化合物被UHPLC / Q-Orbitrap-MS分析在积极和消极离子模式。结果,与文献报道61种化合物的特点是比较,包括16糖类,15有机酸、13生物碱,七个黄酮类化合物,六环烯醚萜苷,一个糖,两个醛,和一个皂苷,其中31个化合物经与参考物质。确定化合物的碎片离子如表所示1女士,QZC样本和参考化合物的光谱显示在图中1,分别。个别草药的女士光谱图所示2。化合物的化学结构鉴定与参考物质相比QZC图所示S1。

香豆素类,广泛分布于植物的家庭芸香料和伞形科,已报告有不同的治疗特性,如抗菌、抗肿瘤和antidepression活动(22]。香豆素类主要来自Duhuo QZC被发现。离子在m / z187.03911 [M + H]⁺观察复合40在正离子模式下,其产品离子m / z159.04410 [M + H−有限公司)⁺131.04938 [M + H−−公司有限公司)⁺−143.04921 [M + H有限公司₂]⁺和115.05457 [M + H−有限公司₂−有限公司)⁺也观察到。复合40后被确认为补骨脂素乳沟香豆素,这与文献报道一致(13]。此外,化合物8,37岁,45岁,47岁,49岁,50岁,51岁,53岁,54岁,55岁,56岁,59岁,60岁,61人被确认为umbelliferone nodakenetin, columbianetin, angelol D, angelol, angelol B, angelol K, angelol G, columbianetin醋酸,isoangenomalin, angenomalin, osthole, isoimperatorin和columbianadin分别。

天然产物化学的不断发展和分析技术的不断改进,有机酸组件中医、绿原酸和没食子酸等,已发现有很强的活动,在全球范围内吸引了越来越多的关注。有机酸是指含有羧基酸性化合物(−羧基),主要分布在草药酸味,并被证明具有多种药理作用,包括抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集,具有重要临床应用价值在心血管疾病的预防和治疗23]。在负离子模式下,有机酸表现出类似的乳沟行为公司的损失₂H₂O,或有限公司化合物1、2、5、7、10、15、16日,19日,25日,28日,33岁,35岁,36岁,今年42岁,和57个被确定为奎尼酸、没食子酸、原儿茶酸、新绿酸,4-hydroxybenzoic酸、咖啡酸、绿原酸、cryptochlorogenic酸,corilagin,阿魏酸,鞣花酸,isochlorogenic酸B, isochlorogenic酸,isochlorogenic酸C, 12日和9日分别13-trihydroxy-10-octadecenoic酸。奎尼酸主要存在于Hujisheng。化合物1的质谱在负离子模式下显示quasimolecular离子m / z191.05511 [M−H]⁻其分子式推测为C₇H₁₂O₆,其碎片离子被检测到m / z173.00810 [M H−−H₂O)⁻,127.03873 [M H−−2 H₂O−有限公司)⁻和109.02816 [M H−−3 H₂O−有限公司)⁻。与解理模式在文献中报道相比,化合物1是确认为奎尼酸(10]。Isochlorogenic酸−C、新绿酸、绿原酸、cryptochlorogenic酸已被证明含有奎尼酸。复合33被确认为鞣花酸、没食子酸的常见二聚体,以quasimolecular离子的存在m / z300.99890 [M−H]⁻与碎片离子m / z257.00940 [M H−−有限公司₂]^{- - - - - -}和229.01354 [M H−−有限公司₂−有限公司)^{- - - - - -}(19]。

环烯醚萜苷、中医一种单萜衍生物广泛分布,各种各样的生物活性,如抗肿瘤、抗病毒、抗炎。环烯醚萜苷特征复杂的结构,主要包含半缩醛羟基和环戊烷环,容易形成的环烯醚萜苷和糖类。单糖或单糖残基的损失和中性分子等有限公司₂(44),H₂O (18), C₂H₂(26)和CH₂O(30),通常发生在环烯醚萜苷的质谱(18]。环烯醚萜苷的QZC大多来自XuDuan。在负离子模式下,复合30离子与展出m / z值为403.12555 (M−H)⁻,产生碎片离子m / z223.06062 [M H−−相关)⁻165.05470 [M H−−相关−CH₂首席运营官)⁻121.02822 [M H−−相关−CH₂首席运营官−有限公司₂]⁻和95.04887 [M H−−相关−CH₂首席运营官−有限公司₂−C₂H₂]⁻,这是符合secoxyloganin的质谱碎片。根据quasimolecular离子和二级碎片离子信息、环烯醚萜苷的分裂模式进行了分析。化合物20、27、29岁、46和52被确定为loganic酸,sweroside,马钱子苷,cantleyoside, triplostoside。

Aconitine-type生物碱在QZC Zhicaowu的主要活性成分,这些都是有效的和有毒的组件与镇痛,抗炎,circulation-promoting效应(24]。Zhicaowu消除风的影响,消除湿、变暖月经,缓解疼痛,这是相关的生物碱,如mesaconitine、海帕乌头碱,karakoline。总共13生物碱QZC只发现在正离子模式下。生物碱与乙酰苯甲酰组在8和碳14,分别被称为二酯二萜生物碱(dda)。鉴于8是第一个活性部位的谈判,谈判往往失去乙酰基侧链,形成稳定的碎片离子。乙酸(60)通常是远离8当二元酸酯生物碱裂解。复合48显示quasimolecular离子m / z616.31207 [M + H]⁺在正离子模式下产品离子m / z556.29083 [M + H−乙酸)⁺524.26385 [M + H−乙酸−CH₃哦)⁺和496.27423 [M + H−乙酸−CH₃哦−有限公司)⁺,初步确定为海帕乌头碱(16]。化合物6、12、13、14、17、18日,23日,24日,26日,39岁,43岁,和44被当成karakoline, songorine, mesaconine, isotalatizidine, napelline, aconine, hypaconine, neoline, talatisamine, benzoylmesaconine, benzoylaconine和benzoylhypaconine分别。

类黄酮是一种重要的类中药活性成分的一个广泛的生物活性,包括血管舒张,antihepatic损伤、抗痉挛药,抗菌、抗病毒,抗肿瘤,抗氧化,也可以用作食品添加剂,天然抗氧化剂,天然色素,等等。Retro-Diels-Alder (RDA)裂解反应包括损失和重排类黄酮糖苷配基C环在正离子模式下以不同的方式,在[M + H]⁺离子受到collision-induced离解失去中立的激进分子或分子,如H₂O, CO和C₂H₂O₂(25),而类黄酮苷容易失去糖基在多级乳沟。类黄酮在QZC主要来自红花。复合41初步确认为kaempferol-3 -O-rutinoside由于观察quasimolecular离子m / z593.15094 (mh)^{- - - - - -}在负离子模式下,产品离子m / z285.04004 [M H−−芸香糖渣)^{- - - - - -}163.00266 [M H−−芸香糖residue-C₇H₆O₂]^{- - - - - -}和151.00261 [M H−−−C芸香糖残渣₈H₆O₂]^{- - - - - -}。化合物9、21、31、32、34岁和38个被确定为safflomin hydroxysafflor黄色,6-hydroxykaempferol-3 -O葡萄糖苷、6-hydroxykaempferol carthamone, homoeriodictyol-7 -O- - - - - -β-D-apiosyl - (1⟶2)β分别-D-glucoside。

进一步证实了化合物的结构,共31个化合物与参考标准进行比较,验证了化合物2,4、5、7、10、15、16、19−22日,25日,28日,29日,30日,33岁,35岁,36岁,39岁,41−45岁,49岁,53岁,54岁的58 61−明确指定为没食子酸,5-hydroxymethylfurfural,原儿茶酸,新绿酸,4-hydroxybenzoic酸、咖啡酸、绿原酸、cryptochlorogenic酸,loganic酸,hydroxysafflor黄色,syringin, corilagin、阿魏酸、马钱子苷,secoxyloganin,鞣花酸,isochlorogenic酸B, isochlorogenic酸,benzoylmesaconine kaempferol-3 -O-rutinoside, isochlorogenic酸C, benzoylaconine、benzoylhypaconine columbianetin, angelol, angelol G, columbianetin醋酸,木通属皂苷D, osthole isoimperatorin和columbianadin(表S1)。

QZC的重要成分,据报道,RAKC生物碱,如aconine mesaconine,和hypaconine负责抗炎和镇痛功能。值得注意的是,毒性会发生RAKC滥用时,必须关注。中华人民共和国药典的规定,乌头碱的总量,mesaconitine, hypaconine必须不超过0.04%,benzoylaconitine的总量,benzoylhypaconine, benzoylmesaconine必须从0.02%到0.07%不等(7]。重要的是,剂量和疗程QZC必须更加关注在临床使用考虑到从RAKC风险检测的生物碱。

汞、说唱、RD和FC在QZC有效成分。从HG, corilagin报道施加antirheumatoid关节炎NF -差别通过对这些基因κB和MAPK信号通路(26]。在说唱osthole可以减少促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β,和il - 6,显示出可喜的镇痛效果27]。Hydroxysafflor黄色一个来自俱乐部,可以减少炎症介质的表达在滑膜组织,从而减少炎症和滑膜炎(28]。之一,此外,asperosaponin VI RD的皂甙可以显著抑制RANKL-induced破骨细胞形成缓解关节炎在活的有机体内(29日]。上述化合物发挥重要作用在RA的治疗。

3.2。网络药理学

作为一个开源的数据库,SwissTargetPrediction是一个基于web的工具,可以预测任何生物活性小分子配体的目标(30.]。异丙醇是一个图形界面生物信息学软件基于云计算,可以搜索一些重要信息,如基因、蛋白质、疾病、和经典通路(31日]。

基于发现的61种化合物UHPLC / Q-Orbitrap-MS网络药理分析进行了初步预测其潜在药理活性。61种化合物的化学结构和InChIs QZC从PubChem获得数据库和文献,被上传到SwissTargetPrediction数据库获得人类的目标除了hypaconine, angelol, angelol B, angelol D, angelol G, angelol K, columbianetin mesaconine, nodakenetin。BATMAN-TCM数据库被用来预测上述九的目标化合物,信用评分底线为3.351。1002之后获得的目标是消除重复,是进口926 IPA软件为核心分析目标检测。1002年目标61指数对应化合物QZC见表S2。RA被选为分析相关的疾病,导致173相关的目标,如表所示S3。网络“QZC-components-targets-RA”如图3(一个)。“Pathogen-influenced信号”被选为病原体感染的原因是一个重要的问题在风湿性关节炎的研究[32]。规范化pathogen-influenced信号通路分析的预测QZC目标如图3 (b)。

类风湿性关节炎的发病机制尚不清楚。目前的研究表明,炎症引起的Th1 / Th2细胞因子的不平衡是一个重要的病理机制(33]。主要Th1细胞分泌促炎细胞因子,如干扰素-γ(IFN -γ)和interleukin-1 (il - 1),促进炎性细胞因子的生产。Th2细胞主要分泌抗炎细胞因子如interleukin-4 (il - 4)和转化生长因子-β(TGF -β),抑制炎性细胞因子的生产(34]。Th1、Th2细胞平衡健康的人,而Th1细胞增加RA患者和Th2细胞减少(35]。NF -κB, ICAM-1、木菠萝、il - 6、IL-23 CCR1,和CCR3 Th1 / Th2信号通路密切相关,这可能是由QZC的化合物,这表明化合物从QZC可能参与的Th1 / Th2平衡信号通路,因此,打在RA治疗的作用。

结果表明,所确定的化合物被UHPLC / Q-Orbitrap-MS潜在药理作用治疗RA,揭示了现代调查方法QZC QZC和促进发展。

4所示。结论

在这项研究中,61种化合物在QZC被UHPLC / Q-Orbitrap-MS,包括16糖类,15有机酸、13生物碱,七个黄酮类化合物,六环烯醚萜苷,一个糖,两个醛,和一个皂素,草药追踪来源。其中,31个化合物也被明确地确定参考化合物,另一个30化合物初步根据他们的特征分化途径。网络药理学分析显示,所有检测到的化合物表现出潜在的药理作用治疗RA通过不同的信号通路。总之,这是第一个研究关注QZC的整体化学基础的分析,这有利于揭示QZC的生物活性化合物和潜在的应用价值。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Mengjie雪和利华国际张了同样的工作。

确认

这项工作是支持由中国国家重点研发项目(2021 yfc1712905),海河科技工程实验室的现代中药(22 hhzyjc00003),和创新的基于组件的中药和智能制造与multicrossed学科(没有。zyycxtd - d - 202002)。

补充材料

图S1:化学结构的化合物被比较与参考物质。的化学成分表S1:描述QZC相比参考物质。表S2: 1002目标对应61指数在QZC化合物。类风湿性关节炎相关表S3: 173年的目标。(补充材料)