文摘
肝癌转移是预后不良,死亡率的主要原因。为了克服低治疗效果,了解肝癌转移的生理属性是必需的。然而,转移性损伤是异构的和复杂的。我们研究油脂的分布使用matrix-assisted激光解吸/电离质谱法成像(MALDI-MSI)一个实验性转移模型。我们得到差异表达质量的峰值比较正常的网站和转移病灶。的关系质量收取比(m / z)和强度进行测量,m / z-indicated物种被MALDI-MS / MS分析,分析和识别这些大规模物种被确认使用METASPACEannotation®平台和脂质地图。MALDI-MSI在m / z 725.6, 734.6, 735.6, 741.6, 742.6, 744.6, 756.6,和772.6显示更高的强度,符合转移病变hematoxylin-stained组织。鞘磷脂SM (d18:0/16:1),磷脂酰胆碱(PC) [32:0], PC (31:0), PC[31:1],和PE[36:2]转移病灶中高度表达。我们的研究结果可以提供信息理解转移病灶。它表明,发现脂质可以转移病灶的诊断的生物标志物。
1。介绍
肝癌是常见的,是全球死亡率的主要原因1和在韩国2]。肝癌转移是导致患者死亡的肝癌和显示在肺部,门静脉,淋巴结和门户3]。制定一项战略,肝癌治疗,肝癌进展的理解是必需的。然而,异构癌症是复杂的。此外,肝癌微环境中发挥着关键作用在癌症进展(4]。解释的属性肝癌,组织学,cytopathological使用生物标记由专家进行了调查。因此,许多研究人员调查找出生物标志物和阐明肝癌进展的生物标志物的关系。然而,这是一个未满足的需要在肝癌领域。
各种分析方法应用于癌症研究。其中之一,matrix-assisted激光解吸电离(MALDI) /质量光谱成像(MSI)是一个功能强大的技术,显示分子分布在组织部分。MALDI-MSI揭示了肽的概要文件、脂质或代谢物在组织幻灯片(5]。最近的一份报告表明,这种方法可以分析化学组织和细胞之间的沟通(6]。特别是血脂水平使用MALDI-MSI研究结直肠癌转移(7和转移性乳腺癌8),以及主要的癌症。然而,脂质分布在肝癌转移并没有报道。在这项研究中,我们观察到的血脂水平使用MALDI-MSI肝癌转移模型。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
SK-Hep1_Luc细胞保持在杜尔贝科修改鹰介质(美国马热费希尔)包括10%胎牛血清(GW Vitek,首尔,韩国)和1% penicillin-streptomycin(美国TX GenDEPOT)。5%的细胞被孵化有限公司2孵化器在37°C。
2.2。肝癌转移动物模型
动物实验是协议批准后执行机构Duksung女子大学动物保健和使用委员会(2019-003-009)。极其免疫缺损(NRGA)小鼠(男,5-week-old)购买的是生物(水、韩国)。小鼠在实验前1周服水土。一百万年SK-Hep1_Luc细胞通过静脉注入小鼠(9]。监控,D-luciferin (PerkinElmer、欧盟)腹腔内注入转移动物模型和发光是一个发现的在活的有机体内成像系统(VISQUE体内精英,Vieworks、京畿道、韩国)(10]。
2.3。组织准备
在移植后30天,小鼠肝组织被孤立。10月组织嵌入化合物(徕卡FCS22、胡桃胡同、德国)切成10μ米厚部分使用cryotome(徕卡CM1520,徕卡)。组织部分是应用于氧化铟锡(ITO)涂布幻灯片。组织学分析的组织部分,组织部分与苏木精染色(H染色)和使用显微镜观察(莱卡)。
2.4。MALDI-MSI分析
组织部分用乙醇洗净,干在真空干燥器。谱矩阵为1.1毫升DHB使用/组织样本使用喷涂设备(ImagePrep,力量Daltonics, Inc .,不来梅,德国)。MALDI-MSI收购与MALDI-time飞行(TOF)的质谱仪(IDSys总理、旅行社有限公司、韩国)(11)检测正离子之间的质量范围m / z 600和m / z 1500年50μ50米的空间解决方案,每个像素,和1 kHz激光频率。MSIviewer(旅行社Inc .)被用来获得大规模成像和光谱感兴趣的地区。离子的识别在特定病变在MS / MS分析和搜索的MassBank北美数据库(蒙纳,https://mona.firehnlab.ucdavis.edu)、脂质地图®(https://lipidmaps.org),METASPACE注释平台(https://metaspace2020.eu)。
2.5。统计数据
转移的强度和正常组织相比,用平均值±标准偏差表示。统计学意义是由学生的计算t以及。一个概率值< 0.005被认为是显示统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。成像肝癌的转移
观察血脂水平转移,肝癌转移是由实验转移模型。我们监控转移使用在活的有机体内成像系统。人类肝癌SK-Hep1细胞主要定居在了老鼠的肝脏(图1(一)红色框)。孤立的肝癌转移可以观察到小鼠肝组织(图1 (b)黑色的箭头)。我们实验的结果转移模型模拟如何诱导肝癌细胞转移的病人。转移病灶在我们的模型类似于网站的转移肝癌患者(3]。
(一)
(b)
3.2。脂质转移病变和正常组织
MALDI-MS的光谱分析在肝组织中获得肝癌转移模型如图2。强度(y设在)代表平均在每个m / z值。之间的转移病灶显示强度高于正常组织m / z 700和m / z 800。分子量的范围从700年到800年由鞘磷脂(SM)和磷脂酰胆碱(PC) (12]。我们的研究结果还表明,常见的女儿离子m / z 184(胆碱磷酸SM的片段和PC)是检测到MALDI-MSI和UHPLC-MS /女士(补充图1)。选择和确定m / z物种,转移病变和正常组织的比值(m / N比率)计算。M / N比率是总结表1。名单显示,M / N比率在2.5或0.5下方 。识别这些大规模物种,开放存取数据库(莫娜,脂质地图®和Metaspace注释平台)是利用。这些群众的期望公式如表所示1。
分子的光谱物种在m / z 700∼850范围。每个样本MALDI-MS测定的四个幻灯片。每张幻灯片5点。
8 m / z显示转移病灶的高强度比正常组织和3 m / z强度下降。如图3,MALDI-MSI与H-stained组织学图像。选择质量MALDI-MSI物种表现出非凡的差异(图3(一个))。红色或黄色斑点代表高强度恰逢H-stained转移病变观察的组织部分。另一方面,m / z 796.6, 844.7和845.7显示一个小比例(m / N)。蓝色斑点的转移病灶(图中观察到3 (b))。
(一)
(b)
3.3。鞘磷脂,磷脂酰胆碱的生物标记肝癌转移
大M / N比率选择和分析来识别这些物种使用MALDI-MS / MS(表2)。MS / MS数据分析与质谱在蒙娜数据库相比,脂质地图®和METASPACE注释平台。我们算出了五个预期大规模物种:脂质SM (d18:0/16:1), PC (32:0), PC [31:1], PC(31:0)和PE [36:2]。有趣的是,SM (d18:0/16:1)和PC(32:0)观察钠(Na的公式+)和盐钾(K+)。
鞘脂类为基本控制信号在各种癌症细胞过程13]。鞘氨醇的骨干鞘脂类神经酰胺代谢,sphingosine-1-phosphate (S1P), SM等等(14]。尤其是S1P的平衡和C18-ceramide调节癌细胞生存15]。SM是众所周知的抑制细胞凋亡,诱导增殖16]。因此,SM在癌症的发展过程中起着至关重要的作用[17]。我们的研究结果表明,SM (d18:1/16:0)在肝癌转移病灶显著。741.6 m / z的高强度(SM [d18:1/16:0])也显示在甲状腺乳头状癌18],her2阳性乳腺癌[19),和胃癌20.]。然而,SM (d18:1/16:0)较低的表达在前列腺癌(21]。此外,高强度725.6 m / z (SM)显示在肺癌22]。
PC及其代谢物调控存活细胞增殖、迁移,和耐药性23]。因此,磷脂代谢的调节是一个很好的目标癌症治疗(24]。六个乳腺癌细胞系显示不同级别的电脑。PC(32:0)通常被观察到在乳腺癌、肺癌、直肠癌、食管、胃、甲状腺癌(25]。肺腺癌A549细胞和PC9细胞也显示电脑的表达[32:0][26]。
肝癌转移的主要观察两个脂质,SM (d18:1/16:0)和PC(32:0)显示在几个不同方面癌症与正常细胞相比。这些脂质被认为有助于肝癌进展。首先在这项研究中,我们的研究结果显示,这些脂质分子明显表现在肝癌转移。
4所示。结论
一些m / z显示更高的强度比正常组织从MALDI-MSI分析转移病灶。这些结果表明,MALDI-MSI可以诊断肝癌转移。几个物种鉴定从MALDI-MS / MS,阳离子的SM (d18:0/16:1)和PC(32:0)主要是表达。预计有肝癌转移的生物标志物。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果都包含在本文中并补充信息文件。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
昭熙俊Kwon和Joo Yeon噢了同样的工作。
确认
这项工作是支持由雾NRF拨款(NRF - 2021 r1a2c2004535)和优先级研究中心项目通过联盟(2016 r1a6a1a03007648)。
补充材料
图S1: UHPLC-MS / MS和MALDI-MSI分析数据。(补充材料)