文摘

试“Chachi”(CRC)叶含有丰富的黄酮类化合物,表明他们拥有好的营养/药理研究和发展潜力。本研究旨在探讨化学抗氧化剂质量标记基于spectrum-effect关系和CRC叶的质量控制策略。超高液相色谱(UPLC)系统是用于建立色谱指纹试“Chachi”叶子。同时,他们评估通过相似性分析(SA),层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)。后来,采用DPPH实验研究抗氧化效果。spectrum-effect关系UPLC指纹和DPPH自由基清除活性,研究了灰色关联分析(GRA)。分析结果表明,有二十一个常见的山峰14批次的CRC叶子从广东省不同地区,和他们的相似之处从0.648到0.997不等。HCA结果表明14批次样品的CRC叶子可分为6类的欧几里得距离5。深刻的结果表明tangeretin和橘皮苷是主要的类黄酮的抗氧化活性负责CRC树叶。总之,本研究建立了色谱分析方法适合CRC叶子和证明了色谱指纹分析结合抗氧化活性可以用来评估CRC叶子和可能的物质基础提供参考建立质量标准。

1。介绍

试“Chachi”(CRC)是芸香科柑橘类植物,可以用作药品和食物。目前,CRC的应用主要集中在皮的来源citri reticulatae pericarpium (CRP)在广东。c反应蛋白用于治疗呼吸系统和消化系统疾病包括消化不良、胃酸倒流,便秘,腹泻,以及其它胃肠道疾病的症状(1]。为了保护和促进水果、树叶的CRC每年定期修剪,导致大量的CRC树叶放弃了,这是一个潜在的资源浪费。这些叶子中只有一小部分是用作食品,例如,对茶叶和香料。我们研究小组的初步研究发现,CRC的叶子还含有丰富的类黄酮(2),这表明他们拥有好的营养/药理研究和发展潜力。

为了扩大市场申请CRC叶子,有必要建立质量控制策略和研究药理功效。因此,本研究旨在建立ultraperformance液相色谱指纹(UPLC) 14批CRC叶子和确定橘皮苷的内容,川陈皮素,tangeretin, 5-demethylnobiletin 14批次的样品。同时,他们正在评估使用相似性分析(SA),层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)。后来,采用DPPH实验研究抗氧化效果。spectrum-effect关系UPLC指纹和DPPH自由基清除活性,研究了灰色关联分析(GRA)。常见的山峰之间的相关系数和化学抗氧化活性可以用来探索CRC树叶的质量标志。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

14批CRC树叶收集在中国广东省不同地区进行分析,和列在表的详细信息1。树叶是干(60°C),减少粗均匀粉末,和在环境温度下保存在密封容器,直到需要。样本验证陈教授康(中医药大学、广州中医药大学、广州、中国)。

四个参考化合物(纯度≥98%),如橘皮苷tangeretin,川陈皮素,和5-demethylnobiletin获得从广州禁毒学院(广州);L-ascorbic酸从大茂化学试剂厂购买(天津);和DPPH(纯度≥97%)获得了从东京化工有限公司(上海,中国)。

色谱级乙腈是购自默克(达姆施塔特,德国);超纯水制备内部(18.2 MΩ·厘米;四川卓悦牌水处理设备有限公司,四川,中国);乙醇和磷酸(分析纯)购自默克(达姆施塔特,德国)和天津Kemiou化学试剂有限公司,有限公司(天津),分别。

2.2。UPLC指纹

2.2.1。制备样品的提取

均匀样品粉末(1.0 g)与含水乙醇提取(15毫升的50%解决方案w / w)在超声波水浴(100 w, 40 kHz)在室温下50分钟。额外的含水乙醇添加到弥补减肥期间提取、混合,经过0.22μm膜滤器(美国默克密理博)之前UPLC分析。

2.2.2。制备的标准解决方案

橘皮苷的标准解决方案(0.654毫克/毫升),tangeretin(0.398毫克/毫升),川陈皮素(0.120毫克/毫升),和5-demethylnobiletin(0.206毫克/毫升)是由溶解在甲醇;混合标准溶液是通过结合0.5毫升的每个标准的解决方案。

2.2.3。UPLC分析

UPLC分析进行了使用一个ACQUITY™UPLC™h级+系统(美国水域,米尔福德,MA)和一个光电二极管阵列检测器。提取(2.5μL)分离的ACQUITY UPLC本·C₁₈列(1.7μ米,2.1毫米×100毫米)维持在35°C,检测前在330海里。移动阶段由磷酸乙腈(A)和0.2% (v / v)在水中(B)以恒定流量0.3毫升/分钟,使用下面的洗脱程序:0-22 min, 8%到24%的溶剂;22分钟,24%到40%的溶剂;29-34 min, 40%到50%的溶剂;35-37 min,权力平等主义的50%溶剂;37-40 min,线性梯度溶剂从50%降至8.0%。

2.3。方法验证

2.3.1。校准线性

校准曲线得到每个类黄酮(橘皮苷,tangeretin、川陈皮素和5-demethylnobiletin)通过为每个类黄酮标准绘制峰面积响应(纵坐标)每六个浓度(横坐标);从最小二乘线性评估适合校准数据。

2.3.2。仪器精度

仪器精度决定从复制(6)注射单个样本提取解决方案;记录每个类黄酮的峰面积,计算标准偏差。

2.3.3。可重复性

复制分析的重复性评估(6)CRC叶子从相同的批处理;RSD的峰面积计算为每个类黄酮。

2.3.4。稳定

稳定性评估,再注入相同的样本提取解决方案(见2.2.1)在0、2、4、6、8、12和24小时;复制的rsd为色谱峰保留时间和地点为每个类黄酮测定。

2.3.5。恢复测试

每六个样品粉末(1.0 g)已知的类黄酮含量与适量的强化每个类黄酮。(见样本分析2.2.1和2.2.3计算每一个添加的类黄酮)和复苏。

2.4。相似性分析

UPLC数据分析处理使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件版本2012 (SESCFTCM)建议由中国国家食品药品监督管理局(3,4]。代表14个指纹,模拟色谱是自动生成的软件使用中值的方法。相似的色谱数据的每个不同批次的样品和参考色谱被计算。

2.5。杂环胺

共同UPLC山峰被定义为特征的区域分类14样品使用SPSS统计窗口,26.0版本软件(美国纽约阿蒙克的IBM公司)(5,6]。团体之间的联系方法和平方欧氏距离被用来测量不同样品间的亲密关系领域常见的山峰。

2.6。主成分分析

PCA用于观察样品的分布多元维度空间,探索独立变量之间的关系。因此,利用主成分分析法(PCA)分析了常见的14个样品峰使用SPSS统计窗口,26.0版本软件(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。主成分(PC)载荷矩阵构造使用21个山峰共有14个样本。每个电脑的载荷值的算术平方根除以每个自治组件的特征值为线性模型方程。替换后的归一化峰地区21个常见的山峰到线性模型,PC的分数得到每批样本。

2.7。DPPH自由基清除实验

工作解决DPPH(25毫克250毫升乙醇)制备和存储在黑暗中。L-Ascorbic酸被选为积极控制在10毫升50%乙醇(20毫克),,上面的解决方案是用50%的乙醇稀释成不同浓度的测试解决方案后的实验。样本提取连续稀释了6.25,12.5,25岁,50岁,100年,200年,400次。

DPPH工作方案(100μL)混合稀释样本提取(100μL) 96孔板。在黑暗中孵化了30分钟后,反应的吸光度为517 nm的解决方案。负控制解决方案没有抗氧化剂制备和作为相同的方式决定的。免费的自由基清除能力计算如下:免费自由基清除能力(%)= ×100%,一个₀负控制解决方案的吸光度没有抗氧化剂,然后呢一个₁样品溶液的吸光度是自由基的混合工作方案和样品的解决方案。结果表示为半最大抑制浓度(IC50;毫克/毫升)7,8]。

2.8。绿草

灰色关联分析是一种分析方法,包括多因素统计分析。它使用灰色关联度来描述数据之间的相关程度。集成电路₅₀被定义为参考序列,和共同从UPLC指纹峰的区域被定义为序列进行了比较。规范每个样品的峰面积和IC50值通过使用抓住,绝对差序列,相关系数和关联度。最后,潜在的抗氧化活性成分筛选根据关联度。

3所示。结果与讨论

3.1。UPLC指纹

3.1.1。方法验证

获得稳定和可复制UPLC指纹,所有特征峰的保留时间和峰面积测量相对于参考峰(hesperin)。hesperin的回归方程,tangeretin,川陈皮素、5-demethylnobiletin(表2)都显示良好的线性(R²> 0.999)。的rsd为精度、重复性、稳定性、和恢复参考类黄酮的不超过3%(表3)。之间的相关系数重复插入相同的样本获得的指纹提取解决方案和获得的常见模式指纹> 0.95。

3.1.2。相似性分析

每一批样本的覆盖色谱CRC如图1,三维色谱图显示在300 nm紫外线吸收光谱图所示2。有21个主要山峰UPLC色谱样品。其中,四个山峰被确定为橘皮苷(17)峰值,川陈皮素(19)峰值,tangeretin(20)峰值,和5-demethylnobiletin(峰值21;图3)。来弥补任何漂移在保留时间和峰面积响应变化,峰值17被指定为引用(RRT)计算相对保留时间和相对峰面积(战)的每一个特征峰(表4和5)。

使用SESCFTCM相似性分析的结果列在表中6。相似的数据表明,14批次的样品都不同,但在温和的和可接受的范围内。当相似度阈值设置为0.9,8和10个不同的样品。

3.2。类黄酮含量

每个引用的类黄酮CRC(表的每一批样本7)从他们的紫外光谱(图识别和量化4的斜率和截距)和线性回归校正方程,分别。大量的橘皮苷明显大于其他黄酮类化合物;tangeretin显示样品的最低浓度。

3.3。抗氧化活性

14批样品测定的抗氧化活动用DPPH实验。结果表明,DPPH清除率与浓度不是线性的。因此,概率单位法在SPSS 26.0软件被用于回归分析以适应相应的方程Probit (p)=拦截+ Bx,然后IC50值(样品溶液的浓度当Probit = 0.50)。(表的IC50值8;图5)表明,每个样本的间隙率顺序如下:S14系列> S7 > S1 >向> S5 > S2 > S6 > S12 > S3 > S9 > S4 > S10 > S8 > S11。

3.4。杂环胺

组与组之间的连接和平方欧氏距离间隔被用来建立系统树图HCA的14个样本,如图所示6。HCA结果表明,样本主要集中在欧氏距离为四类10在欧几里得距离5和6类。

根据表1HCA的结果并不与他们的地理位置密切相关。例如,S5和S7 S12和S2来自相同的位置,但他们在不同的集群分组。基地以来,我们收集了CRC叶子是相对有限,HCA的结果并没有显示出明显的区域特征。目前,主要的育种方法试“Chachi”ring-branch和嫁接,以不同的方式种植水果的味道也不同。此外,适用性的土壤理化性质对植物的生长和发育是至关重要的和次生代谢产物的积累9]。总之,嫁接等其他因素,根茎品种嫁接和土壤环境可能影响质量的CRC树叶。因此,有必要扩大样本范围收集和综合考虑的因素,如土壤因素,和类型的根茎,CRC叶质量的进一步研究分类和识别。

3.5。主成分分析

从十四21常见的山峰的数据样本受到PCA (SPSS 26.0)。提取的标准特征值大于1,前三个组件的累积贡献率为92.94%,表明这三个主成分(PC)可以代表大部分的指纹信息14个样本。如表所示9和10PC1的特征值和方差贡献率为69.358%,达到14.565和更高的山峰加载峰值,峰值7日14日峰值和峰值,表明这四个山峰PC1主要反映了信息。PC2的特征值是2.585,方差贡献率为12.308%,和较高的峰值负荷峰值12日20 (tangeretin),峰值和峰值21 (5-demethylnobiletin),表明这四个山峰PC2主要反映了信息。生物的特征值是2.367,方差贡献率为11.269%,和较高的峰值负荷峰值12日13日峰值和峰值19(川陈皮素),表明这四个高峰主要反映了生物的信息。进一步可视化结果,数据导入SIMCA软件15.0版本(Umetrics、瑞典)获得二维分析情节(图7)。如图7,样品主要是集群分为六类:S10, S6, S4,向,S3;S11 S7、S12 S14系列;S8;S2;S9;和S1, S5。主成分分析的结果与HCA一致。在样本中,S8分布在圆质量差,这被认为是一个异常值,这个结果是符合“相似性分析。”

3.6。绿草

3.6.1。Fingerprint-Efficacy关系

之间的关系21常见的山峰和DPPH自由基清除活性使用草地模型成立。结果表明,每个色谱峰的贡献(X)对DPPH自由基清除活性依次(数量):X6 > X14 > X7 > * 13 > X16 > X20的> X17 > X9 > X19 > X10 > X18 > X21 > > X11 > X15 >的混合体X12 > X3 > X1 > X5 > X4 > X2(表11)。之间的相关分析结果21常见的山峰和抗氧化活性表明,峰值,峰值14日峰值,峰值13日16日峰值20 (tangeretin),峰值和峰值17(橘皮苷)相关的主要组件样品的抗氧化功效,和21常见的相关系数峰值超过0.6,表明抗氧化活性的CRC叶子是多种成分协同作用的结果。

操作。量效关系

之间的关系测量大量的hesperin, tangeretin,川陈皮素、5-demethylnobiletin每个样本和DPPH自由基清除活性也使用在草地模型决定的。结果表明,四种黄酮类化合物的内容没有抗氧化活性成正比。峰的平均含量20 (tangeretin)和峰值21 (5-demethylnobiletin)较低,但他们有很高的相关系数与抗氧化活性。的内容相反,17(橘皮苷)的最高峰值与其他三个组件相比,但它与抗氧化活性相关系数最低(表12)。

根据文献的报道,polymethoxylated黄酮是一类高度methoxylated柑橘特有的植物类黄酮(10),抗氧化剂(11心血管和脑血管疾病预防和抗炎作用。在这项研究中,5-demethylnobiletin tangeretin有很高的相关系数和抗氧化活性。因此,5-demethylnobiletin和tangeretin CRC叶子的内容可以作为索引建立的质量控制策略。

4所示。结论

总之,本研究建立了色谱分析方法适合CRC叶子和获得良好的色谱分离。草地上表明色谱指纹分析的结果结合抗氧化活性可以用来评估CRC叶子的物质基础。5-demethylnobiletin和tangeretin CRC叶子可以用作索引建立的质量控制策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Qin-Xin聂和Qiu-Xia张了同样的工作。

确认

作者想表达自己的感激之情EditSprings (https://www.editsprings.com/为专家提供语言服务)。本研究受保护物种资源的动态监测中国的草药在岭南,广东省没有。130年,广东省中医药局办公室的信(2020)。