文摘

封装的生物刺激素代谢物已经得到普及,因为它会增加他们的保质期,改善吸收,被认为是一个好的选择制造刺激植物生长和水果生产的产品。浮在表面的游离(CFS)获得九indole-3-acetic酸生产菌株(IAA)。Stenotrophomonas maltophilia(PT53T)产生最高的IAA浓度(15.88μg / mL) 48 h后孵化。CFS的应变,以及IAA标准分别封装在壳聚糖微粒(CS-MP)采用离子凝胶化法。分析了CS-MP通过傅里叶变换红外光谱(FTIR),显示吸收乐队在1641年,1547年,1218厘米⁻¹与羰基的振动有关C = O - h胺,以及壳聚糖之间的债券(气)和三聚磷酸钠(TPP)。未密封的CFS的影响,封装的慢性疲劳综合症(EN-CFS)和封装IAA标准(EN-IAA) seven-day-old番茄发芽和生长(茄属植物lycopersicum)幼苗进行了研究。结果表明,EN-CFS和EN-IAA显著( )种子萌发率增加了80.8%和77.5,分别。CFS和EN-IAA产生最大的地上部分的长度和鲜重增加的免费治疗试验。因此,得出应用EN-CFS或EN-IAA可能是一个不错的选择来提高番茄幼苗的萌发和生长。

1。介绍

促进植物生长的细菌(PGPB)或rhizobacteria (PGPR)建立互惠与植物的相互作用,促进营养吸收,水和收购并帮助抵消生物和非生物压力造成的负面影响1]。当应用于植物或根际,PGPB所产生的物质,称为激素或生物刺激素,生化和生理过程相互作用,影响植物代谢和形态,促进植物生长1- - - - - -5]。一些微生物能分泌激素作为次级代谢物,根据介质的构成和文化条件。Indole-3-acetic酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素、乙烯和激素的生理效应对植物的发展,影响植物的生长和促进对病原体耐药性的感应系统(6- - - - - -8]。激素被认为是生物刺激素;这些有机化合物合成了所有的植物在某些器官和运送到其他组织执行它们的功能(9]。目前,细菌胞外上层清液含有生物刺激素(CFS)是一种环境友好的替代昂贵的农用化学品的使用,主要是因为农药促进污染物质的积累,增加环境污染,降低微生物的多样性,促进土壤退化(10,11]。

细菌CFS是通过机械或物理分离的细菌细胞。他们从培养基成分包括物质,如激素和肽以及微生物生物防除等物质获得芽孢杆菌spp。(Iturin一个茉莉酸和surfactin等)(10]。单独的应用程序,这些化合物对植物有积极的影响。马匹et al。11]证明了CFS与堆肥、藻提取物、胡敏酸、氨基酸、或胞外改善植物生长。

研究最多的一个激素IAA,属于生长素。IAA是一种亲水性分子结构类似色氨酸,吲哚环。IAA参与多种生理过程,如细胞分化和伸长,组织分化,中等和侧根的形成,和响应光和重力(12- - - - - -14]。不同的细菌属合成IAA通过不同的生物合成途径,如indole-3-pyruvate indole-3-acetonitrile, indole-3-acetamide,色胺,侧链色氨酸氧化酶,tryptophan-independent通路(15]。细菌合成的IAA可能与bacteria-plant互动,作为殖民策略由phytostimulation受益。研究最多的细菌属生产IAAAzospirillum,洋葱,欧文氏菌,肠杆菌属,假单胞菌,根瘤菌,沙雷氏菌属,芽孢杆菌,不动杆菌,和Sphingomonas(4,16]。

目前,微粒子含有细菌激素可以用作植物生长促进剂、除草剂、杀菌剂、杀虫剂。然而,它们的大小,以及使用的有毒元素合成,可能会限制他们的使用17]。相比之下,壳聚糖封装(CHI-ENC)吸引了注意力,为壳聚糖(气)是一种天然的生物大分子和生物聚合物由2-acetamido-2-deoxy -β1,4-D-glucan链。壳聚糖(CHI)主要存在于甲壳类动物和昆虫的外骨骼,以及某些真菌的细胞壁,主要接合菌纲和藻类(18- - - - - -20.]。CHI-ENC可以帮助生物刺激素的合成化合物稳定,避免其迅速退化,促进逐步释放植物或种子。CHI-ENC合成最常见的方法是离子凝胶化,的电荷差异使质子化氨基壳聚糖组交叉连接的多价三聚磷酸盐阴离子(TPP) (19,21]。

CS-MP有益影响植物种子萌发、发展和增长,并帮助减少非生物压力的影响,并增加抵抗病原体引起的疾病,由于他们的抗菌效果22,23]。Valderrama et al。24)报道,壳聚糖纳米粒子(CS-NPs)装载IAA(质量比1:0.25)应用于生菜品种Crocantela在水培中显著提高叶片长度和干重。然而,也观察到高浓度的自由IAA对根长生长培养基有负面影响。黄平君et al。25]报道的潜在使用CS-NPs独自根长度,显示增加7.1至71%,这取决于浓度,封装代谢物和植物物种。等植物的咖啡,玉米,小麦,鸡肉,西红柿,它已经发现这种类型的封装有好影响地上部分的长度,新鲜和干重、总叶绿素,发芽,叶子,叶面积、茎直径、活力指数、二级根的数量,以及防止某些病原体如病圃,c、,p . capsici,美国菌核,g . fujikuori,答:以上,f . graminearum,c . michiganensis。

本研究的目的是合成壳聚糖微粒包含细菌和IAA CFS。一旦获得,他们的应用程序的影响番茄幼苗的萌发和生长。

2。材料和方法

2.1。剂制备

表1显示了IAA-producing菌株用于本研究。6个菌株获得的细菌收集Facultad de Ciencias Biologicas-Benemerita普埃布拉大学(FCB-BUAP),墨西哥,鉴定后由同一机构使用API20NE测试。三个菌株获得的细菌收集Centro de Investigacion en Biotecnologia Aplicada-Instituto Politecnico Nacional (CIBA-IPN),墨西哥和标识使用分子测试(16 s基因)。菌株的生长在营养肉汤(BD Bioxon 8 g / L)在32°C和连续搅拌在120 rpm为CFS 24小时生产。

2.2。定量测定IAA的细菌培养基

24小时后获得的细菌种类调整到10⁸cfu /毫升,1毫升的每个解决方案被接种到25毫升的营养肉汤补充0.5 g / L色氨酸(L-trp) pH值(梅尔)7 (7]。文化条件保持在32°C和120 rpm 48, 72和96 h评估IAA生产作为时间的函数。经过这一次,离心机在生长介质 15分钟在4°C和慢性疲劳综合症。500年μL暂停添加到500年μl (Salkowski试剂(2毫升2.5 FeCl₃+ 50毫升HClO₄50% (v / v))和完整的混合物在室温下孕育了30分钟。吸光度在535纳米26,27)是决心与IAA浓度使用标准曲线2 - 100的范围μ克/毫升。PT53T是最高的菌株IAA生产,随后通过红外光谱分析证实(力量顶点70;光谱范围4000 - 400厘米⁻¹使用120扫描,在模式衰减全反射(ATR)抽样单元进行分析)。

2.3。CFS冻干

细菌细胞被离心从生长培养基中删除 20分钟得到上层清液。然后,上层清液冻结在20°C 24 h,其次是ultrafreezing−80°C 5天,最后,冻干(Labconco, Mod。FreeZone 1 l冷冻干燥系统)在51 0.054°C和mbar获得慢性疲劳综合症。

2.4。制备壳聚糖封装

壳聚糖微粒(CS-MP)是由离子凝胶法提出的安东尼奥由于et al。28),做了一些调整。中等分子量壳聚糖(CHI, 75% - -85%脱去乙酰基,Sigma-Aldrich, 448877)溶解浓度为0.5毫克/毫升1% v / v的醋酸水溶液(梅耶CAS: 64-19-7)。四个不同的pH值(4、4.5、5、5.5)研究了通过调整解决方案10 M氢氧化钠(梅耶ca 1310-73-2)。三聚磷酸钠溶液(泛太平洋伙伴关系;迈耶猫7005 - 500 g) 0.7毫克/毫升中一滴一滴地添加到壳聚糖溶液3:1比在室温下的磁搅拌。CFS和IAA标准(98%,Sigma-Aldrich I3750)浓度的15.88,158.88,1588年和15880年μg / mL被封装在pH值5,随后用于接种番茄的种子。所有样品都准备一式三份和离心机 在室温下为30分钟。上层清液用于紫外可见测量和沉淀被允许干供红外光谱分析。

2.5。形态和粒径

的形态和大小CS-MP观察使用SEM-FE-JOL 7610 f扫描电子显微镜(日本东京)和牛津EBSD探测器2.0 kV电压加速度和二次电子探测器(SEI)。CS-MP样品被安装在碳带和干涂上盟/ Pd。获得的扫描电镜图像进行了分析与ImageJ 1.52软件(美国国立卫生研究所)来确定粒子的平均尺寸。

2.6。傅里叶变换红外光谱(FTIR)

CS-MP含有细菌慢性疲劳综合症(EN-CFS)和标准分析了IAA (EN-IAA)使用一个力量顶点70傅里叶变换红外光谱仪的光谱范围4000 - 400厘米⁻¹使用120扫描。CS-MP样本放置在表面的衰减全反射(ATR)抽样单元进行分析。

2.7。决心的封装效率

悬浮液与EN-CFS和EN-IAA离心机 30分钟。上层清液分离由紫外可见分光光度法进行分析。IAA的上层清液中估计使用IAA校准曲线。同样,EN-IAA决心的封装效率的函数中的IAA上层清液使用方程(1)[29日),IAA_我是初始的IAA和IAA吗_年代是浮在表面的数量。

2.8。接种CS-MP茄种子

番茄(Lycopersicum esculentum;从品牌Hortaflor球形结构)的种子了。与CFS接种,EN-CFS EN-IAA前三个冲洗进行无菌蒸馏水,然后,他们是用70%的酒精消毒10分钟和无菌蒸馏水冲洗5次(30.]。在体外,四十种子接种1毫克/毫升的封装,放置在60%琼脂,离开发展7天30°C在黑暗中(31日]。发芽率、根长、和地上部分长度(Steren游标mod。她- 411)以及鲜重(美国规模衡量GEMINI-20便携式毫克)25幼苗被记录。

2.9。实验设计和统计分析

实验包括两个因素:一个)代谢物的浓度,(B)类型的代谢物表示(或为其制备方法)。四个实验变量,研究了经过7天的幼苗生长:发芽率、根长、地上部分的长度,和新鲜的重量。因素一个包括五个层次的代谢物浓度(0、15.88、158.8、1588和15880μg / mL)是根据他们的数量级,调整使用IAA从应变PT53T作为参考和考虑无菌蒸馏水作为消极的控制(零)。B因子包括三个层次:慢性疲劳综合症,EN-ECFS, EN-IAA。所有的实验进行了一式三份和分析Kolmogorov-Smirnov正常测试使用Statistica v14.0.0.15软件。结果显示在数据表示为平均值±标准偏差(SD)。治疗之间的差异的显著性水平是评估使用双向方差分析(方差分析)。平均值是分开使用图基的测试( )。响应面分析使用MINITAB16和Excel软件。

3所示。结果与讨论

3.1。生产的细菌含有IAA的慢性疲劳综合症

所有菌株评估显示IAA生产,Stenotrophomonas maltophilia(PT53T)产生的应变,48 h后IAA浓度最高的文化。另一方面,Ewingella美国(肌力)和Brevundimonas vesicularis(2 h2b)显示最高产量在72和96 h,分别(表2)。基于这些结果,应变PT53T被选中作进一步研究。

IAA作为细菌次生代谢物生产受pH值、温度、培养基成分(碳和氮源),细菌物种,增长阶段(固定相),添加不同浓度的L-trp [30.,32- - - - - -34]。它已被证明美国maltophilia能促进植物生长,刺激病原体的控制,增加植物对不同类型的胁迫的耐受性由于激素如IAA的生产和保护酶(35]。Adeleke et al。36)表明,基因等trpABCD。amiE,米娅一份礼物在这种细菌通过indole-3-acetamine IAA合成途径有关。

产生的IAA的浓度美国maltophilia压力被认为是低的。然而,添加不同浓度的L-trp IAA在很大程度上造成了增产,从3.9μ克/毫升2.5毫克/毫升(30.,32- - - - - -34,36]。细菌生长在磅中掺入了L-trp前体的浓度25 ug /毫升IAA 24 h内增加24%。也观察到浓度更高(100 - 400 ug /毫升)的前体IAA产量增加到79±2。55 ug /毫升。然而,研究进行长时间(7天)浓度的报道30 ug /毫升(37]。酵母麦芽L-trp葡萄糖(YMD)中补充了0.1%,4天的孵化时间导致了IAA浓度为2.5 mg / mL的媒介美国maltophiliaBE25隔绝的根香蕉(30.]。相比之下,IAA减少生产观察更长的潜伏期(38]。

红外光谱分析IAA标准(图1(1)营养肉汤(控制)(图1(2))和提取数据1(3 - 5),对应于最高的3株IAA生产(PT53T、肌力和2 h2b)如图1。在1636厘米吸收带⁻¹显示- c = O伸缩振动的羧基。高峰集中在1350 - 1650厘米⁻¹出现的不对称烷基(ch2)伸展运动组、和峰值为1094厘米⁻¹有关碳氢键弯曲振动(39- - - - - -41]。

3.2。紫外可见光谱分析

最大强度为所有光谱在280纳米(图得到2),从最低到最高的IAA浓度(24 - 85μg / mL)。国际标准的校准方程(y= 0.029x+ 0.121)获得的最大强度之间的线性关系乐队在280 nm和IAA浓度。阅读对应的上层清液中IAA (42,43]。

图3显示了紫外可见吸光度值280海里的IAA标准测量离心后的上层清液(左轴)一旦IAA的封装标准应用两种类型的最初的反应是由分别TPP + IAA和气+ IAA。壳聚糖粒子的封装效率(右轴)估计的IAA浓度使用校准方程和上层清液,随后,方程(1)。表3显示了IAA浓度决定上层清液和封装效率。pH值4和4.5暂停是透明的;然而,pH值5和5.5,悬架是乳白色的。封装效率最高(85.88%),观察到pH值5,IAA时加入跨太平洋伙伴关系(TPP的最初反应+ IAA)。

测量从紫外可见分光光度法进行测定,发现当IAA加入气(CS-MP准备过程),免费的IAA在上层清液,封装效率很低。然而,当IAA纳入TPP,自由IAA在上层清液的浓度低(20 - 35μg / mL),封装效率高(80% - -85%)。同样,当IAA和细菌性慢性疲劳综合症都添加到壳聚糖、低比例的封装,在pH值5.5,给出的条件是封装的比例最高(54.74%)。

3.3。红外光谱分析EN-CFS EN-IAA

当TPP被纳入壳聚糖(CHI)在国际标准的封装和慢性疲劳综合症,半透明的解决方案成为乳白色的,表明壳聚糖之间的静电相互作用和泛太平洋伙伴关系;阿加瓦尔et al。21),提到这种效应与小颗粒的形成。在pH值4、5和5.5,高乳白光观察控制粒子(空白颗粒)和那些包含标准IAA或慢性疲劳综合症。乳白光与TPP-CHI交互和pH值,尽管在pH值低于4.5粒子合成是不可能的。然而,在pH值高于5,产生更均匀的悬浮液(44]。

图4显示的红外光谱谱前体(CHI和TPP)和粒子获得并用于封装标准IAA和慢性疲劳综合症。壳聚糖的光谱显示了两个吸收乐队在1154和1075厘米⁻¹相关,非对称C-O-C拉伸的糖苷键和切断拉伸振动,分别(21]。TPP的光谱显示了两个乐队在1210厘米⁻¹和899厘米⁻¹,这可能与P = O拉伸和P-O / P-O-P振动,分别为(45,46]。当两个化合物(CHI和TPP)反应形成目标粒子,所得到的红外光谱谱显示三个特定的乐队,他们的互动。观察这些乐队在1641、1547和1218厘米⁻¹;羰基和相关的C = O - h胺,以及气之间的债券和TPP,分别表示粒子形成(47,48]。

的红外光谱谱EN-CFS和EN-IAA显示相同的三个吸收乐队在1642年,1547年,1218厘米⁻¹,如图5相关,CS-MP的形成。没有其他乐队对应CFS代谢物观察,表明CFS是内部的微粒子,所表示的紫外吸收的结果。此外,其他吸收乐队在1450年和1690年观察到厘米⁻¹对应于烷基(ch₂分别)和羰基。所有这些结果同意这些报道Sachdev et al。32)和帕特尔和帕特尔(40]。

3.4。形态和微粒的大小

形态和粒径的CS-MP被扫描电子显微镜分析。在封装的情况下控制(空白CS-MP),他们的大小是2.31±0.86μm(图6(一)),实现大尺寸比报道安东尼奥由于et al。28]。然而,这种差异可能来自于分子量(100 kDa)和脱乙酰作用程度(90%)所使用的那些研究人员与本研究中使用的参数(190 - 310 kDa, 75% - -85%)。微粒的形状和大小受pH值的影响,壳聚糖的分子量、浓度的解决方案,气/ TPP分子比率,以及使用的搅拌条件和醋酸的比例(49,50]。为EN-CFS浓度的15.88和15880年μ克/毫升,平均粒径7±1.95和2.76±0.160μm,分别确定(数字6 (b)和6 (c))。EN-IAA包含15.88和166μg / mL的IAA标准显示的平均大小为3.98±0.160μm(图6 (d))和4.65±0.076μm(图6 (e)),分别。多项研究表明,粒径的增加是IAA加法和有效的结果封装的代谢物(24,51]。此外,一些集群观察,可能与絮凝效果的交互正电荷的指控,因为除了IAA (52]。几篇报道提到在3:1比率(气:TPP)聚合形成的可能性(21]。

3.5。番茄种子接种和幼苗生长

图7显示了结果的变量被认为是在实验设计:发芽率、根长、地上部分的长度,和新鲜的重量。结果后幼苗被允许种植(图7天8)。

所有四个变量:发芽率、根长、地上部分的长度,和鲜重影响之前定义的两个因素,显示了一个双向方差分析分析。表4总结了主要的统计参数常用的治疗是否会影响一组特定的变量(反应)。

图9显示了响应面和等高线图这两个因素的综合效应(代谢物浓度和方法)对发芽率和根的长度,分别。根据发芽率响应面和等高线图,代谢物浓度的15.88 15880μ使用方法2 g / mL (EN-CFS)生成一个萌发率为80.8%(数据9(一个)和9 (b)。77.5%的相似的结果,实现了方法3 (EN-IAA)使用15.88μg / mL,最后,发芽率80%是通过方法1 (CFS)为158.8μg / mL代谢物浓度。根长度响应面和等高线图,观察根长度减少所有代谢物浓度(数字9 (c)和9 (d))虽然观察略有增加浓度为15.88毫克/毫升使用方法2。数据10 ()- - - - - -10 (d)显示了响应面和等高线图这两个因素的综合效应(代谢物浓度和方法)在地上部分的长度和鲜重,分别。根据地上部分长度的响应面和等高线图,8.27厘米的最优值是获得使用方法3(封装IAA标准)为15.88μ克/毫升(数字10 ()和10 (b))。最后,鲜重的响应面和等高线图,获得了最优值的0.04 g使用方法1(自由细菌证监会)(数据10 (c)和10 (d))。0.04克的另一个最优值也获得使用方法3(封装IAA标准)为15.88μ克/毫升。

快速退化IAA和CFS是外源性应用的缺点之一,就是增加了几个因素如盐度、温度和农用化学品的使用(10]。然而,这些代谢物的微型胶囊显示增强吸收效率与有益的对植物的影响(53]。在这个研究中,EN-CFS(方法2)和EN-IAA(方法3)提高萌发率(数据是最好的选择7(一)和7 (b))。目前,研究了不同的策略,例如应用于本研究来提高植物的生长。PGPR的使用、生物刺激素和最近研究了chitosan-based密封剂的实现,最终的产品被应用通过叶面或植物根系。不同作者指出,壳聚糖的加入封装或其衍生品已经显示出积极的影响的增加生物量、根长度、开花,mycorrhization,生物电控制,甚至在植物激素的增加生产31日,32,54,55]。

茄种子,接种与0.1毫克/毫升的空对发芽率CS-NPs有积极影响,新鲜和干重、长度、和活力的幼苗。此外,结果表明,这些粒子诱导植物防御反应以及水杨酸(SA)的生产,茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和代谢途径的激活与酚类化合物的生物合成31日,55,56]。安德拉德et al。57]使用chitosan-alginate纳米粒子含有IAA和细菌IAA,将它们添加到植物25日30日和移植后45天,观察到显著影响植物生长。在其他植物,如小麦、浓度的增加CS-NPs 5μ克毫升⁻¹对种子萌发和幼苗长度产生积极的影响,以及增加的不定根数量(23]。比较我们的结果与报道的文献提到的,我们的封装产品显示出良好的对番茄种子萌发和幼苗生长的影响。然而,当增加IAA的浓度,观察根和地上部分长度减少。这个同意与其他文献的报道指出,低生长素浓度对植物生长有刺激作用,而更高的生长素浓度有抑制作用(30.,40,58]。

4所示。结论

使用细菌CFS包含生物刺激素化合物如IAA和壳聚糖微粒的形式可能是一个很好的选择种子萌发和幼苗生长。此外,这些粒子降低灵敏度,湿度,温度,和土壤成分,增加货架寿命,减少应用程序过程中暴露于污染。因此,慢性疲劳综合症和EN-CFS会避免细菌的使用和释放到环境中,特别是因为大约10⁸-10年⁹CFU / g需要有一个成功的商业作物改良产品,此外,一些作者建议检查毒素生产或使用的菌株的致病性。在未来,生物肥料,包括CFS封装在壳聚糖可以生成一个至关重要的改变作物生产可持续发展的方法。番茄发展的实验研究在其他阶段和其他植物物种可能需要寻找其他形式的应用程序来了解植物和微粒子之间的相互作用的机理,以及观察代谢产物释放的过程封装后打开。

数据可用性

(https://1drv.ms/u/s ! AheVVJ1zvLUX8z7zx8zw7zmU3zAH ? e = ATpnkq)数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突的作者,研究,和/或出版。

确认

作者要感谢Secretaria de Investigacion y Posgrado IPN的金融支持和Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACYT)高等教育奖学金(没有。662146)Thania孤独冈萨雷斯蒙特福特获得博士学位。