评估神经氨酸酶抑制活性化合物和提取物HPLC-FLD传统药物

文摘

建立了一个简单而有效的方法和验证,以确定4-methylumbelliferone (4-MU)筛选的自然神经氨酸酶抑制剂(仙女虫属)从传统药物(TMs)的高效液相色谱法结合荧光检测(HPLC-FLD)。4-MU和经颅磁刺激的化合物分离常春藤TM ODS柱(5μ米,4.6×250毫米)使用一个权力平等主义的的55%甲醇洗脱35°C。流量是1毫升分钟⁻¹。激发和发射波长在320 nm和480 nm。提取的经颅磁刺激和化合物被选为例子来演示HPLC-FLD新方法的可行性。结果发现大多数化合物除了汽车荧光物质由HPLC-FLD在良好的协议与NA enzyme-based抑制实验。比较传统的NA enzyme-based抑制化验,HPLC-FLD方法可以防止干扰化合物的荧光颜料。它被认为是一个简单、有效和经济技术从传统药物筛选的自然神经氨酸酶抑制剂。

1。介绍

流感已经成为一个伟大的关注近年来世界各地的一个主要卫生问题。化学合成神经氨酸酶抑制剂(仙女虫属)被广泛用于预防或治疗流感的抗病毒药物(1]。扎那米韦和奥司他韦是两个常用药物引入临床实践作为仙女虫属,但一些突变的临床意义尚不确定2- - - - - -4]。幸运的是,传统药物(TMs)和他们准备清算和热解毒有非常好的治疗效果治疗流感在中国(5,6]。据报道,某些小分子被确定为潜在的自然神经氨酸酶抑制剂黄芩和Reduning注入(金银花,茵陈annuae,栀子提取)[7,8]。传统医学资源是一种潜在的抗病毒药物筛选仙女虫属的重要来源。因为经颅磁刺激的化学成分很复杂,它非常需要建立一个新的快速筛选方法,有效的,从经颅磁刺激和自然仙女虫属。

NA enzyme-based抑制化验是最广泛用于评估潜在能力的化合物或提取物经颅磁刺激的荧光分光光度法(FL)。最近,一步法高效液相chromatography-fraction收集器和飞行时间质谱(HPLC-FC / Q-TOF-MS)或超高液相色谱加上二极管矩阵检测器和autofraction收集器/飞行时间质谱(UPLC-DAD-FC / QTOF-MS)加上生物活性分析被用来屏幕从TM提取和识别自然仙女虫属7,8]。affinity-based超滤UPLC-QTOF-MS分析了确定有效的细菌仙女虫属的植物提取物(9]。在这些报道方法,与自体荧光如黄酮类和香豆素类化合物筛选样本可能非线性干扰的荧光测量4-methylumbelliferone (4-MU)造成假阳性或高度评价结果(10]。为了解决这些问题,neuraminidase-immobilized毛细管微反应器被应用到屏幕自然仙女虫属中药。然而,该方法具有低灵敏度和重现性。这些提到的事件提高筛选的需要探索一种新的方法从TMs自然仙女虫属。

高性能液相色谱结合荧光检测(HPLC-FLD)方法是一种常用的分离方法,经颅磁刺激,已被应用到各种操作。关于HPLC-FLD有一些报告,包括确定雌激素荷尔蒙,氨基酸,和黄曲霉毒素11- - - - - -13]。敏感和具体是避免假阳性结果在NA enzyme-based抑制化验一些自体荧光化合物。因此,一种新的方法HPLC-FLD成立加强优点,避免缺点。

工作的目的是建立一个简单而有效的方法来确定4-MU筛查HPLC-FLD TMs的仙女虫属。HPLC-FLD方法适合屏幕的化合物从复杂的经颅磁刺激潜在能力抑制NA。筛选化合物的干扰消除了样品分离的组件,使用HPLC-FLD衬底和产品。积极的药物拉米韦被用来验证试验作为参考抑制剂。某些类型的化合物有或没有自体荧光如香豆素类、ridoids,类黄酮和酚酸和四个草药被选来验证筛选的可行性自然仙女虫属HPLC-FLD经颅磁刺激的方法。HPLC-FLD方法是高效、更稳定的经济和可行的屏幕仙女虫属与NA enzyme-based抑制化验的结果。此外,HPLC-FLD建立的新方法可以有效地避免一些与自体荧光化合物造成的假阳性结果,提高筛查试验的准确性。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

酶NA,底物2′- (4-methylumbelliferyl)α- - - - - -D-N-acetylneuraminic酸钠salthydrate (4-MuNeu5Ac),产品4-MU(图1),和积极的药物拉米韦获得Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。甲醇的高效液相色谱检测(美国Dikma技术公司)等级。去离子水净化用Milli-Q学术水净化系统(美国微孔,米尔福德,MA)。分析试剂、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠是购自天津Kermel科学公司。参考化合物5 ridoids (genipin、京尼平甙shanzhiside甲酯,geniposidic酸,和8-O-acetyl shanzhiside甲酯),五个酚酸(绿原酸、新绿酸、cryptochlorogenin酸,isochlorogenic酸,和isochlorogenic酸C),两类黄酮(黄芩苷和黄芩甙元),和9香豆素(香豆素、notopterol花椒毒素,isoimpemtorin,补骨脂素,angelicin, xanthotol, bergapten,和osthole)都从成都服务台购买生物技术有限公司有限公司(中国成都)。

2.2。仪表

HPLC-FLD分析进行一个安捷伦1100液相色谱系统,荧光检测器(盛名)。样例分析进行一个常春藤TM ODS(4.6×250毫米,5列μ米)在35°C最小流量为1.0毫升⁻¹。洗脱程序权力平等主义的16分钟,45%的水和55%的甲醇,注入体积是10μl .根据神经氨酸酶抑制剂的指示屏幕工具包(Beyotime生物技术、P0309),激发和发射波长的盛名是设定在320 nm和480 nm,分别(图2)。

2.3。准备的解决方案

2.3.1。制备的酶、底物和产品解决方案

缓冲溶液是准备通过添加适量的磷酸二氢钠适量的磷酸氢钠直到pH值达到6.0。股票的解决方案的NA和4-MuNeu5Ac溶解在磷酸盐缓冲溶液的浓度25 U mL⁻¹和10μ克毫升⁻¹,分别。与甲醇产品4-MU准备。所有的解决方案都是储存在−20°C。

2.3.2。参考化合物的制备

京尼平甙,参考化合物genipin shanzhiside甲酯,geniposidic酸,8-O-acetylshanzhiside甲酯,绿原酸、新绿酸,cryptochlorogenin酸,isochlorogenic酸,isochlorogenic酸C,黄芩苷,黄芩甙元,香豆素,notopterol,花椒毒素,isoimpemtorin, imperatorin,补骨脂素,angelicin, xanthotol, bergaptenosthole,拉米韦都准备用50%甲醇溶解股票1.0毫克毫升的浓度⁻¹8和稀释成不同浓度的生物,然后储存在4°C。

2.3.3。制备的样品

Scutellari abaicalensis,羌活incisun、栀子、和Lonicer粳稻被从不同的市场和获得认证Guangying Yu(天津医院)。所有草药停飞成粉以提高萃取效率。n incisun和g . jasminoides粉(10.00 g)被添加到250毫升容量瓶超声30分钟和20分钟,分别。美国abaicalensis粉(5.00 g)溶解在500毫升甲醇,70%金银花(5.00 g)制备甲醇为50%。两种解决方案都是超声波40分钟和30分钟。四个草药提取物被合并、压缩和旋转蒸发干了。的提取效率s . abaicalensis n . incisun g . jasminoides和金银花29.4%,23.03%,23.74%,和28.2%,分别。然后,所有样品都储存在4°C。

2.4。方法验证

HPLC-FLD方法验证包括线性、检测的局限性(LOD),量化的极限(定量限),在美国食品药物管理局指导下和精度(14]。稳定和恢复测试执行之前根据文献[15]。HPLC-FLD方法的结果与被NA enzyme-based抑制化验证明新方法的可行性。

2.4.1。线性、LOD和定量限

4-MU的校准曲线是由绘制峰面积(y根据对应的浓度()x毫升,⁻¹)。检测的局限性(LOD)和量化的极限(定量限)值计算信噪比(S / N)3和10的比例稀释的最高浓度混合解决方案进一步在一定浓度,分别。

2.4.2。精密、稳定和复苏

内部和interday精度的分析是评估六个重复注射三种不同标准溶液的浓度(低、中、高)在同一天和连续三天,分别。精度是表示为相对标准偏差(rsd)。参考解决方案在三个不同的浓度是由复制注射在2、4、6、8、12、24小时的稳定性进行评估。计算出的复苏比较实验组与集团控制。实验组的解决方案是由飙升10μ在三个不同的L 4-MU(低,中,高)浓度与10个离心管μ25 L U mL⁻¹NA和280μ分别L磷酸盐缓冲剂。控制集团解决方案包括10μL 4-MU在三种不同浓度(低、中、高)和290年μ分别L磷酸盐缓冲剂。所有的解决方案都在六个复制。然后,混合解决方案根据上面列出的条件进行了分析。不同浓度的复苏4-MU公式确定的复苏(%)=(实验组amount-controlled组数量)×100%。

2.5。生物测定

2.5.1。确定最大抑制浓度(IC的一半₅₀)

线性回归方程,表示为y=斧头+b是用于确定产品的数量(4-MU)钠的反应和4-MuNeu5Ac之后。在96孔板进行实验。70年μL磷酸盐缓冲剂,不同数量(2、4、6、8、10μL)钠的浓度为0.25 U mL⁻¹不同数量(10、8、6、4、2)磷酸盐缓冲剂,和10μL 50%甲醇(因为所有的筛选化合物稀释50%甲醇)被添加到96孔板为了获得NA和产品的线性回归方程。筛选的化合物可以抑制NA, 70μL磷酸盐缓冲剂,10μL钠浓度的0.25 U mL⁻¹,10μL筛选化合物的解决方案在8整除的串行添加了合适的稀释96 -孔板。样本然后混合1分钟和孵化2分钟。最后一步是添加10μ每个在L 4-MuNeu5Ac 25的浓度μ克毫升⁻¹和摇动1分钟。孵化后30分钟,最后荧光值是读取使用Flex站3标(6]。样品都是一式三份。集成电路的计算₅₀5.01价值观进行程序GraphPad棱镜。在200年荧光检测μL甲醇被添加到每个,96 -孔板后再被使用微型板块读者读0 5、20日和30分钟来证明反应确实是终止。然后,所有解决方案都用移液器吸取到离心管,离心10分钟16650 g。上层清液的注入高效液相色谱法。值得注意的是,校准曲线进行了在每个板和每个必须重复三次。

2.5.2。公里决定

神经氨酸酶(10μ缓冲溶液(70 L)μL)和超纯水(10μL)被添加到96 -酶荧光板根据上述方法。然后,一系列浓度(0 - 284μ米)的神经氨酸酶荧光底物(10μL)补充说,振实,又和混合1分钟。孵化后37°C为30分钟,200年μL甲醇被添加到每个在96孔板。然后,所有解决方案都用移液器吸取到离心管,离心10分钟16650 g。上层清液的注入高效液相色谱法。的公里神经氨酸酶被GraphPad棱镜计算软件的价值。

2.5.3。Ki的决心

神经氨酸酶(10μL)与一系列浓度的混合拉米韦(10μL, 0 - 457μ和缓冲溶液(70米)μ在37°C L),孵化2分钟,然后,加上一系列的神经氨酸酶荧光底物的浓度(10μL, 0 - 284μ米)。在30分钟37°C,孵化后HPLC-FLD荧光检测。的Ki拉米韦被GraphPad棱镜计算软件的价值。

2.5.4。统计分析

所有的生物测定分析实验测量在一式三份。表单中的值是表示平均值±标准偏差(SD);集成电路₅₀值计算的程序GraphPad Prism 5.01。

3所示。结果与讨论

3.1。高效液相色谱分离条件的优化

衬底包括22个筛选化合物和拉米韦在常春藤TM ODS产品分开列(4.6×250毫米,5μ米),流动相组成不同的流速,柱的温度进行了为了达到良好的分辨率和对称的峰形状分析时间短。流动相的组成是由不同浓度的甲醇和乙腈。最优条件如下:权力平等主义的洗脱以55%甲醇16分钟。此外,列温度(25、35和40°C)和流率(0.8,1.0,和1.2毫升分钟⁻¹)也被调查。最后,柱温度和流量优化在35°C和1.0毫升min⁻¹,分别。图中所示的结果3表明该产品是4-methylumbelliferone。此外,HPLC-FLD方法可以应用到屏幕仙女虫属由于减少荧光反应后的产品的价值。

3.2。方法验证

3.2.1之上。线性、钟表和定量限

线性回归方程4-methylumbelliferone(产品4-MU)如下:Y= 0.6608x+ 0.1247。线性范围介于0.16 ng毫升⁻¹ng - 100毫升⁻¹。获得了良好的线性关系r²= 0.9997。4-methylumbelliferone的LOD和定量限价值0.05 ng毫升⁻¹和0.16 ng毫升⁻¹,分别。这些结果表明,HPLC-FLD是高度敏感的产品4-methylumbelliferone的决心。

3.2.2。精密、稳定和复苏

盘中,interday精度在不同浓度(低、中、高)如表所示1。他们的相对标准偏差值小于2.66%和4.64%,分别。4-MU的稳定性进行了分析一天之内(0,2,4,6,8,12日和24 h, RSD值范围从2.95%到4.88%,准确性为102%至105%的范围。RSD值和复苏的范围在1.38%到2.58%和100%到102%,分别为(表2)。

3.3。生物测定

3.3.1。优化酶和底物的比例

考虑到不同比例的NA和衬底,不同浓度的钠与一定浓度的底物反应。三个浓度(10μ克毫升⁻¹,25μ克毫升⁻¹,50μ克毫升⁻¹)的基质进行调查评估不同比例的影响4-MU荧光值和峰面积,分别。数据4(一)和4 (d)暗示的荧光值和峰值区域4-MU增加线性低于0.25 U mL⁻¹NA。然而,这一趋势曲线减速后的浓度。因此,0.25 U mL⁻¹NA是选择最优条件反应的10μ克毫升⁻¹4-MU。当底物的浓度是25μ克毫升⁻¹,优化的结果是显示在数字4 (b)和4 (e))。变化趋势倾向于在0.25 U mL的浓度趋于平缓⁻¹NA。50μ克毫升⁻¹的底物也化验,结果中列出的数字4 (c)和4 (f))。荧光值和峰值区域4-MU随着浓度的增加而显著增加低于0.5 U mL⁻¹NA。

当底物浓度的10μ克毫升⁻¹,25μ克毫升⁻¹,50μ克毫升⁻¹NA是最佳的浓度为0.25 U mL⁻¹0.25 U mL⁻¹和0.5 U mL⁻¹,分别。发现之间没有显著性差异的结果取决于NA enzyme-based抑制化验和HPLC-FLD。在实验过程中,它是一个事实,更高浓度的基质和NA降低抑制潜在的在同一浓度的样品。相反,底物的浓度和NA较低;抑制的能力将会高度评价。最后,10的状况μ克毫升⁻¹的底物和0.25 U mL⁻¹NA是实现屏幕TMs的抑制剂。

3.3.2。抑制剂的筛选

为了验证酶活性的准确性,积极的药物拉米韦被选中来测试half-maximal抑制浓度(IC₅₀)NA enzyme-based抑制化验和HPLC-FLD方法。结果表明,公里神经氨酸酶的价值为93.23±9.03μ米和Ki拉米韦的价值为47.01±2.54μm。IC50拉米韦290±30μNA enzyme-based抑制化验和270±40μm×HPLC-FLD方法。这是证明的方法确定4-methylumbelliferone (4-MU) HPLC-FLD准确可以用来确定神经氨酸酶抑制活性的化合物。21天然化合物测定新方法。发现的钠抑制活动7个化合物(genipin geniposidic酸,8-O-acetyl shanzhiside甲酯,新绿酸,香豆素,notopterol,和花椒毒素)在测试浓度(500年低于50%μ克毫升⁻¹)。结果表明,这七个化合物有弱神经氨酸酶抑制活性。结果在表3展示了集成电路₅₀其他14个化合物的值(京尼平甙,Shanzhiside甲酯,绿原酸,cryptochlorogenin酸,isochlorogenic酸,isochlorogenic酸C,黄芩苷,黄芩甙元,isoimpemtorin,补骨脂素,angelicin, xanthotol, bergapten,和osthole)。结果表明,十四天然化合物显示潜在抑制NA。抑制势排名依次为:shanzhiside甲酯>拉米韦> >黄芩苷、黄芩苷> isoimpemtorin >补骨脂素> isochlorogenic酸> xanthotol > isochlorogenic酸C >京尼平甙>绿原酸> angelicin > osthole > > bergapten cryptochlorogenin酸。的排名顺序黄芩甙元>黄芩苷抑制能力符合先前的文献[所示16]。四经颅磁刺激s . baicalensis n . incisun g . jasminoides和金银花被进一步用于屏幕抑制活动由于四TM提取上述21组件筛选,分别。所有提取被稀释到10个不同的浓度来计算IC₅₀值。结果显示在表中4建议四个NA TMs提取物具有良好的抑制活性。实验结果同意的(17),除了g . jasminoides因为没有发表。s . baicalensis n . incisun和金银花提取物表现出显著的抑制活性在40 NAμ克毫升⁻¹。然而,集成电路₅₀的三个值提取共218名μ克毫升⁻¹,4.44μ克毫升⁻¹,1392μ克毫升⁻¹,分别。不同的集成电路₅₀值引起的两项研究可能与不同的系统分析。总之,中药的事实四提取高效抑制NA活动得到进一步证实。认为HPLC-FLD方法是高效、更稳定、经济、可行的同时屏幕仙女虫属来自TMs化合物和提取。

4所示。结论

建立了一个简单而有效的HPLC-FLD方法和验证确定4-methylumbelliferon筛查自然神经氨酸酶抑制剂(仙女虫属)从传统药物。与NA enzyme-based抑制化验的结果相比,该方法敏感性,有效,经济占LOD和定量限值极低,稳定性高,精度好。此外,该方法可以大大减少自发荧光物质所造成的假阳性结果NA enzyme-based抑制化验。得出的新方法确定4-methylumbelliferone HPLC-FLD奈传统药物是一种很有前途的筛查工具。

数据可用性

数据用于支持本研究的结果都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了项目集成中医和西医天津卫生和计划生育委员会(2015092)。

引用

1. a·梅耶尔h . Rebelo-de-Andrade诉柯瑞亚et al .,“全球更新人类流感病毒神经氨酸酶抑制剂的敏感性,2012 - 2013,”抗病毒研究卷。110年,31-41,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. A . s . Monto d·m·弗莱明·d·亨利et al .,”神经氨酸酶抑制剂的疗效和安全性zanamivirin甲型和乙型流感病毒感染的治疗,”《传染病杂志》上,卷180,不。2、254 - 261年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j . McKimm-Breschkin t . Trivedi a芬et al .,“流感病毒神经氨酸酶的序列分析和脆弱的感情临床分离株对扎那米韦和奥司他韦,”抗菌药物和化疗卷,47号7,2264 - 2272年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. t . g .许凤v . m . Deyde m . Okomo-Adhiambo et al .,“监视人类对神经氨酸酶抑制剂抗甲型和乙型流感病毒传播全世界从2004年到2008年,“抗菌药物和化疗,52卷,不。9日,第3292 - 3284页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. h·l·w . Liu, b .朱et al .,“activity-integrated战略的识别、筛选和确定潜在的神经氨酸酶抑制剂从黄芩,”《公共科学图书馆•综合》,12卷,不。5篇文章ID e0175751 2017。视图:谷歌学术搜索
6. x l . j ., a . Yu w·刘,j·李,x和y,“识别和筛选的自然神经氨酸酶抑制剂通过一步法从reduning注入高效液相chromatography-fraction收集器和UHPLC / Q-TOF-MS”国际分析化学杂志》上卷,2020篇文章ID 8838025, 11页,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 美国Grienke分析员m . Schmidtke, s·冯·Grafenstein j . Kirchmair k . r . Liedl和j . m .滚动”流感病毒神经氨酸酶:制药天然产品的目标,“天然产品报告卷,29号1,11-36,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j . Liu m .祖茂堂k . Chen等人”的神经氨酸酶抑制活性筛选一些药用植物在岭南传统中药,“BMC补充和替代医学,18卷,不。1,p。102年,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m . h .公园,荣格,h . j .趣事et al .,“快速识别isoprenylated黄酮类成分对细菌抑制活性神经氨酸酶从根叫纸桑(构树)”国际期刊的生物大分子卷,174年,第68 - 61页,2021年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. h .赵和z . Chen”筛选中药的神经氨酸酶抑制剂通过集成毛细管电泳与固定化酶微反应器,”杂志的色谱卷,1340年,第145 - 139页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. y Shahbazi、h . Malekinejad和h .塔吉克”决心的天然雌激素荷尔蒙河牛和水牛的肉HPLC-FLD方法,”食品和药物分析杂志》上,24卷,不。3、457 - 463年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. J.-L。吴,S.-Y。Yu工程学系。吴,a m。包”,一个敏感的和实际测定RP-HPLC-FLD刺激神经组织的氨基酸含量低的体液及其应用在抑郁症,”神经学字母卷。616年,32-37,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. o . Golge、f . Hepsag和b·卡巴科”测定黄曲霉毒素的核桃sujuk和土耳其软糖HPLC-FLD方法,”食品控制59卷,第736 - 731页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 食品及药物管理局,指导行业:生物分析方法验证、美国卫生和人类服务部,食品药品监督管理局药品评价和研究中心(CDER),马里兰州,医学博士,美国,2001年。
15. y。Chang X.-P。叮,j . Qi et al。”,确定丹参酚酸的准备通过与化学发光检测LC,”色层法,卷69,不。3 - 4、319 - 323年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. A.-L。Liu》。王,s·m·李,Y.-T。王,G.-H。杜”,黄酮类化合物构效关系的流感病毒神经氨酸酶抑制剂及其体外抗病毒活动,“生物有机和药物化学,16卷,不。15日,第7147 - 7141页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. h . Ge Y.-F。许,j . et al .,“从传统中药抗流感药物。”天然产品报告,27卷,不。12日,第1780 - 1758页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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