文摘

著名bisepoxylignan Phillyrin,已被证明有许多重要的药理作用。在这项研究中,一种新的战略广泛采集和使用数据建立了基于UHPLC-Q-Exactive质谱分析和识别在活的有机体内phillyrin并阐明的代谢物在活的有机体内phillyrin的代谢途径。其中,数据集的生成主要是由于多通道数据挖掘方法,如高提取离子色谱(HEIC)诊断产品离子(DPI)、过滤(NLF)和中性的损失。60代谢物(包括原型化合物)被确定在积极和消极离子模式基于直觉的和有用的数据,如标准的乳沟规则,准确的分子质量、色谱保留时间。结果表明,phillyrin一系列的生理反应在活的有机体内主要包括甲基化、羟基化、加氢、磺化glucuronidation,脱甲基,脱氢和他们的综合反应。总之,本研究不仅全面解释了在活的有机体内phillyrin代谢,还提出了一个有效的策略来快速分析和识别天然药物成分的代谢产物。

1。介绍

一个重要bisepoxylignan Phillyrin,是主要的组成部分连翘suspensa(研究)。Vahl木犀科植物属于家庭(1- - - - - -3]。现代药理研究表明,phillyrin不仅有效的生物活性,但也发挥了巨大的作用,不可忽视在抵抗疾病和维护人类健康,如抑制炎症反应、抗病毒、抗氧化压力,anticell凋亡[4- - - - - -8]。Phillyrin报道提高体内胰岛素抵抗[9,10],它还可以减少肥胖老鼠的重量通过特定途径(11]。此外,phillyrin可以减少破骨细胞的形成和功能,防止LPS-induced骨质溶解在老鼠12]。然而,仍有许多不足在综合研究phillyrin新陈代谢在活的有机体内。因此,揭示phillyrin的代谢产物和代谢途径为其进一步开发和利用具有重要意义。

我们都知道,液相色谱-光谱法(质)结合了液相色谱的高分离能力和质谱的有力的定性和定量能力,高灵敏度的优点,高选择性,和丰富的结构信息13- - - - - -15]。UHPLC-Q-Exactive女士(超高效液相色谱法加上混合quadrupole-Orbitrap质谱)可以彻底和广泛获得化合物的结构信息通过正面和负面的功能离子扫描模式,全面扫描,自动触发的二级质谱扫描。上级决议基于Orbitrap技术可以快速实现高精度的测量质量。因此,它可以识别和确认小分子化合物的混合物,是一种强大的工具来分析复杂的复合系统,并已广泛应用于化合物鉴定和筛选16- - - - - -18]。获取足够的片段信息并分析成分信息的复合网络,可以确定化合物的分子量,和可能的分子结构可以推断基于主、次要,甚至多级质谱信息(19- - - - - -21]。结果,必须形成一个全面和权威的数据集的数据处理过程。数据挖掘方法报道近年来不断出现,主要包括以下类别:质量缺陷滤波器,提取离子色谱,离子(DPI)诊断产品,中性丢失过滤(NLF)和同位素模式过滤(22- - - - - -27]。

在本文中,我们建立了一个新的策略,结合UHPLC-Q-Exactive女士与多个数据挖掘分析方法。由于其轻微的检出限和狭窄的偏差范围内,它是可行的分析和识别代谢物phillyrin老鼠口服药。根据这项研究,我们进一步提出了在活的有机体内phillyrin代谢途径,弥补了当前研究不足的缺点phillyrin新陈代谢,有利于揭示了在活的有机体内许多phillyrin药理作用机制。

2。材料和方法

基于前面的研究小组的研究结果,我们采用了前人的实验方法和样本处理程序(28,29日]。

2.1。化学药品和试剂

phillyrin的参考标准从成都必须购买生物技术有限公司(四川,中国)。HPLC-UV分析之后,phillyrin的纯度不低于98%。乙腈、甲醇和甲酸(高效液相色谱级)使用的流动相是由费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。C18-low固相萃取(SPE)墨盒(3 L / 60 g)生物样品预处理得到水域(米尔福德,妈,美国)。超纯水是刚做好的使用Milli-Q梯度10净水系统(美国微孔,Billerica的)。此外,其他试剂和溶剂分析实验的要求在北京化工厂(中国,北京)。

2.2。动物药品监督管理局

十六岁雄性SD大鼠体重200 - 220克从北京购买Weitong利华国际实验动物公司(中国,北京)。所有的动物都在特定的环境条件下(温度22±1°C,湿度60±10%,12小时的昼夜变化),免费获得食物和水一个星期。老鼠被随机分为药物组(实验尿液、血浆和粪便,n= 8)和对照组(空白尿液、血浆和粪便,n= 8)。phillyrin的参考标准是悬浮在0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)解决方案。药物组口服接种phillyrin(300毫克/公斤),而对照组给予等量的0.5% CMC-Na口服填喂法来求解。所有的动物实验前禁食12小时,但可以免费获得水。实验协议已经批准的机构动物保健和使用委员会在北京中医药大学。所有程序都按照指南进行的实验动物保健和使用美国国家卫生研究院。

2.3。样品收集

2.3.1。血浆样本集合

口服后,所有老鼠置于代谢笼。(约0.5毫升)的血液标本从眼眶下的静脉丛的老鼠的时间点0.5,1,1.5,2和4 h后管理,为每个老鼠和操作是相同的。空白和实验获得的样本组和药物组,分别。所有血液样本被放置在一个肝素钠实际上EP管15分钟,然后在3000 rpm离心机(4°C) 15分钟血浆分离。之后,同一组的等离子体组合成一个聚合和存储在−80°C到使用。

2.3.2。尿样收集

收集尿液样本(0-24 h)从每个老鼠用代谢笼,每个样本离心机在3000 rpm (4°C) 15分钟获得上层清液。每组大鼠的尿液上层清液混合并储存在−80°C到使用。

2.3.3。粪便样本集合

粪便样本(0-24 h)获得从每个老鼠用代谢笼,然后晒干,磨成粉末。每组大鼠的粪便粉末涨跌互现。首先,0.5克粪便粉末溶解在70%甲醇,然后它被超声波提取30分钟。最后,老鼠的粪便样本组和药物组。

2.4。生物样品制备

所有生物样本由沉淀和浓缩蛋白和固体残留物。首先,SPE墨盒被激活与甲醇进行预处理(5毫升)和去离子水(5毫升)。之后,血浆、尿液和粪便样本(1毫升)被添加到SPE墨盒,分别。然后,子弹是SPE筛选了与去离子水(5毫升)和甲醇(3毫升)的顺序,和甲醇洗出液收集。最后,洗出液与氮在室温、干燥和残渣再溶解在5%乙腈溶液(100μl)和离心机在14000 rpm (4°C),持续15分钟。上述方法得到的上层清液用于仪器分析。

2.5。仪器和条件

所有生物样品进行了分析使用UHPLC-Q-Exactive质谱仪(热费希尔科学、马、美国)配备一个应急服务国际公司离子源。色谱分离进行一个水域ACQUITY本·C18柱(2.1毫米×1.7×100毫米μm;水公司,米尔福德,妈,美国),温度设定在25°C。流动相是由0.1%的甲酸溶液(A)和乙腈(B)和线性梯度设置如下:0 - 1分钟,5% B;1 - 3分钟,5% - -25% B;3 - 8分钟,25% - -60% B;分钟8 - 15日,60% - -80% B;15 - 20分钟,80% - -100% B;20 - 24分钟,100% B;24 - 25分钟,100% - -5% B;和25 - 30分钟,5% b .流量为0.3毫升/分钟和注射量是2μl

正面和负面的离子模式下的最优操作参数设置如下:电电压,4 kV;毛细管温度、350°C;鞘气体流速,275 kPa;辅助气体流速,138 kPa;辅助气体温度、300°C;和碰撞能量,40 eV。代谢物被检测到米/z100 - 1500年使用全扫描质谱分辨率为70000。此外,收购模式,依靠父离子列表——(公益诉讼)被用来获得女士ⁿ阶段获得的数据集。

2.6。数据处理

2.1热Xcalibur工作站(热科学、不来梅、德国)是用来获取和HR-ESI-MS过程¹和女士ⁿ数据。基于代谢产物的筛选建立模板,通过搜索代谢物与特定的分子量比较高分辨率提取离子色谱图组和药物组,相关代谢物phillyrin被选中。获得尽可能多的phillyrin代谢物离子,峰值检测负离子模式的强度超过10000和50000为正离子模式选择进行进一步的结构特征。基于准确的代谢物的质量和元素组成,集预测的公式可以准确地计算所有父离子的化学公式。原子的类型和数量设置如下:C [0-40], H [0-60], [0-25], [0], N(0 - 5),环双键(RDB)等值[0-15]。同时,MetWorks(1.3版)和大规模边境(8.0版)软件(美国马热科学、沃尔瑟姆)被用作辅助工具大规模分裂行为分析和结构鉴定。

3所示。结果与讨论

3.1。分析的建设策略

本研究建立一个有效的新策略基于UHPLC-Q-Exactive女士为数据采集结合多路数据挖掘分析phillyrin的新陈代谢在活的有机体内。首先,质ⁿ数据集样本的积极的和消极的离子模式都是通过使用视扫描(DDS)采集方法。其次,phillyrin的共同代谢产物测定根据文献报道和HREIC搜索,从而建立了筛选模板phillyrin代谢物。然后,通过分析质量参考标准的分裂行为,合理的phillyrin dpi和独立进行了综述。之后,根据色谱保留时间,建立了dpi和独立,和相应的计算ClogP价值观,一系列phillyrin代谢物的结构可以被识别。最后,代谢途径的phillyrin可以推断从上面的代谢数据。整个研究过程的这种策略如图1。

3.2。建立代谢物的检测模板

根据文献报道和HREICs搜索,三个化合物(phillyrin、phillygenin enterolactone)被选为初级代谢产物,经常发现在phillyrin的代谢物。数据排序后,在负离子模式下,代谢产物筛选模板设置如下:(1)phillyrin模板(米/z533.2017);(2)phillygenin模板(米/z371.1489)和它的导数模板(米/z329.1020 detrimethyl,米/z357.1333脱甲基,米/z373.1646对加氢,米/z387.1438氧化);(3)enterolactone模板(米/z297.1121)。在此基础上有效方法,一些nondiscoverable代谢物也可以从复杂的背景噪音的筛选。

3.3。分析大规模Phillyrin的分裂行为

电喷雾质谱,进一步探索ⁿphillyrin断裂行为,综合分析标准的解决方案是使用UHPLC-Q-Exactive执行例如,女士phillyrin在负离子模式下能找到[M + HCOOH-H]⁻离子在米/z电喷雾质谱的579.2072¹光谱。由于缺乏葡萄糖的片段,它的特征离子峰被发现米/z371年的质²光谱。在此基础上,几个系列的产品特征离子被检索米/z357年,米/z341年,米/z327年,米/z311因为一系列的片段如CH₂2 ch₂,CH₂+ CH₂啊,和2 ch₂O先后失去了。化合物具有相同父核将有类似的乳沟电喷雾质谱碎片的ⁿ谱,所以全面识别代谢物可以实现基于常规dpi和独立。例如,DPI米/z371年被诊断出由于缺乏葡萄糖一半。因此dpi的存在米/z371或米/z371 + X谱²光谱的复合代谢物鉴定提供类似的信息。同时,连续14 Da (CH₂)和30 Da (CH₂O)独立组分ⁿ光谱phillyrin还提供了大量帮助的代谢物的识别。phillyrin乳沟通路的负离子模式呈现在图2。此外,大规模的分裂行为phillyrin在正离子模式下如图所示3。

3.4。识别Phillyrin老鼠体内代谢物

总离子色谱图(抽搐)尿液、血浆,粪便样本phillyrin口服后在大鼠使用UHPLC-Q-Exactive质谱分析获得。60代谢物中发现了积极的和消极的离子模式通过处理收集到的数据从UHPLC-Q-Exactive乐器。其中,有31个代谢物在正离子模式下和33代谢物在负离子模式下。此外,文献检索和比较后,发现了21个代谢物和检测到的前辈30.,31日),其余39代谢物被筛选,确定通过既定的战略。所有相关质量光谱数据总结表1和高分辨率提取离子色谱图(HREICs)所有代谢物的phillyrin图所示4。

3.4.1。基于Phillyrin代谢物鉴定

代谢物M0生产[M + HCOOH-H]^{- - - - - -}离子在米/z579.2072 (C₂₈H₃₅O₁₃,2.32 ppm)筛选了6.60分钟。与洗脱时间和phillyrin分裂行为的标准,M0可以准确推断phillyrin [32,33]。

代谢物M17星云和锰的保留时间为5.76和5.96分钟,分别,他们显示相同的分子离子米/z519.1498 (C₂₅H₂₇O₁₂,误差≤±2.50 ppm)。电喷雾质谱在²谱,DPI米/z343年产生的损失2 ch₂phillygenin。而米/z519是176 Da大于前者,这是推测米/z343是由缺乏葡萄糖醛酸的一部分。因此,推测M17星云(堵塞P−0.41)和锰(堵塞P−0.39)是脱甲基和羧酸盐phillyrin代谢物,但葡萄糖醛酸的位置是不同的。

代谢物两个同伴M32筛选了6.58分钟,显示(mh)⁻离子在米/z533.1652 (C₂₆H_29日O₁₂,2.15 ppm)。同样,对于M17星云,的存在米/z175意味着葡萄糖醛酸的形成。当两个同伴M32 14 Da高于M17星云,它是推测,CH的phillygenin只有一个分子₂移除。

的代谢物M36保留时间为6.76分钟显示(mh)⁻离子在米/z547.1809 (C₂₇H_31日O₁₂,2.17 ppm)。类似于上面的规则,得出M36 phillyrin羧化作用的产品。

代谢物M56展出(mh)⁻离子在米/z507.2225 (C₂₆H₃₅O₁₀,2.28 ppm)。它有一个中立的44 Da, 132 Da,电喷雾质谱和44哒²光谱,造成的外观米/z463年,米/z331年,米/z287年。其中,44 Da NLF可以假定CH₂O + CH₂,而132年的国家达是由CH的损失₂O从glucosyl组。因此,得出的结论是,M56脱羟基和加氢phillyrin的产物。

3.4.2。基于Phillygenin代谢物鉴定

代谢物M44的保留时间为7.05分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z305.1772 (C₁₉H₂₁N₄,5.95 ppm)。根据DPI米/z109年和米/z93年,它可以推断出,两个苯环的phillygenin引入2 nh₂和CH₃,分别。有趣的是,米/z205年28 Da高于米/z177年,米/z177年也是28 Da高于米/z149,所以独立被认为是CH = NH分子式和未饱和的程度。因此,M44被认为是使氨化phillygenin的产物。

代谢物M2筛选了2.49分钟显示[M−H]⁻离子在米/z315.0865 (C₁₇H₁₅O₆−8.27 ppm)。电喷雾质谱在²谱,DPI米/z193年证明的一个苯基环引入phillygenin 4哦,和母亲原子核失去2 ch₂o .根据DPI米/z124年、137年和150年,两个双键的生成也可以证明。

代谢物M18筛选了5.92分钟,显示[M−H]⁻离子在米/z329.1021 (C₁₈H₁₇O₆,3.33 ppm)。DPI的存在米/z137年和163年的质²光谱证实dimethoxyphenyl的存在,而DPI米/z介绍了109猜测哦苯环。然而,另外两个羟基的替换网站无法确定。

代谢物M39的保留时间为6.79分钟,显示离子[M−H]米/z343.1177 (C₁₉H₁₉O₆,3.57 ppm)。M18的推断过程相似,两个苯环上取代基决定后,可以得出结论,M39的产品损失2 ch₂phillygenin。

代谢物M38, M54筛选了6.79分钟,8.44分,分别显示相同的[M + H]⁺离子在米/z355.1541 (C₂₁H₂₃O₅,误差≤±1.50 ppm)。DPI的米/z137、151表示bismethoxyphenyl集团的存在米/z189年是112 Da高于米/z77(苯),推断的形成一个双键的两个五元环。此外,米/z284年30 Da高于米/z254年,推断,两人都是dehydroxyl phillygenin种产品,除了双键的位置是不同的。

代谢物M43筛选了6.93分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z371.1489 (C₂₁H₂₃O₆−1.12 ppm)。这是2 Da低于[M + H]⁺phillygenin离子,加上dpi谱²光谱,M43可以确定为脱氢phillygenin的产物。

代谢物M57在HREIC提取米/z373.1281 (C_20.H₂₁O₇在正离子模式下,−0.99 ppm)保留时间为9.65分钟。DPI的米/z373年30 Da高于米/z343年,这意味着CH的损失₂啊,而米/z343年18岁的达比米/z325年,表明水分子已经被移除。之后,由于公司的损失NLF, DPI的生成米/z297年是引起。根据这一点,我们可以推断,phillygenin的脱氢、脱甲基反应后,M57被氧化形成的。不过,羟基的位置不能确定。

在6.92分钟,代谢物M42筛选了,和[M−H]⁻离子在米/z451.1057 (C₂₁H₂₃O₉年代,3.42 ppm)。DPI的米/z371年质²谱可以推断phillygenin,米/z451年是80 Da高于米/z371年,这是一个伟大的帮助让我们得出这样的结论:M42 phillygenin的磺化产物[30.]。

M33的保留时间为6.59分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z492.1687 (C₂₄H_30.O₈NS,−1.35 ppm)。DPI的米/z492年是137 Da高于米/z355年,推测NLF可能cysteine-oxygen原子(C₃H₇没有₂S + O)。DPI的米/z88 (C₃H₆没有₂)是更有力的证明这这M33可能产品绑定的phillygenin半胱氨酸。

产生的代谢物M58筛选了9.90分钟(M−H)⁻离子在米/z261.1146 (C₁₅H₁₇O₄,4.15 ppm)。电喷雾质谱的²一方面,独立米/z262年到米/z235可能是CH = CH₂。同样,DPI米/z191的损失是由于CH = CH米/z217年。此外,的原因米/z235年18 Da高于米/z217是一个分子的水了。假定,glucosyl一部分发生了还原反应,留下两个剩余羟基环。

代谢物的M40保留时间为6.87分钟显示[M + H]⁺离子在米/z317.0657 (C₁₆H₁₃O₇−1.04 ppm)。DPI的米/z133年56 Da(2 .)高于米/z77(苯)米/z121年44 Da (CO + O)高于米/z77年。认为,最初的五元环部分C = O形成。根据DPI米/z109年,推测2哦存在于苯环的一部分。

代谢物M47筛选了7.47分钟,曾[M−H]⁻离子在米/z357.1332 (C_20.H₂₁O₆,3.94 ppm)。电喷雾质谱在ⁿ光谱,产生的dpi M47的乳沟,等米/z191、177、151、137和123年,表明这两个苯环进行取代反应与不同团体(2哟₃,哦+哟₃),分别。与此同时,国家30 Da (CH₂啊,从米/z357年到米/z327)和54 Da (C₄H₆,从米/z177年到米/z123),它可以推断出这两个苯环上是相互连接通过一个五元环和一个双键。除此之外,这是已知的分子式,很难确定替换网站之一哦。

的代谢物M48筛选了7.54分钟,[M + H]⁺离子生成米/z331.0181 (C₁₇H₁₅O₇−0.54 ppm)。DPI的米/z162年是69 Da (C₄H₅O)高于米/z93(酚C₆H₅O),从而证实了五元环经历了脱氢形成双键。根据分子式,除了2的存在哦,在这两个苯环,替换网站2哦,不能被识别。

代谢物M8和M11公路保留时间为4.91分钟,5.08分,分别产生相同的[M−H]⁻离子在米/z331.1177 (C₁₈H₁₉O₆,误差≤±5.00 ppm)。电喷雾质谱在ⁿ光谱,nlf 30 Da(从米/z333年到米/z303)和28 Da(从米/z303年到米/z275);这表明,只有一个五元环的分子结构。此外,离子等产品米/z109年和米/z123表示取代基组(2哦,哦+哟₃两个苯环)。

代谢物M10筛选了4.96分钟,显示[M−H]⁻离子在米/z333.1327 (C₁₈H₂₁O₆,4.52 ppm)。dpi连续产生的中性CH的损失₂O (30 Da)等米/z303年和米/z273表示,这两个五元环引入H₂。

代谢物M3, M4、M5筛选了3.97分钟,4.27分,4.58分,分别显示相同的[M−H]⁻离子在米/z347.1126 (C₁₈H₁₉O₇,误差≤±4.50 ppm)。电喷雾质谱在²光谱,独立30 Da(从米/z347年到米/z317),表明存在的五元环结构的公式。出现在的dpi米/z163年和193年我们的推理进一步提供了依据。根据dpi等米/z109年、123年和137年,两个苯环上的取代可以推断。自替换网站两个羟基很难判断,M3, M4、M5是同分异构体。

代谢物M14和M16的保留时间5.54分钟,5.69分,分别,这两个产生[M−H]⁻离子在米/z409.0588 (C₁₈H₁₇O₉年代,误差≤±3.50 ppm)。42 Da低于M42,大概由于损失3 ch₂。dpi在米/z329年和米/z80年为这个推理提供了强有力的证据。因此M14和M16 M42脱甲基产品,除了磺酸团体有不同的绑定的位置。

代谢物M27和M30筛选了6.31分钟,6.54分,显示[M + H]⁺离子在米/z357.1332 (C_20.H₂₁O₆−1.19 ppm)米/z357.1332 (C_20.H₂₁O₆,分别−2.90 ppm)。电喷雾质谱在²谱,独立是112 Da (C₆H₈O₂,从米/z189年到米/z介绍了77年),所以一个双键的五元环。然而,DPI生成米/z137年质ⁿM30的频谱,是推断bismethoxyphenyl组,和M27没有这个群体,所以M27(堵塞P,1.14)和M30(堵塞P,1.17)同分异构体。

的代谢物M34保留时间为6.65分钟显示[M−H]⁻离子在米/z359.1490 (C_20.H₂₃O₆,3.16 ppm)。DPI的米/z344年质²谱生成米/z284年由2 ch的损失₂啊,然后等dpi米/z192年和米/z178年可能假设加氢(+ 2 h₂)发生在五元环和有一个分子双键。此外,基于DPI米/z122年,两个苯环上的官能团可以推导出。

代谢物M13的保留时间和M19 5.30分钟,5.93分,分别,同样的[M−H]⁻离子是米/z375.1074 (C₁₉H₁₉O₈,误差≤±4.00 ppm)。电喷雾质谱在²光谱,nlf 28 Da(有限公司米/z375年到米/z347)和60 Da (2 ch₂啊,从米/z347年到米/z分别为287)。从这个,假设有一个五元环双键和结构式dimethoxyphenyl集团。结合dpi等米/z137、109、和未饱和的程度,可以推断结构式。然而,三个羟基的位置仍无法辨认的,M13和M19位置异构体。

代谢物M6拥有[M + H]⁺离子在米/z393.1543 (C_20.H₂₅O₈−8.33 ppm)保留时间为4.75分钟。电喷雾质谱在²M6的频谱,DPI米/z393年是93 Da高于米/z300年,大概是由于中性酚的损失。与此同时,DPI米/z300年是60 Da高于米/z240年,28 Da高于米/z272年,这是想当然地认为nlf 2 ch₂O (60 Da)和2 ch₂分别(Da) 28日。根据获得的信息,我们可以得出这样的结论:M6的结构公式包含酚和dimethoxyphenyl组,和两个五元环的氢化打开戒指。dpi的米/z216年、246年和361年进一步证实了上述判断,和其他三个羟基的替换网站无法确定。

M24、M28 M41显示相同的[M−H]⁻离子在米/z437.0901 (C_20.H₂₁O₉年代,误差≤±3.00 ppm),和他们筛选了6.14分钟,6.32分,分别和6.88分钟。他们的分子量是14 Da低于M42,所以他们推断M42的脱甲基作用的产品。电喷雾质谱在²光谱,三个代谢物有同样的dpi,等米/z357,151,137,80,这证明他们的苯环上取代基相同(2哟₃2哦)。由于取代基对苯环和磺酸基(hso汽车贸易公司₃)替换网站是不同的、M24 M28, M41位置异构体(34]。

保留时间的代谢物M25公路显示[M−H]⁻离子在米/z453.0850 (C_20.H₂₁O₁₀年代,2.62 ppm)是6.16分钟。因为它的分子量16岁Da高于M41,它可以推测M25公路M41氧化产品。电喷雾质谱检索的dpi M25公路的ⁿ光谱,如米/z373、97和80年,出人意料地支持上面的猜测。

代谢物M59筛选了26.48分钟,显示[M−H]⁻离子在米/z339.2035 (C₁₅H_31日O₈−3.67 ppm)。基于分子式计算未饱和的程度,M59被假定为一个包含15个碳原子的烷烃的化合物被八羟基取代。此外,dpi和独立组分所示ⁿ谱可以证明这一结论。

代谢物M52发现在8.34分钟,产生[M + H]⁺离子在米/z373.1646 (C₂₁H₂₅O₆−3.47 ppm)。电喷雾质谱在ⁿM52光谱,通过各种信息,它可能是毫无疑问的母体化合物phillygenin [31日,35,36]。

产生的代谢物M23 [M−H]⁻离子在米/z417.1179 (C₂₁H₂₁O₉,3.67 ppm),其保留时间为5.98分钟。电喷雾质谱在²光谱,独立是176 Da(从米/z417年到米/z241),和不饱和葡糖苷酸组被认为丢失,和DPI米/z175年证实了这一点。dpi的米/z121年和米/z103年表明,由两个甲基苯环被替换下场,所以一个甲基的替换位置不能确定。

代谢物M7筛选了4.84分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z377.1953 (C₁₆H₂₅O₁₀,1.56 ppm)。电喷雾质谱在²光谱,独立是134 Da(从米/z377年到米/z243),它被认为是一个衍生的葡萄糖(C₅H₁₀O₄)。根据dpi米/z172年和米/z72年,替换四羟基的位置可以推断,其中3例羟基与苯环的反应,和其他烷烃羟基被取代。

3.4.3。基于Enterolactone代谢物鉴定

代谢物M50筛选了7.63分钟,和[M + H]⁺离子是显示在米/z231.1140 (C₁₆H₂₃O,−0.35 ppm)。电喷雾质谱的dpi²M50的光谱,如米/z135、107和93年,它可以推断出,羟基取代的苯环。然后它可以推测,另一个苯环经历了一个额外的反应,这本身已经介绍了四个氢原子。

产生的代谢物M45 [M + H]⁺离子在米/z273.0759 (C₁₅H₁₃O₅−0.70 ppm)保留时间为7.36分钟。电喷雾质谱在²谱,dpi米/z123年和米/z95表示两个苯环上的取代(哦+哟₃,哦)。同时,独立是28 Da(从米/z151年到米/z123年,从米/z255年到米/z227),推测有两个苯环之间的两个酮组。

代谢物M51筛选了7.83分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z281.1173 (C₁₈H₁₇O₃−2.07 ppm)。电喷雾质谱在ⁿ谱,dpi米/z263,235,133,和107年完全展示了两个5环双键形成结构。除此之外,独立是16 Da(从米/z149年到米/z133),表明仍有羟基的替换网站是未知的。

的代谢物M37保留时间为6.77分钟显示[M + H]⁺离子在米/z285.0759 (C₁₆H₁₃O₅−1.30 ppm)。基于dpi位于质²光谱,如米/z161年和米/z85年,它可以推断出,连续三酮组。同时,O原子的连续亏损(Da) 16日表示,有两个羟基苯环。

的代谢物M20,筛选了5.93分钟,有[M + H]⁺离子在米/z295.0964 (C₁₈H₁₅O₄−1.51 ppm)。根据连续中立有限公司(Da) 28日(从损失米/z277年到米/z249年,从米/z249年到米/z221)和DPI米/z186,它可以推测有两个双键的两个五元环结构。此外,连续亏损的水分子(Da) 18日进一步证明dihydroxyphenyl的存在。

代谢物M1的保留时间为1.61分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z298.0962 (C₁₉H₁₂在₃−2.81 ppm)。电喷雾质谱在²频谱的M1, nlf 26 Da(从米/z189年到米/z163年到米/z137),这可能是由于连续CN的损失。更重要的是,替换地方羟基还应该存在于结构式无法确定。因此,有三个含氰基的团体和一个羟基的结构公式。

代谢物M21筛选了5.94分钟,显示[M + H]⁺离子在米/z313.1070 (C₁₈H₁₇O₅−1.73 ppm)。根据电喷雾质谱的dpi²光谱,如米/z277、249、123、161和173年,可能是假定两个苯环上的取代(哦+哟₃可以假定,哦)和一个五元环和两个双键的存在。同时,根据分子式,知道还有一个羟基取代网站无法被识别。

代谢物M53的保留时间为8.39分钟,而[M + H]⁺离子在米/z315.1227 (C₁₈H₁₉O₅−9.27 ppm)。电喷雾质谱在²M53频谱,dpi米/z93,109,167,189年可能完全澄清取代基(2哦,哦)两个苯环。同时,独立是60 Da(从米/z315年到米/z255年),被认为是由于连续CH的损失₂啊,所以有两个五元环结构的公式。

代谢物M9筛选了4.95分钟,这显示[M + H]⁺离子在米/z317.1384 (C₁₈H₂₁O₅,0.16 ppm)。类似于上面的,基于dpi谱₂光谱,如米/z123、149、151、163和175年,取代基(哦+哟₃)两个苯环被假定。推断未饱和的程度,两者之间的线性链烷苯环进行了脱氢反应形成双键。同时,它可能是已知的分子式,另一个哦替换网站无法确定。

M26,代谢物M15 M29 M31,和M46筛选了为5.62,6.21,6.38,6.55,和7.44分钟,分别,他们都显示相同的[M + H]⁺离子在米/z341.1384 (C_20.H₂₁O₅,误差≤±1.50 ppm)。其中,电喷雾质谱的²光谱的M15 M26, M29 dpi米/z137年和米/z187表示dimethoxyphenyl的存在和methoxyphenyl。同时,国家是28 Da(从米/z291年到米/z263)和70 Da(从米/z341年到米/z271),证明有一个五元环和两个双键之间的两个苯环结构。此外,很难确定一个羟基的位置。因此,推断,三个代谢产物异构体由于羟基和甲氧基的取代位置不同。然而,电喷雾质谱的ⁿ光谱M31, M46、取代基(哦+哟₃哟,₃)两个苯环可以假定基于dpi米/z123、151和161。与此同时,国家30 Da (CH₂啊,从米/z341年到米/z311)和28 Da(有限公司米/z311年到米/z283)和两个五元环的存在和一个双键的形成进一步的推导。因为甲氧基组的位置难以确定,M31, M46位置异构体。

代谢物M12的保留时间为5.15分钟,这[M−H]⁻离子在米/z345.0969 (C₁₈H₁₇O₇,4.20 ppm)。dpi的质²光谱,如米/z109年和137年,显示两个苯环的结构(2哦,哦)。中性的损失60 Da (2 ch₂O)导致DPI的形成米/z285年,表明两个五元环保持不变。同时,仍然没有被替换网站对于一个羟基,因此M12脱甲基作用和氧化phillygenin的产物。

产生的代谢物国防军M35筛选了6.69分钟,投入正式[M−H]⁻离子在米/z377.0689 (C₁₈H₁₇O₇年代,3.69 ppm)。电喷雾质谱在²谱,独立是81 Da (HSO汽车贸易公司₃),这可能是由于中性磺酸基集团的损失。与此同时,dpi米/z107年和米/z189年透露两个苯环上取代基的存在(2哟₃2哦)和两个双键的存在之间的苯环。

的代谢物M49筛选了7.61分钟,显示[M−H]⁻离子在米/z271.1329 (C₁₄H₂₃O₅,4.68 ppm)。电喷雾质谱在ⁿ谱,独立60 Da(从米/z271年到米/z211),推断出这两个五元环进行加氢(+ H4)打开戒指。dpi的米/z151年和米/z165年证明了苯环加成反应(H₂),取而代之的是2哟₃。另一个哦替换网站是具有挑战性的识别。

保留时间为8.49分钟的代谢物M55显示[M + H]⁺离子在米/z273.1486 (C₁₇H₂₁O₃,0.80 ppm)。电喷雾质谱的dpi²光谱,如米/z179年、137年和95年,澄清两个苯环的结构(哦+哟₃,哦)。根据既定的分子式,它可以推断出,两个苯环之间的织物是一个线性包含四个碳原子的烷烃。

3.5。提出Phillyrin的代谢途径

在我们的研究中,总共60代谢物(包括原型化合物)的老鼠是检测和识别口头phillyrin管理。拟议中的代谢途径forsythiaside如图5。phillyrin在老鼠的主要生物反应包括以下类型,如加氢、甲基化、羟基化、glucuronidation,磺化,羰基化、氨化、脱氢、脱甲基,环裂及其复合反应。同时,发现了一些非凡的产品,如键不饱和键在M1和M44形成的。此外,代谢物M49, M50 M59,由苯加氢或劈理,以前从未被报道。

4所示。结论

口服后phillyrin老鼠,老鼠的代谢物在血浆、尿液和粪便全面进行了研究。其创新躺在使用一个新的全面的战略来筛选和识别60在活的有机体内phillyrin代谢物。首先,UHPLC和Q-Exactive女士克服了许多传统三重四极质谱的缺点,和极高的分辨率可以明显消除样本矩阵的干扰。其次,数据集的形成主要依赖于各种数据挖掘方法,如高提取离子色谱(HEIC)诊断产品离子(DPI)、中性丢失过滤(NLF)和同位素模式过滤(IPF)。最后,准确的定性鉴定的化合物可以实现基于每个色谱峰的精确相对分子质量在质谱的离子碎片信息二级质谱,质谱的分裂规则,色谱保留时间。结果表明,phillyrin的主要生物反应在活的有机体内包括甲基化、加氢、磺化、glucuronidation脱甲基,脱氢、环劈理,复合反应。其中,一些特定代谢产物的生物活性是未知的。总的来说,这项研究提供了重要信息phillyrin代谢的研究领域和研究具有重要的价值意义phillyrin和监测药物的作用机制的内容。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国药典委员会(没有经济支持。2018 y007)。