人血清中天冬酰胺的亲水性液相色谱串联质谱测定方法的建立与验证

摘要

l -天冬酰胺(ASN)是l -天冬酰胺酶(ASNase)的催化底物，是治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的重要药物。ASN水平与ASNase治疗的有效性密切相关。在这项研究中，建立了一种亲水相互作用液相色谱串联质谱(HILIC-MS/MS)方法，使用稳定同位素标记内标(ASN- d)测定人血清中ASN_3.).使用甲醇通过一步沉淀程序制备血清样品，并通过安捷伦HILIC Plus柱分离，流动相为甲醇-水（95 : 5，v/v，包含5个 mM甲酸铵和0.1%甲酸），恒定流速为0.3 mL/min。在正电喷雾电离模式下使用多反应监测进行质谱分析。在2–200的线性校准曲线范围内测定血清ASN浓度 μM，具有可接受的准确性和精度。经验证的HILIC-MS/MS方法成功应用于ALL患者血清中ASN水平的定量。综上所述，该研究可能为快速、简单、方便测定ALL患者血清ASN酶的方法提供新的线索。

1.介绍

急性淋巴母细胞白血病（ALL）是儿童中最常见的癌症，其特征是未成熟淋巴细胞的过度产生和积累[1.,2.,3.]由于治疗方法的发展，ALL的治愈率已超过80%，其中L-天冬酰胺酶（ASNase）发挥了重要作用[4.,5.]ASNase通过催化L-天冬酰胺（ASN）的水解发挥其抗白血病活性是正常细胞能够合成的非必需氨基酸，而白血病细胞必须从细胞间液中摄取。ASN的缺失导致白血病细胞蛋白质和RNA合成受到抑制，最终诱导凋亡[4.,6.]．报告表明，人血清中正常的ASN水平为40-80 μM和ASN消耗超过90%或血清ASN水平低于3 μM被认为是治疗所有疾病的有效药物[7.,8.,9]．尽管自聚乙二醇- (PEG-)偶联ASNase临床使用以来，过敏反应等不良事件的发生率已显著降低，但ASNase的耐药继续给持续的ASNase治疗带来挑战[10.,11.,12.]．

在了解ASN酶的耐药机制方面已经取得了很大进展。除了ASN的高表达和活性外，据报道宿主因素，特别是ASN酶抗体的产生，也与ASN酶的耐药性有关。然而，据报道，宿主因素最终会导致ASN酶的耐药性ASN的高表达和高活性[10.,13.,14.]．因此，对ALL患者进行药物浓度或治疗标记物的监测，是指导ASNase制剂切换或剂量增加决策的必要手段。ASNase治疗过程中，ASNase水平、ASNase抗体滴度、ASN水平均可监测。其中，ASN水平的测量是最理想的应用方法，因为它在反映所有变量的最终结果(包括氨基酸的膳食补充)方面具有优势[15.]．

带荧光检测和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的反相高效液相色谱（RP-HPLC）是否有两种高灵敏度和高选择性的替代方法可用于生物样品（包括血浆、血清和脑脊液）中ASN浓度的定量分析[16.,17.,18.]然而，由于ASN必须用荧光进行柱前衍生，因此复杂的过程阻碍了荧光RP-HPLC在ASN水平测量中的广泛应用o-phthaldialdehyde，而LC-MS / MS的使用将遇到高矩阵效应的障碍，因为强极性ASN难以通过常用的RP-HPLC柱与内源组分分离。因此，对用Asnase治疗的所有患者的ASN测定具有迫切需要快速，简单，方便的方法。亲水性相互作用液相色谱（HILIC）是基于亲水性极性固定相与高极性化合物如氨基酸的强亲水性相互作用的替代HPLC方法。HILIC可以克服溶解度差，分析再现性差和与电离电离质谱中的缺点差的缺点常见在正常相HPLC中经常遇到的。观察到分析物可以与反相系统的流动相中的正常相液相色谱一起洗脱[19.,20.,21.]．因此，HILIC可能是一种定量分析ASN浓度的替代方法。

本研究建立了一种快速、简单、方便的测定人血清中ASN蛋白的方法，采用HILIC-MS/MS一步法进行样品蛋白沉淀和分析。进行了完整的验证，包括线性度、定量下限(LLOQ)、特异性、携带性、基质效应、回收率、准确度、精密度和稳定性的评估。该方法成功应用于ALL患者血清中ASN蛋白的测定，有效指导临床合理使用ASN酶。该方法对应用ASN酶治疗的ALL患者的血清ASN检测具有潜在的应用价值。

2.材料和方法

2．1．标准和化学物质

一水合l -天冬酰胺(化学纯度98%)和l -天冬酰胺d_3.（ASN-D_3.同位素标记的天冬酰胺内部标准，化学纯度98%，同位素纯度98.3%)购自多伦多研究化学公司(多伦多，加拿大)。甲酸铵(MS级)和活性炭由Sigma-Aldrich Co.， LLC (St. Louis, MO, USA)提供。甲酸(HPLC级)由Dikma Technologies Inc. (Lake Forest, CA, USA)提供。Pegaspargase注射液(5 mL: 3750 IU)购于中国江苏恒瑞医药。甲醇(HPLC级)从Merck KGaA公司(德国达姆施塔特)获得。使用Millipore公司的水净化系统(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)制备纯化水(电阻率18 MΩ)。人血清取自广州医科大学附属脑科医院自愿健康志愿者。

2.2。仪器和条件

色谱分析采用岛津20A高效液相色谱系统，由两个LC-20AD泵和一个DGU-20A组成_3R.脱气装置，SIL-20A自动进样器和CTO-20A柱式烘箱(岛津公司，京都，日本)。采用HILIC Plus分析柱(4.6 × 100 mm，粒径3.5)，分离温度40℃μm、 安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州圣克拉拉，美国），甲醇-水（95 : 5，v/v，包含5个 mM甲酸铵和0.1%甲酸），流速为0.3 mL/min。总运行时间为6小时 min，注射量为5 μl

MS检测采用岛津公司(Shimadzu)配备电喷雾电离源(ESI)的LCMS-8040四倍质谱仪(Shimadzu公司)进行⁺)使用多反应监测模式进行定量。接口电压和转换倍增电压为4.5 千伏和六伏 DL温度和热块温度分别为250°C和400°C。氮气用作雾化和干燥气体，流速为3和15 分别为L/min，而氩气在230的压力下用作碰撞气体 离子跃迁为m / z133.00⟶73.95和m / zASN和ASN- d对应136.00⟶74.95_3.，分别（图1.)．

岛津LabSolutions工作站（岛津公司1.0.5036.31919版）用于数据采集和处理，Microsoft Office Excel 2007（美国华盛顿州雷蒙德）用于计算平均值、标准偏差（SDs）、相对标准偏差（RSD）和变异系数（CVs）。

2.3.无ASN血清的制备

采用木炭剥离法制备无ASN血清[22.,23.]简言之，活性炭以0.2的比例添加到人血清中 g/mL，并在4℃下储存6小时 H然后将混合物在20000℃下离心10分钟。然后通过两次重复上述过程来剥离上清液。被证实剥离的人血清不受HILIC-MS / MS的ASN（图2（a）)．

２.４.标准的解决方案

在水中制备ASN (100mm)原液，并在−20°C保存。用50%甲醇连续稀释ASN原液，制备校准曲线的标准溶液。标准溶液用于刺激无ASN(炭剥)人血清，以提供最终浓度为2,4,20,40,100,160和200的模拟血清样品μM.在ASN浓度为6、80和150时，以相同的方式制备质量控制（QC）样品 μM。

2．5．血清样品制备

ASN通过蛋白沉淀从血清中提取。简单地说，血液样本被采集到一个含有凝血剂的血液采集管中。轻轻摇匀后，将血样置于4°C静置5min, 4°C、3000离心为5分钟。将血清的上清液转移到新鲜管中。然后，血清样本（100 μl）立即通过添加500个剥夺剥夺 μL甲醇，在−70°C下保存，直至分析。对于ASN, 20的确定μL (500μM ASN-D_3.)和10 μ将L甲酸（5%，v/v）添加到脱蛋白样品中并旋转1小时 然后在20000℃下对混合物进行离心为5分钟。收集上清液进行HILIC-MS/MS分析。

2.6。方法验证

根据《中华人民共和国药典》（2015年版）发布的建议，HILIC-MS/MS方法已被验证用于测定ASN并符合美国FDA和欧洲药品管理局的指导原则。进行了完整的验证，包括线性、LLOQ、选择性、携带、基质效应、回收率、准确度、精密度和稳定性评估。

2.6.1。特异性、敏感性和线性

ASN和同位素标记IS (ASN- d)的选择性_3.)相对于内源性基质在无asn(炭剥离)人血清中测试。如本节所述，制备和分析空白样品2．3。ASN保留时间内的干扰物质应不可检测，或小于LLOQ峰面积的20%和5%（2 μM） 分别为分析物和IS。灵敏度由ASN的LLOQ确定，具有可接受的精密度（RSD ≤ 准确度（在±20%范围内）和信噪比(S / N≥10)。根据人血清中ASN浓度的正常范围(40-80)设计校准曲线μm）。ASN的线性范围为2-200 μM. ASN的峰值面积比，并抵抗2,4,20,40,100,160和200的浓度比 μM绘制，利用最小二乘回归方程建立校准曲线，加权因子为1/x^2.．

2.6.2.精度和准确度

通过分析LLOQ（2的尖刺炭剥离血清样品，在三种不同场合进行ASN的杂交精度和准确性（2 μM） 和三个质量控制级别（6、80和150 μM） 在六个重复中，CV用于评估批内和批间精密度，并符合可接受标准≤低、中、高质量控制（LQC、MQC和HQC）样品和≤LLOQ浓度为20%。准确度值应为标称浓度的85%–115%，LLOQ除外，LLOQ扩展至标称值的80%–120%。

2.6.3。基质效应与恢复

血清中内源性的影响矩阵的电离ASN还是被比较的相对反应评估postspiked样本(分析物和解决方案添加postextracted ASN-free (charcoal-stripped)生物矩阵残留物)和unextracted样本(分析物和使用50%解决方案直接稀释甲醇)在三个QC级别。矩阵效应表示为矩阵因子归一化到IS。对血清中基质效应进行了4个重复的评价。ASN和IS的回收率是通过比较提取样品的峰面积来测量的，这些样品的制备方法如本节所述2．5，将未提取的样品分为三个QC级别，共6个重复。

2.6.4。结转

根据定量上限（ULOQ，200），通过注射空白样品（木炭剥离的人血清）来研究携带效应 μ米)样本。结转评价分3次重复进行，空白样品峰面积不应超过LLOQ的20%和IS的5%。

2.6.5.稳定性

在LQC和HQC中模拟炭剥离的人血清样品，用甲醇去蛋白，与新鲜制备的校准样品一起分析，以获得实际浓度。平均浓度应为标称浓度的85%-115%，以证明在不同的储存期间的稳定性。

通过比较ASN溶液在−20°C下储存92天的反应来评估储备溶液的稳定性。IS (ASN-D)的物理化学性质_3.)被认为与ASN相似，因此本研究不评估IS的贮存液稳定性。在制备前，用炭剥离的人血清制备QC样品，在室温下保存48小时，以评估ASN的台式稳定性。长期稳定性通过在−70°C下保存QC样品87天来评估。为评估制备样品的回注或延迟进样是否会导致降解，处理后的QC样品在自动进样器(室温)或冰箱(4℃)中保存48小时。为了确认人血清中ASNase的存在是否干扰ASN的测定，将ASNase添加到LQC和HQC炭剥的人血清样品中，最终活性为2iu /mL (C_马克斯ASNase在治疗剂量下的剂量为1-2 然后立即用甲醇将混合物脱蛋白，并在室温下储存48小时 h、 使用新制备的校准曲线测定这些QC样品的实际浓度，并考虑每个水平上标称浓度的85%–115%的平均浓度，以证明稳定性。

2.7。所有患者的血清ASN浓度

经验证的HILIC-MS/MS方法用于监测所有患者的血清ASN浓度。血清样本（85）从同意书中分析了南方医科大学珠江医院的所有患者。85份样本中有49份来自接受ASNase治疗的患者。在分析之前，每位患者都签署了知情同意书，授权将其血清样本用于研究目的。

3.结果与讨论

３．１．质/ MS方法开发

在优化过程中初步考察了C18和C8柱的反相高效液相色谱。无论是否添加甲酸铵或甲酸，使用C8和C18色谱柱，乙腈对ASN反应低，峰形差。值得注意的是，ASN的响应和峰形在甲醇-水系统中都有很大改善。然而，在甲醇-水体系中，ASN不受pH的影响被快速洗脱，导致显著的基质效应，保留时间几乎没有变化，甚至甲醇的比例在60% - 95%之间(数据未显示)。综上所述，常用的反相高效液相色谱法不能测定ASN的浓度，因为其极性高。

为了克服这些缺点，HILIC被用于极性化合物如氨基酸的分离。高极性化合物不仅在HILIC方法中有更好的保留和分离，而且不需要传统的衍生化步骤或离子对分离[21.].在HILIC柱上优化液相色谱。安捷伦HILIC Plus柱（4.6 × 100 毫米，粒径3.5 μM)以甲醇-水为流动相。在开发初期，在流动相中加入甲酸铵(5 mM)。但观察到峰形较宽，后有一点尾部，这可能是因为ASN是两性化合物。分子形式和离子形式的ASN，有不同的极性，被发现存在于流动相。因此，在流动相中加入0.1%甲酸(v/v)，将ASN全部转化为离子形式。在酸的存在下，峰形改善，信号增强。此外,流动相的流速是影响喷雾效率和另一个因素影响的信号反应女士虽然0.2毫升/分钟的流量是推荐使用的探测器女士在这项研究中,一个低流量通常会导致广泛的峰形状和长时间分析(10分钟在这项研究为0.2毫升/分钟)。评估流速为0.2-0.5 mL/min，如预期的那样，低流速下的信号响应更高。而在0.3 mL/min时，ASN峰面积与0.2 mL/min时相似，分析时间缩短至6min。因此，以0.3 mL/min的流动相流速测定ASN。

３．２．提取方法开发

传统沉淀法（PPT）、液液萃取法（LLE）和固相萃取法（SPE）是生物样品常用的三种有效提取方法[24.,25.,26.]其中，LLE不适用于本研究，因为ASN具有高度水溶性，难以使用有机溶剂（如乙酸乙酯或氯仿）提取。SPE因其有效富集分析物和清除基质成分而被用于生物基质中的氨基酸分析。然而，制备使用SPE提取生物样品中的ASN通常成本高且耗时长。目前的研究旨在开发一种简单快速的方法，用于测定所有使用ASN酶治疗的患者的血清ASN。PPT是一种快速方便的提取方法，因此用于血清样品的预处理。甲醇和乙腈e被评估为沉淀剂，使用这两种试剂处理的样品的基线相似。观察到，在这两种情况下，可能是由于样品培养基和流动相之间的pH值差异，峰出现分支和拖尾。要调整样品培养基的pH值，10 μ加入IS后加入15%甲酸，在甲酸存在下，峰平滑对称，甲醇沉淀后信号响应较高，因此本方法选择甲醇作为沉淀剂。

由于Asnase存在于所有患者的血清中，因此在血清样品中的ASN在储存期间会降低。在先前的研究中，据报道，亚磺酸琥珀酸能够通过非特异性沉淀来灭活Asnase，因此广泛用于在血清样品与全血中分离后血清蛋白沉淀[18.]．然而，亚磺酸亚琥珀酸强烈撞击了ASN的峰形状，可能是由于pH的变化。甲醇，另一种常用的沉淀剂，能够提供与亚硫酸盐酸的类似功能。因此，在本研究中，甲醇可以通过灭活ASNase并制备血清样品来发挥双重作用，并基于此，500 μL甲醇加入到100μL从全血分离后立即血清样品。加入甲醇后，样品可以储存在-70℃或进一步加工。结果表明，甲醇为ASN水溶液提供了类似的峰形状。在这种情况下，ASN的LLOQ是2 μM、 低于浓度（3 μM)被认为对治疗ALL有效。准确度和精密度分别为99.44±13.52%和15.02%。综上所述，本研究开发的方法快速方便，LLOQ低，适用于ALL患者的血清ASN定量。

３．３．方法验证

3.3.1.特异性、敏感性、线性和携带

通过评估LC保留时间的潜在干扰或背景噪声来评估分析方法的特异性(T_R)的分析物和IS来自内源性化合物。比较ALL患者无asn人血清、加标炭剥血清和正常血清的色谱图(图)2.)．图表显示T_RASN和IS的时间都约为4.7分钟，在分析物的保留时间没有观察到基质成分的色谱峰。ASN测定的灵敏度令人满意，信噪比(s/N) / 10。

在2-200的范围内观察到良好的线性度 μM，相关系数(R^2.)所有常规校准曲线均大于0.99，适用于所有患者的血清ASN测定，斜率和截距为2.2631 ± 0.7621和−0.0095 ± 0.0083，所有七个校准水平的校准精度均小于±15%偏差。在注入ULOQ（200 μm）。

3.3.2。矩阵效应和恢复

评估基质效应以评估生物基质中内源性成分可能引起的电离增强或抑制。在同等浓度下，比较提取后样品和溶剂样品中ASN和IS的峰面积比。总结了三个QC水平下的IS归一化基质效应n表1..平均标准化基质效应为94.64%–100.91%，CVs小于15%，表明内源性基质在验证条件下不影响ASN的测定。

ASN在6、80和150时的整体过程恢复(也称为绝对恢复)μM为60.32 ± 5.10%, 61.37 ± 0.91%和63.17% ± 回收率为63.83% ± 2.12%。总的来说，该方法的整个过程回收率是可接受的。

3.3.3。精度和准确性

在LLOQ和三个QC水平下，使用六个重复的炭剥离血清样本来评估ASN的精密度和准确度。批内和批间精密度分别为5.03%–15.02%和3.89%–14.74%，与标称值的偏差为0.07%–8.20%（表1）2.)．精密度和准确度值均满足指南的标准，表明验证的方法是可靠的，可重复性测定ASN。

3.3.4。稳定

ASN从原液中的回收率为102.70% ± 4.08%在室温下储存后−20°C，持续92天。表中总结了沉淀炭剥离血清样品中ASN的稳定性3.．用甲醇沉淀后，ASN在台式制备过程中至少可以稳定48小时，在−70°C下保存87天。制备的样品在自动进样器中保存(室温)或在4℃下冷藏48 h后也表现出良好的稳定性。炭化后的人血清中ASNase含量较高，常温下加入甲醇48 h未见明显降解，说明甲醇对ASNase活性有抑制作用。因此，在实验室条件下，甲醇沉淀的人血清样品可以在不显著降解ASN的情况下准确分析。

3.4。方法应用程序

通过使用开发的HILIC-MS / MS方法，我们确定了从49名患者收集的血清样品中ASN的浓度。在施用Asnase之前，血清Asn浓度为52.06±13.11 μM(36个样品，范围36.16-90.32μM） 。ASN酶治疗后，49份血清样本中46份ASN浓度低于该方法的检测限，表明对这46名患者的治疗是有效的。ASN残留在3例ASN酶治疗患者的血清中（42.63、17.60和23.60） μM)，说明这3例患者ASNase治疗效果不理想，需进一步优化临床治疗(表)4.)结果发现，ASN水平与ASN酶治疗的有效性相关。为达到满意的ALL治疗效果，血清ASN水平应低于3 μM和ASNase应高于0.1 IU/mL [27.]然而，发现3例残留ASN患者（编号21、30和31）的ASN酶活性为0.017 国际单位/毫升，0.082 IU/mL和0.015 IU/mL，分别小于0.1 IU/mL。因此，上述结果表明，检测血清ASN浓度有助于评估所有接受ASN酶治疗的患者的ASN酶活性。

4.结论

一种新颖、快速、方便的LC-MS/MS分析方法已成功开发并在人血清中得到验证。使用甲醇的一步蛋白质沉淀过程是一种方便的样品制备方法，用于制备用于LC-MS/MS分析的血清样品。HILIC柱可实现ana的良好分离使用甲醇-水（95%）流动相获得碱液和对称峰响应 : 5，v/v），含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵。总运行时间为6小时 注射量为5分钟时，未观察到任何携带物 μL.该方法已经过验证，具有良好的特异性和敏感性，回收率适当，无基质干扰。精度和精密度在浓度范围2-200以上μ我满足指导方针的要求。通过监测ALL患者血清中ASN浓度，证实了所开发方法的稳健性。因此，本文所采用的方法是一种简单、快速、有选择性的分析方法，在所有接受ASNase治疗的患者中发现了ASN基因量化的潜在用途。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

广东省医院药学基金(No. 2016A28, No. 2019A01);广州市卫生和计划生育委员会科技计划项目(No. 20181A010039);广州市医学重点学科(No. 2017-2019);广东省自然科学基金(No. 2018A030313821)和广州市中西医结合科技项目(No. 20192A010012)资助。

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