乙醛酸合成混合物中乙醛酸的简易分光光度法测定

摘要

一种新的简单且可靠的分光光度测定方法被描述为确定乙醛酸在其合成反应混合物通过在存在乙醛酸和色氨酸之间的改性霍普金斯 - 科尔反应的方式含草酸，乙醇酸，乙酸，乙二醛，和乙二醇氯化铁和浓硫酸。The linear range of glyoxylic acid concentration is 0–0.028 M. The limits of detection (LOD) and quantitation (LOQ) are 0.0019 M and 0.00577 M, respectively. The LOD, LOQ, standard deviation, relative standard deviation, and recovery ratio of the proposed method are comparable with a selected HPLC reference method. Both methods displayed same precision and credibility. Reaction stoichiometry between tryptophan and glyoxylic acid is assumed to be 2 : 3. Reaction mechanism has been postulated based on identified molar ratios of reactants. Glyoxal gave a negative test with tryptophan although it is a dialdehyde.

1.介绍

乙醛酸（GA）是一种重要的有机酸，广泛应用于化工、化妆品、医药、食品等行业。它存在于植物中，参与动物的代谢循环。乙醛酸的制备方法有：乙醛硝酸氧化法、乙烯或乙醛催化氧化法、草酸电化学还原法[1个]。

乙醛酸在电化学合成反应混合物中的测定是一个困难的过程，因为该混合物含有具有会聚酸离解常数的羧酸和其他带有可氧化或还原的有机基团的化合物，如乙二醇、乙二醛和乙醇酸。因此，使用传统的分析方法，如酸碱滴定、氧化还原滴定、分离或沉淀，很难定量测定乙醛酸[2个,三]。

本文提供了用于测定在这类反应混合物乙醛酸的简单，可靠，廉价的分光光度法直接而不需要分离。的方法时它们反应根据由霍普金斯和Cole [于1901年发现了一种反应取决于乙醛酸和色氨酸之间有色色原产物形成4个]（见方程式(1个))。他们提出，一个乙醛酸分子可以与两个色氨酸分子发生反应，使之呈现出紫红色，并在540-545纳米范围内被吸收。这种反应理想地发生在由浓硫酸保证的无水介质中[5个–八]:

自从霍普金斯-科尔试验被发现以来，由于产品形成速度慢、颜色变化多样以及产品稳定性低，它在色氨酸定量测量方面既不容易也不可靠。这促使大量的研究人员提出许多改进建议，如[9个–17]。在[9个,10]添加硫酸铜等辅助材料，得到深紫红色产品。卡里[9个] was the pioneer in the description of the crimson-violet color absorption at 560 nm. Other researchers [11–14]研究了有机醛和色氨酸之间形成的化合物和化学计量。添加过硫酸盐、铁等温和氧化剂后蛋白质中色氨酸的定量测定³⁺离子，加速了显色剂的出现并提高了其稳定性[15–17]。然而，由于影响乙醛酸定量测定准确性的因素，本试验目前还不能令人满意。

用2-氨基苯甲醛和甘氨酸进行显色反应，用乙醇酸分光光度法测定酶的活性[18]或通过形成具有苯肼颜色的产品，但这种方法可以通过其它醛的在混合物中的存在的影响[19]。

用高效液相色谱法测定类似有机混合物中的乙醛酸在[20,21]分别使用折射率和光电二极管阵列探测器。另一种方法要求乙醛酸与2,4-二硝基苯肼的衍生物[22,23]. 其他混合物中的乙醛酸也通过该技术测定，但在将乙醛酸转化为检测限达到5纳摩尔/升的氟碳衍生物后，使用更灵敏的检测器荧光检测器测定[24]。

差示脉冲极谱法等其他方法[25]离子色谱技术[26]已被同样用于分析具有不同程度的成功类似反应混合物。

这个工作的目的是提供一种用于确定在电化学合成混合物乙醛酸的新的快速，可靠，廉价的分光光度法直接而不需要分离。

1.1。物料

草酸(BDH) 99%，乙醛酸(Merck)水溶液50%，乙醇酸(Sigma Aldrich) 99%，乙二醛(Merck)水溶液40%，乙二醇(BDH) 99.5%，冰醋酸(SDFCL) 99.5%， l -色氨酸(BDH) 93%，硫酸(Panreac) 95-98%，六水氯化铁(Avonchem) 98%新鲜包装。

1.2。仪器

采用彩虹公司721-2000型分光光度计，HPLC柱:Knauer Eurokat柱H型，RI检测器(Knauer)。

1.3。实验工作

霍普金斯与科尔的反应(方程式(1个))was applied on each component of the reaction mixture consisting of oxalic acid, glyoxylic acid, glycolic acid, glyoxal, ethylene glycol, and acetic acid solution in water at 0.028 M concentration in the following procedure.

在每根试管中分别放入0.25 mL反应物溶液、0.6 mL色氨酸0.016 M溶液和2 mL新鲜氯化铁0.025 M溶液。充分混合，然后倒入5毫升浓硫酸，每毫升约1份，持续搅拌30分钟，放入自来水冷水中，防止温度超过50°C。然后，在10-20分钟内读取560nm处的吸光度。如果要使样品经受较长的时间，涉及Fe的二次转变^{+ 2}离子可能导致颜色变化和测试失败。

1.4条。结果和讨论

1.4.1条。混合物中乙醛酸定量测定方法的适用性

数字1个显示了除了空白样品外，使用建议的乙醛酸和其他混合物成分的试验程序获得的光谱。水代替空白样品中的有机化合物。

Three absorption maxima can be observed at wavelengths 440, 500, and 560 nm. The maximum at 560 nm is a characteristic for glyoxylic acid. The other two maxima are common for all compounds, including the blank sample. Thus, they can be attributed to the interaction with ferric chloride (see Section2.2). 因此，采用该方法进行的霍普金斯-科尔反应试验仅对乙醛酸具有选择性，而不受所研究混合物的任何其他化合物（包括含醛基的乙二醛）的干扰。然而，基线必须是零设置使用空白样品，以补偿氯化铁与色氨酸相互作用的次要效应。

此外，图2个描述了使用所建议的试验程序获得的仅0.028 M乙醛酸溶液和混合溶液中0.028 M乙醛酸的光谱。可见，在560nm处，纯乙醛酸和混合物中的乙醛酸的吸光度几乎相同。

2。方法变量的优化

优化过程的目的是使霍普金斯-科尔反应只与反应混合物中乙醛酸的浓度有关。

2.1。浓硫酸影响

Added volume of concentrated sulphuric acid was varied: 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 mL, while amounts of reactants were kept constant at 0.25 mL glyoxylic acid 0.028 M solution, 0.6 mL tryptophan 0.016 M solution, and 2 mL ferric chloride 0.025 M solution. The final volume of liquid in tubes was corrected with distilled water. Test procedure was described in the experimental work section. Figure三表明在5 mL硫酸添加量下，光吸收率增加，这意味着必须存在足够数量的浓硫酸才能吸收反应水和水合水。否则，乙醛酸的醛基可以水合为双环二醇(千 = 300 at 25°C) and eventually further dimerized to hemiacetal, thus making it not be available for reaction with tryptophan.

2.2条。三氯化铁的影响

三氯化铁0.025 M溶液的加入体积变化为:0.25、0.5、1、1.5、2 mL，其他混合物成分和测试程序不变(见本节)2.1)。数字4个随着氯化铁溶液体积增加至1ml，吸光度呈比例增加，随后增加至2ml氯化铁溶液体积，吸光度略有增加。因此，需要在反应混合物中加入足够数量的氧化剂以获得满意的性能。

在图中确定其在440和500纳米处的吸收最大值1个和2个在没有加入氯化铁溶液的情况下，进行了单独的试验。数字5个显示这些最大值的消失。然而，在560 nm处的最大值（代表乙醛酸）显示出远低于图中所示的强度1个。它因此表明氯化铁，在与协议[16,17]，增加颜料产物的产率。

铁离子效应的机理可以归结为leuco染料分子中的氧化反应，它是由两个色氨酸分子与一个乙醛酸分子缩合而成的(见图)6个和部分4个)。

2.3。色氨酸的影响

色氨酸0.016 M溶液的体积变化:0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，其他混合物成分和测试程序不变(见本节)2.1)。如图所示7个，随着色氨酸溶液添加量的增加，吸光度成比例增加，直至0.3 mL。此时，色氨酸的量(0.48×10)^-5个摩尔)应与样品中乙醛酸的完全量(0.7×10)反应^-5个鼹鼠）。之后，吸光度在接近0.6 mL（或0.6 mL）的平台时缓慢增加 0.016 = 0.96 10^-5个摩尔)。色氨酸溶液体积越大，吸收率越高，这是色氨酸与铁离子相互作用的结果。我们决定在所有即将进行的试验中保持过量的色氨酸，以补偿它在与铁离子反应时的损失。

2.4。温度的影响

在从环境温度到90°C的不同温度下进行了大量的测试(这里没有显示)。在环境温度下，由于反应本身和硫酸水合作用产生迅速和强烈的热量，实际上很难进行成功的试验。然而，在50°C以上进行的测试产生的颜色与紫红色不同，且缺乏重现性。这并不令人惊讶，因为色氨酸-乙醛酸是已知的最大的不稳定色素。它们很容易失去一氧化碳_2个很快就会在一点点变暖的情况下氧化[13]。幸运的是，在48-50°C温度下进行的测试显示了很好的重现性，并形成了稳定的颜色。

三。标准曲线

标准校准曲线根据优化过程条件乙醛酸浓度制备。将分光光度计使用空白样品即包含水而不是在测试混合物乙醛酸设定为零。数字八说明在560nm处吸光度与乙醛酸浓度的关系。在代表乙醛酸校准曲线的0-0.028 M范围内，得到了颜色强度与乙醛酸浓度之间的线性关系。在0.028 M处，假设乙醛酸的量为(0.7×10)^-5个moles) reacts with the corresponding stoichiometric amount of tryptophan (0.48 × 10^-5个从体形看痣7个)。吸光度的进一步轻微增加之后可以归因于过量的乙醛酸与色氨酸的副产物与铁II离子的相互作用。

4.机制的讨论

在霍普金斯 - 科尔试验发现的早期阶段，可以确认的是，当与二羟乙酸反应，色氨酸能够得到两种不同颜色的产品[13]：当醛的最低含量和温度保持在15℃以下时，第一种有色产品是胭脂红。其形成机制假定遵循图中假定的方案9个。这里，醛联合2个色氨酸分子的苯环的碳原子形成的无色化合物，这在氧化时形成在分子负责的颜色（色素化合物（1））的醌型结构;出现在方程相同的产品（1个)。这种建议的途径需要存在一种强凝聚剂，如浓缩的H_2个所以_4个或纯乙酸和温和的氧化剂等 。

通过使温度上升到约50℃，充分的活化能量将提供给触发通向第二有色产物进一步缩合步骤（色素化合物（2））显示从紫色到蓝色，只取决于水的含量，蓝色在其固体形式。因此，首先形成颜料的化合物（1）具有两个乙醛酸醛进一步冷凝。该缩合，不过，出现的侧链中的氮和吲哚核的相同色氨酸分子中的碳原子之间。它因此导致了色氨酸侧链的闭合和吡啶核的形成[13]. 根据图中推测的路径，可能形成这种有色产品10. 由于负责颜色的分子具有类似的醌结构，它也在相同的波长560 nm处吸收。

弗里德曼和芬利[27]提出了乙醛酸与色氨酸在纳米还原剂存在下的另一反应机理_2个其中，乙醛酸结合了吲哚核的碳原子，而不是两个色氨酸分子的苯环，形成了亮氨酸化合物。

在我们的工作中，我们根据数字计算了反应的化学计量7个和八。结果表明，色氨酸与乙醛酸的反应化学计量比为2:3，证实了上述机理。

并不是所有的醛都能与色氨酸发生反应，因为乙二醛的检测结果为阴性。似乎只有易与苯环、吲哚核或氨基反应的醛才能与色氨酸缩合。

5个。方法的验证

为了验证我们的方法，我们测量了两种有机混合物中的乙醛酸，这两种有机混合物包含已知浓度的研究化合物，使用此方法和参考高效液相色谱法[21]。结果显示在表格中1个–三。分光光度法与所选用的高效液相色谱法在标准偏差、相对标准偏差、回收率等方面具有可比性。从LOD和LOQ值可以看出，乙醛酸可以用拟议的分光光度法在更稀的溶液中测定。然而，这两种方法都保证了同样的精度和同样的可信度F型- 和t型- 统计测试，分别因为既显示出计算出的测试值超过临界的还要小。

6.结论

乙醛酸已经通过基于其与色氨酸在氯化铁和浓硫酸存在下反应一个新的分光光度测定方法包括草酸，乙醛酸，乙醇酸，乙酸，乙二醛，和乙二醇的有机混合物被确定。新方法不需要从混合物乙醛酸的预先分离。发现色氨酸和乙醛酸之间的反应通过反应条件的影响。温除热和正确的试剂的量控制好都为新方法的成功是至关重要的。The method was found to be effective within the range 0.00557–0.028 M of glyoxylic acid concentration. The limit of detection, limit of quantitation, standard deviation, relative standard deviation, and recovery of the proposed method were found comparable with a selected HPLC reference method. Both methods displayed same precision and credibility. Reaction stoichiometry of tryptophan to glyoxylic acid was found to be 2 : 3, and the product is tryptophan blue dye. Although it is a dialdehyde, glyoxal did not react with tryptophan according to the Hopkins–Cole test.

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应的作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

补充材料

在上部部分中的过程中的步骤和在底部2色氨酸和3个乙醛酸分子之间所提出的缩合反应图解摘要显示，以形成用于确定乙醛酸紫色色产物。(补充材料)

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