文摘

选择性、敏感、快速的方法通过使用ultraperformance液体chromatography-tandem质谱(UPLC-MS / MS)测定组胺的鱼和鱼露。液相色谱分离和质谱分析的最佳条件的组胺也被调查。方法的线性范围是20.0÷1000 ng / mL,和相应的相关系数为0.9993。意味着复苏的分析物在三个峰值水平(低、中、高)÷102.5%(98.5%的范围内n= 7)。检测的极限(LOD)和量化的限制(定量限)值分别为3.83和11.50 ng / mL的鱼酱样品和4.71和14.12 ng / mL的鱼样本,分别。基体效应的影响在准确性、可重复性和复苏的方法是微不足道的。推荐的方法是应用于确定这种物质的含量在21鱼酱和4种鱼类样本,样本来自胡志明市,越南,2019年。

1。介绍

很长一段时间,组胺在鱼和渔业产品的内容以及它的中毒吸引了很多来自世界各地的科学家的关注。这种化合物分解时产生的氨基酸组氨酸遵循两种方式。分解代谢的主要途径组氨酸通过谷氨酸的转换,开始与组氨酸尿刊酸的降解酶组氨酸酶的作用。产品转化为alpha-ketoglutarate谷氨酸,这是三羧酸循环的中间(克雷布斯循环)。第二种方法是脱羧(首席运营官)损失酶组氨酸脱羧酶的作用形成组胺(1,2]。鲭亚目的综合征/组胺中毒发生在世界范围内,病例数在增加,尽管提高海产品安全知识(3]。组胺中毒的症状都类似症状遭遇ige食物过敏。症状包括恶心、呕吐、腹泻、口腔烧灼感或辛辣的味道,荨麻疹、瘙痒、红疹、低血压(4]。发病的症状通常发生在几分钟内涉及食物的摄入后,症状的持续时间和范围从几小时到24小时(1]。由于组胺的毒性,这种物质被严格控制的内容。根据《食品法典》302 - 2011年组胺被认为是鱼露的风险,和这种化合物的内容不得超过400毫克/公斤5,6]。监管委员会(EC),没有。1019/2013,建议组胺水平不得超过400毫克/公斤鱼酱和渔业产品200 - 400毫克/公斤(7]。欧盟和美国食品和药物管理局(FDA)固定100和50毫克/公斤的最大的鱼和渔业产品的组胺水平,分别为(8,9]。

鱼酱,一个基本成分中使用的许多东南亚菜,蘸调料,逐渐在世界范围内流行10]。鱼露是自发产生的一个清晰的棕色液体发酵等各种鱼的凤尾鱼、沙丁鱼和鲱鱼11]。这些鱼通常拥有高水平的自由氨基酸组氨酸和其他。组胺产生的数量在传统鱼露是免费组氨酸内容相关的原材料。在发酵过程中,蛋白质是由内源性蛋白酶水解鱼肌肉和消化道蛋白酶嗜盐细菌产生的(2,12]。鱼酱生产的物种最常用的是印度鳀鱼(Stolephorusspp)。凤尾鱼通常捕获和保存。生产商与良好生产规范会鱼用盐混合后,能阻止组胺的形成。然而,一些保持鱼没有盐前8小时着陆和运输到工厂在一个开放的容器没有适当的冷却系统(13]。由于原材料的性质和生产方法对于传统的鱼酱,高水平的组胺被发现在许多样本(14,15]。有超过2800条鱼酱生产设施在越南,已经每年生产超过2亿升,越南盾价值超过4.8万亿。然而,越南的鱼露出口仅占3 - 5%的产量。当前出口总额较低的主要原因是,并没有一个好的品牌的海外越南鱼酱。除此之外,另一个重要的问题是,传统的越南鱼露经常遭遇技术壁垒与一些国际质量标准,如组胺水平(16]。目前,组胺被发现了许多方法,如电泳(17),薄层色谱法(18),核磁共振(NMR) (19),光致发光CdTe量子点(20.),比色法(21,22),增强拉曼光谱(ser) [23),电化学(24(AuNPs) [], nanogold粒子25],HLPC-UV [14,25,26),LCMS /女士[26),UHPLC-Q / TOF-MS [11(女士),或UHPLC-MS /27]。目前,组胺的标准程序分析UPLC-MS /女士在越南还没有被正式宣布。因此,在这项工作中,我们已经开发出分析方法缩短分析时间,提高灵敏度和选择性基于UPLC-MS / MS。因此,我们希望提供一个新颖的分析方法用于测试中组胺的存在鱼酱和渔业产品在越南。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

所有试剂均为分析纯。组胺的参考标准从默克公司购买(达姆施塔特,德国);乙腈(ACN)和甲酸(FA)提供从Sigma-Aldrich(德国)。甲醇的高效液相色谱级和收购j·t·贝克(美国Phillipsburg)。

2.2。仪表

开发和验证的方法进行一个超高液相色谱(UPLC)系统包括柱温箱和恒温器autosampler(最终3000年热费希尔科学、不来梅、德国)结合水域。

TQD串联四极质谱计,在电喷雾正离子模式选择反应监测(SRM),是用于数据采集。

2.3。标准的解决方案

股票的标准解决方案1.0毫克/毫升的组胺制备在ACN浓度为1.0毫克/毫升。立即准备工作的解决方案是使用前股票标准溶液的稀释0.1毫升10毫升ACN获得一个解决方案有一个已知的浓度为0.01 mg / mL。股票的解决方案都是保持冷藏(2 - 8°C)不使用时。

2.4。样品制备

2.4.1。鱼样品

样本收集来自不同商业鱼市场在胡志明市。每个样本都被单独装在一个塑料袋里,保存在一个冰箱,,西贡STC高科技的实验室分析中心,胡志明市。考试,鱼代表样本(50克)切成小片和精细的地面与搅拌机同质化之前提取。然后,5.0±0.1克的鱼样本转移到50毫升离心管,增加了25毫升的甲醇,涡2.0分钟,用超声波浴20分钟。解决方案被转移到一个50毫升容量瓶,和体积与甲醇化妆。然后,这个解决方案是通过一个0.45过滤的μ米绘画纸膜。样品的解决方案已经在去离子水稀释(稀释系数取决于数量的样本组胺)和过滤是0.22μ米过滤到1.5毫升琥珀LC瓶。体积为5.0μL的样品溶液注入通过autosampler UPLC-MS / MS系统在最优的实验条件。

2.4.2。鱼酱样品

鱼酱样品,包括10工业鱼露(IFS)和传统的鱼露(TFS),收集当地市场和超市在胡志明市,越南。样品制备的过程如下:1.0毫升的鱼露是准确到50毫升容量瓶,溶解,由甲醇的马克。然后,0.5毫升的这个解决方案被转移到一个10毫升容量瓶,溶解并由与去离子水卷,并透过0.45µm过滤器。样品的解决方案是在去离子水稀释(稀释系数取决于数量的样本组胺)和过滤是0.22µ米过滤到1.5毫升琥珀LC瓶。UPLC-MS / MS分析,如部分所述2.4。1。

2.5。液相色谱条件

liquidchromatographic分离,HILIC硅3µ米,2.1×50 mm,亚特兰蒂斯号列应用分离的目标分析物在40°C的温度。二进制移动阶段ACN 100 mM + HCOOH (一个)和DI + HCOOH 0.5% (B)。加载泵的流动相程序如表所示1。流率一直保持在0.3 mL / min在整个色谱分析过程。样品和标准的解决方案都保持在10°C样品托盘中。5.0µL标准或样品注入UPLC-MS /系统通过autosampler女士。针和样品环autosampler洗一式三份,使用ACN的混合和去离子水(1:1,v, v)。

2.6。女士的条件

寻找女士的最佳条件,选择反应监测(SRM)获得的光谱在正离子模式应用于识别指定的分析物。离子源参数优化如下:电离来源:H-ESI(+),喷涂电压:3500 V,蒸发器温度:300°C,离子迁移管温度:300°C,鞘气体:40 arb,辅助气体:5 arb, CID气体:2毫托。TraceFinder 3.3软件被用于计算峰面积和峰面积比率。

2.7。方法验证

2.7.1。线性

评价线性,一系列的参考标准的解决方案准备的组胺的浓度范围为20.0,50.0,150.0,200.0,500.0,1000.0 (ng / mL)。在每一层,一式三份的标准测量解决方案。基于绘制峰面积比值的内部标准和飙升的浓度,校准曲线方程计算。

2.7.2。LOD测定和定量限

检测极限(LOD)和量化(定量限)是两个重要的极限性能特性的方法验证。LOD和定量限,严格相关测量系统中的噪声的大小,可以以不同的方式决定的。在这项工作中,这些值的公式计算出LOD = 3 sd和定量限= 3 LOD (28,29日]。

2.7.3。基体效应(我)

基体效应的评估是由使用一个实验模型Matuszewski et al。30.]。在验证的过程中,基体效应的开发方法被分析信号的测量检查postextraction飙升的组胺组胺标准的解决方案,在一个简洁的解决方案。两组的实验进行了集中样本。第一组是由五个鱼酱混合样本,和第二组是由混合四个鱼样本(沙丁鱼、凤尾鱼、鲱鱼和鲭鱼)。样品制备是执行部分2.4。1。最终的解决方案(样本提取后)在三个级别的上升50,200和1000磅的标准的组胺。样本矩阵的影响是由以下方程: 在哪里一个的色谱峰面积标准的解决方案,B的峰面积标准上升到样品溶液提取后甲醇。

第2.7.4。复苏和精度

用于检查复苏和精度,实验进行了两种样品(鱼和鱼露)。一系列的例子是组胺样品在214年,428年,856 mg / L。解决方案是在去离子水稀释20倍。UPLC-MS / MS分析,如部分所述2.4。1。在每个层次中,测试是测量计算SD 7倍,R%,RSD %。

3所示。结果与讨论

3.1。色谱和女士条件

3.1.1。色谱条件

建立了UPLC色谱条件与HILIC硅3µ米,2.1×50 mm,亚特兰蒂斯号列,(甲醇5毫米HCOONH移动阶段₄+ 0.1% FA)和B (H2O HCOONH 5毫米₄+ 0.1% FA), 5.0µL注入体积。标准的解决方案在选定条件下的色谱表明纯溶剂的保留时间为3.69分钟,3.68对鱼和鱼露示例解决方案。图1表明没有显著差异的色谱仪标准组胺的溶剂和鱼酱样品溶液的浓度。分析物的保留时间和强度在两个样本是相关的。这种现象意味着样本背景保留时间的影响不显著。

3.1.2。女士参数

表2和图2描述了组胺及其分散离子质谱参数。前体离子显示112.2米/z;产品离子68米/z83米/z,95的米/z,分别。离子的碰撞能量是23.0 V (米/z68),16.0 V (米/z83)和15.0 V (米/z分别为95)。的米/z95年选择离子的定量分析。这个结果非常类似于先前的研究[14,24]。

3.2。方法验证

3.2.1之上。线性

现在在节3.1两个样品的基体效应(鱼和鱼露)不是重要的保留时间和强度的方法。简化的过程中,我们建立了纯溶剂的校准曲线。校准曲线在图3是线性范围的20.0到1000.0 ng / mL。从该方法获得的校准方程y= 35536x+ 692240。最小二乘回归的表现出一个优秀的相关系数为0.9993。每一个点的相对标准偏差(n= 3)不到3.0%。

3.2.2。LOD和定量限

我们可以看到在桌子上3LOD和验证方法的定量限和鱼鱼酱样品样品3.83和11.52和4.71和14.12 ng / mL,分别。因此,开发方法适合直接分析这种物质的鱼和鱼酱样品根据欧共体(7)和USFDA (8]。

3.2.3。选择性

内源性干扰的来源没有观察到图中的分析物的保留时间1。这一现象表明,样本背景保留时间的影响不显著而样本空白。这些值表明有一个最低样本背景对离子抑制的影响,离子增强,分析物的保留时间。这些数据也证明该方法的选择性测定组胺的实际样品很好。

3.2.4。基体效应

可以看到,在桌子上4与不同的脂肪含量,三个样本的背景,我值的范围从98.23%到104.01%是在可以接受的范围内30.)(从120%到80)。相对标准偏差在不同浓度合适的值。这些值显示,选择性样本背景的影响,测量的复苏是可以忽略不计。这种现象可以解释为优秀的HILIC硅胶柱的分离能力和MS / MS的高灵敏度探测器。相比其他方法测定组胺与复杂的提取,该方法大大缩短了分析时间,降低了分析成本和大量的溶剂释放后抽样过程。

3.2.5。复苏和精度

在该测试中,214年的水平,428年和856 mg / L,约的0.5,1.0,和2.0倍与欧共体阈值对组胺标准规定在鱼露,被选出的高峰。同样,水平的25、50和100毫克/公斤相当于0.5,1.0,和2.0倍EC规定的阈值的组胺标准样品和鱼产品被选为复苏的决心,精度和可重复性。如表所示5,复苏三个浓度组胺检测方法的谎言从100.86%到116.43%(鱼酱的样本),从95.14%到107.21%(鱼样本)。这些值符合的要求采用AOAC公认的(31日和类似于之前的研究26,32,33]。因此,这项工作的方法回收效率高,可用于实际样品分析。盘中重复性是在可接受的范围内,从1.61到的RSD为2.52%,而interday重复性范围从2.34到10.21%的相对标准偏差。类似的相对标准偏差值是鱼样品中发现的背景。观察到的相对标准偏差值的精度研究表明这对常规分析方法是足够精确的。

插图,发达的敏感性由UPLC-MS / MS方法,比较与先前发表的组胺测定方法在表6。发达方法提供了更高的灵敏度与出版方法相比。该方法的灵敏度类似于cITP-CZE-COND方法的选择性。

3.3。应用程序真正的样品

该方法已经应用于分析21鱼酱样品。如表所示7和图4、工业集团鱼露(IFS 00 IFS 10)包含组胺的含量从8.0到80.9 mg / L。一般来说,工业鱼酱的11种组胺含量分析是FDA的同样允许低阈值(8)下面的EC (7]。原因可能是由于封闭的工业生产过程和生鱼鱼酱是咸或冷冻后立即抓住。因此,组胺的转化率从组氨酸是更少。可能,在工业产品,纯鱼酱的内容是低,制造商增加了香料和调味品创建工业鱼酱。因此,组胺含量可能远低于传统的鱼酱。与此同时,在传统的鱼露集团(TFS 10 TFS 20)、组胺含量范围从385.6到1436.4 mg / L。这些值高于FDA允许的阈值。组胺含量的传统鱼露在越南很类似于该地区的其他国家,比如泰国(12,14)、马来西亚(15),中国(11]。事实上,在过去,人们在亚洲国家已经使用传统的鱼酱与高水平的组胺含量。然而,组胺中毒鱼酱是非常罕见的,因为鱼露在日常餐的数量并不多。然而,对于传统的鱼酱穿透欧洲国家或美国的市场,制造商、科学家、和经理必须找到一个解释组胺含量。

四生鱼样品常用的生产分析了鱼露。表8表明,这些样本中的组胺含量范围从一个相当广泛,在最高的鲭鱼,达到65.4毫克/公斤。组胺含量取决于类型和新鲜的鱼。鱼就被宠坏,组胺含量越高将[37]。鱼的组胺含量样品分析非常类似于以前的报告在越南的结果(38和其他国家20.,26]。我们还应用与HPLC-FDA设备采用AOAC公认的标准程序,确定的组胺水平鱼酱和鱼样本。结果见表7和8还显示,这两种方法进行和谐的结果。

4所示。结论

在这项工作中,我们已经开发和评估一个新的分析方法,具有良好的灵敏度、选择性、和恢复。这里描述的方法显示的承诺非常挑剔和敏感量化组胺的鱼酱和鱼类样本。HPLC-FDA方法也被用于比较分析,表明该方法有类似的结果,但更短的时间和更直接的样品处理。实际样品的研究也表明,组胺含量的传统鱼酱,由个别机构,远高于欧盟和美国食品及药物管理局的标准。希望,我们有了新的分析技术来评估和控制鱼组胺含量,渔业产品、食品和药品。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。女士优化,一些示例套色版以及恢复性能计算和校正曲线提出了补充信息(可用在这里)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

所有作者贡献了同样的工作。

确认

这个项目由西贡技术大学批准号DTCS-02, 2019年。

补充材料

S1:复合优化报告。S2: UPLC-MS /女士色谱图的组胺的鱼酱和鱼类样本。S3:数据测定R%和可重复性(鱼酱)。S4:复合校准报告。(补充材料)