文摘
一个简单RP-HPLC-PDA方法测定阿替洛尔(ATN)和曲美他嗪(TMZ)在人类尿液和平板电脑了。分析物分离Caltrex BI列(125×4.0毫米,5μ米)和25毫米磷酸二氢钾的pH值3.3,甲醇,乙腈移动阶段。PDA探测器是在TMZ 210 nm和225 nm ATN及流量为1.0毫升/分钟。获得了线性浓度范围(1.0 -100μg / mL)对分析物在标准解决方案和目标分析物的测定方法成功地应用在制药平板电脑。出色的线性度也得到的浓度范围(0.25 -25μg / mL), -25 (0.5μg / mL)在人类尿液TMZ和ATN的分别。一个简单的液液萃取是申请尿液样本清理和梯度法用于色谱分离。定量的下限(定量限)是0.99和0.60μATN g / mL, TMZ,分别。检测极限(LOD)是0.30和0.18μATN g / mL, TMZ,分别。国米盘中,精密度和准确度ATN在±1.89%的纯形式和尿液样本在±2.85%。国米盘中,精密度和准确度TMZ在±3.99%的纯形式和尿液样本在±3.19%。
1。介绍
阿替洛尔(ATN) (4 - (2-hydroxy-3-isopropylamino丙氧基)苯基乙酰胺)(图1)是一个cardioselectiveβ拦截器复合;官方记录是在英国石油公司(1]和USP [2]。据报道,ATN抑制释放肾素和血管紧张素ⅱ和醛固酮降低了生产3]。它既没有内在拟交感神经和膜稳定的行为。临床用于控制的高血压、心律失常、心肌梗死、心绞痛。它也可以用于预防治疗偏头痛(4]。
阿替洛尔(a)化学结构
曲美他嗪盐酸盐(b)的化学结构
曲美他嗪盐酸盐(TMZ), (1 - [(2、3、4-trimethoxyphenyl)甲基]哌嗪盐酸盐)(图1),也是一个官方的药品在英国石油公司(1]。TMZ用作防心绞痛的药物作用主要对缺血性细胞(5]。作用机理是基于改变能源基质偏好从脂肪酸氧化葡萄糖氧化调节细胞能量的过程,并在主时间保持适当的能量代谢在缺血状态。它没有影响心肌耗氧量或者冠状动脉血流6]。
TMZ没有负性肌力作用或血管扩张性特点及结合其他防心绞痛的药物,可以作为补充疗法主要用于伴左心室功能障碍等疾病患者和糖尿病7]。比较ATN-TMZ联合治疗和阿替洛尔加安慰剂已经建立,已显示出增强总运动时间和测试时间1毫米ST段萧条。这个组合被发现降低硝酸盐的必要性消费,减少心绞痛的疼痛等级,也减少心绞痛发作的总数7]。
共同服用不同的药物控制慢性疾病特别是老年患者可能导致复方用药药物不良作用和毒性等问题。肾脏和肝脏功能的变化可能影响药物药代动力学和药效学和可能增加死亡率。监视伴随药物在血液、血浆和尿液样本是强制性的在某些情况下(8]。阿替洛尔和曲美他嗪可以coadministered由于他们联合疗法的好处(7)和缺乏交互(9]。剂量可能会进行调整,以避免与其他药物不良反应。
阿替洛尔经历低或无肝代谢和排泄尿液改变主要在[4]。TMZ是血浆蛋白弱束缚。这是在低程度分成不同的代谢产物和代谢多数药物是完好无损在尿液中排出7]。分析物被认为是适合使用简单和快速尿液分析、治疗监测、复方用药问题的调查,和毒理学研究。另一方面,尿液样本非侵入性和方便10]。
不同分析方法已申请的决心阿替洛尔在生物体液和制药产品,如高效液相色谱法(3,11),但是5,6gc - ms (),12),薄层色谱(13],光度和spectrofluorimetric方法[14- - - - - -16),滴定分析17],伏安法[18),化学发光(19],毛细管电泳(20.]。几个清理方法,如液液萃取(3,11,12),固相萃取(21),和蛋白质沉淀(22)已被用于从生物中提取ATN液样本。
几个技术也报道了曲美他嗪的决心,包括高效液相色谱法(23,24分别在人血浆和剂型,质(5,25gc - ms (),26,27),效果28,29日),分光光度法30.,31日),电位法(32],伏安法[33),和化学发光34]。TMZ已经从生物体液隔离使用液液萃取(5),固相萃取(35[],和蛋白质沉淀方法6]。
据我们所知,没有发表的方法同时测定TMZ和ATN在人类尿液。介绍简单HPLC-PDA方法同时测定TMZ和ATN在人类尿液和TMZ的确定和ATN在相应的平板电脑。
2。实验
2.1。材料和试剂
所有化学试剂均为分析纯和溶剂的高效液相色谱法。曲美他嗪从σ请提供医药行业(埃及开罗)。阿替洛尔从埃及Int。请提供医药产业有限公司(10日斋月城市、埃及)。Metacardia®包膜缓释片剂标签包含20毫克曲美他嗪/平板电脑和Blokium®包膜缓释药片标记每片含有100 mg阿替洛尔是来自当地的药房。乙腈,高效液相色谱级、正磷酸和正磷酸盐单碱的得到来自英国费舍尔科学(英国主教草甸路)。甲醇和水从TEDIA化学品(美国)获得。氢氧化钠、氯仿和正丁醇买来El-Nasr医药化工有限公司(Abu-Zaabal,开罗,埃及)。人类空白尿液收集从健康成人志愿者不抽烟的人。尿液样本存储在-20°C。
2.2。仪表
高效液相色谱系统由安捷伦科技1200系列色谱仪器(美国安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)配备一个autosampler喷射器,100μl注入循环,安捷伦四元泵,溶剂柜。流动相过滤是0.45μm膜滤器(微孔,爱尔兰)和脱气和真空脱气装置。进行分离Caltrex BI(125×4.0毫米,5μ米)使用紫外灯(德国)和G1315D光电二极管阵列检测器(PDA)。
2.3。股票的解决方案的准备
股票的解决方案曲美他嗪或阿替洛尔准备单独在1.0毫克/毫升甲醇。工作方案由股票的解决方案的进一步稀释用水飙升校准标准和质量控制样品。股票的解决方案都是保存在琥珀色的玻璃容器在2 - 8°C。
2.4。制备校准标准和质量控制样品
2.4.1。整洁的标准解决方案
校准标准准备在高效液相色谱级水浓度的1.0,3.0,5.0,10、25、50、75和100μ分析物的g / mL。低,地中海,和高质量控制(QC)样本浓度的3,50和75μ分别g / mL。20.μ我准备的解决方案被注入色谱系统。标准校准曲线是由策划相应峰面积与浓度。
2.4.2。人类的尿液
校准标准准备空白人类尿液浓度的0.25,0.5,1.0,10、20、25μg / mL, 0.5、1.0、10、20、25μTMZ g / mL, ATN分别。低,地中海,和高质量控制(QC)样本准备在浓度为0.5,10和20μTMZ和1.0 g / mL, 10和20μATN的g / mL。样本存储在-20°C,提取如下所述,校准曲线是由绘制峰面积与浓度。
2.5。制备制药平板电脑工作的解决方案
2.5.1。Metacardia®平板电脑
五片重、地面和混合。准确称重的平板电脑相当于50毫克粉曲美他嗪和50毫升甲醇提取,用30分钟。解决方案是过滤和随后的稀释水HPLC-PDA分析。
2.5.2。Blokium®平板电脑
五片重、地面和混合在一起。准确称重的粉平板电脑相当于50毫克的阿替洛尔和50毫升甲醇提取,用30分钟。溶液过滤,滤液随后稀释用水进行高效液相色谱分析。
2.6。人体尿液样品制备
人类尿液样本在室温下解冻和混合。每个样本转移到2.0毫升整除的螺旋盖子文化管,0.5毫升1.0 N的氢氧化钠是补充道,和管涡混合,持续30秒。样本提取通过添加6.0毫升(4:1)氯仿:正丁醇,v / v;样本涡混合10分钟。在3000转离心10分钟后,有机层转移到干净的下管和蒸发干燥氮气流大约在40°C。残留物被重组为0.5毫升甲醇,涡混合。一个20μ最终提取的L是注入高效液相色谱系统。
2.7。色谱检测条件
2.7.1。整洁的标准解决方案和制药的平板电脑
进行色谱分离Caltrex BI(125×4.0毫米,5μ米)列。流动相是25毫米正磷酸盐调整pH值3.3与磷酸二氢钾,流动相B是甲醇、乙腈和流动相C。autosampler清洗解决方案是甲醇。梯度法在1.0毫升/分钟的流量,列温度维持在RT,总运行时间是10。0分钟。梯度洗脱是如下:0 - 1分钟10% B和0% C, B 1.1分钟20%和0% C, B 4.0分钟15%和15% C, B 4.1分钟20%和20% C, B 8.0分钟80%和0% C, B -10.0和8.1分钟10%和0% C .光电二极管阵列检测器(PDA)是在210年和225 nm曲美他嗪和阿替洛尔,分别。
2.7.2。尿液样本
相同条件下如上所述申请目标分析物的分析在尿液样本除了以下:梯度是0 - 2.0分钟10% B和0% C, B 2.1分钟20%和0% C, B 5.0分钟15%和15% C, B 5.1分钟20%和20% C, B和C 0% 5.1 - -8.0分钟80%,8.0 - -11.0分钟B和C的0%,90%和11.1 B -13.0分钟10%和0% C运行时间为13.0分钟。
3所示。结果和讨论
3.1。方法开发
目标分析物具有不同的吸收特征,因此选择210和225海里TMZ和ATN的检测,分别。所有色谱参数完全优化来实现最佳的色谱分离。甲醇和乙腈进行有机修饰符在不同的比例使用权力平等主义的和梯度洗脱;甲醇显示更高的灵敏度,但与分析物的峰形状不对称。梯度洗脱使用甲醇和乙腈(如上所述)显示优秀的对称峰分析物的形状。增加缓冲修饰符(使用不同的流动相缓冲)和流动相pH值的影响(pH值3 - 5)研究了峰的形状,洗脱时间和灵敏度。低pH值流动相显示快速洗脱;然而,pH值5晚些时候时展示了这些分析物洗脱。25毫米磷酸盐缓冲剂,pH值3.3,发现最合适的缓冲修饰符,在合理的洗脱时间提供好看的山峰。流量范围从0.5到1.0 mL / min进行了测试。 It was found that 1.0 mL/min was optimum for good chromatographic separation in a reasonable time without interference from either pharmaceutical preparation placebo components or biological fluid endogenous peaks. Different gradient programs have been applied; peak symmetry, resolution, selectivity, and number of theoretical plates were calculated in each case and summarized in Table1。图2显示了一个典型的色谱实验室准备混合物的研究药物在优化的色谱条件下。阿替洛尔和曲美他嗪的保留时间为3.72和4.3分钟,分别。由于生物流体提取的本质和存在内生提取组件,梯度稍微修改了尿液样本分析。不再脱盐一步很高比例的水流动相极性组件的应用,以确保完全删除之前洗脱的目标分析物。同时,列洗步骤使用高有机流动相比例扩展为了洗提任何内源性矩阵组件的最终提取并避免任何coelution迟洗脱峰与目标分析物在随后的注射。图3代表了色谱分析物的尿液样本显示,ATN TMZ筛选了在4.32和5.8分钟,分别和图4显示没有干扰的空白尿液色谱洗脱的时候我们的分析物。
液液萃取使用有机溶剂已被证明提供清洁提取生物液体样品;它也被认为是更便宜的样品处理方法。不同的有机溶剂(二氯甲烷、氯仿、正己烷:乙酸乙酯(1:1,v / v)和氯仿:正丁醇(4:1,v / v))已经评估了提取的复苏。发现4:1氯仿:正丁醇,v / v,不仅提供了两种分析物的最高提取复苏也消除了干扰内源性矩阵的组件。pH值的样本被强烈影响不同化合物的电离,随后影响分析物的提取的部分有机层;酸性和碱性条件下用1.0 N盐酸和1.0 N氢氧化钠,分别和矩阵样本没有任何pH值优化(用水)相比而言,提取复苏,最终提取的清洁。两个基本目标药物化合物(ATN的PKa 9.6和9.1436]和TMZ [37),分别);他们提取复苏显著提高通过提高样本与氢氧化钠溶液的pH值。不同量的1.0 N氢氧化钠进行测试;一个500μl整除1.0 N氢氧化钠提供最好的提取回收率。提取回收率是45%和100%对ATN和TMZ,分别对不同层次对分析物都是一致的。
系统适用性等参数分辨率(Rs),拖尾因子(T),容量因子(K)和选择性因子(α根据USP(计算)2如表所示2。决议总是超过1.5,选择性是不止一个,对称因素有一个接受的价值。
线性。峰面积响应绘制与相应的浓度。线性浓度范围获得的1.0 -100μg / mL在纯形式分析物和浓度范围(0.25 -25)μ0.5 g / mL和(-25)μ克/毫升尿液样本曲美他嗪和阿替洛尔,分别。相关系数≥0.999,如表所示1。
极限检测和定量的极限。检测极限(LOD)是最低浓度的分析物能被探测到。定量的极限(定量限)是可以定量测量的浓度最低可接受的精密度和准确度。建立了LOD的最低浓度提供了一个信噪比(S / N) 3:1的比例,建立了定量限浓度最低,提供S / N的比例10:1(表中给出1)。
为纯形式方法统计分析。该方法是官方和报告方法相比1,38)使用学生的统计t以及野生和方差比率在95%置信水平。计算t和F值没有超过理论价值。该方法之间没有显著差异和官方或报道的观察(表中给出3)。
精密度和准确度。国米,盘中精度(测量的相对标准偏差百分比,%相对标准偏差)和国米,盘中精度(测量从名义浓度差异百分比,% DFN)测定在低,中,高质量的水平。良好的精密度和准确度均获得纯形式的分析物和尿液样本(表4和5)。
选择性。选择性的能力分析方法确定目标化合物的其他组件等辅料,降解产物,coadministered药物,和/或内源性干扰矩阵组件。该方法显示出优秀的色谱分离和定量引用药物的常见的平板辅料和尿液中提取矩阵。在预期的保留时间没有明显的峰值检测的两个引用药物,并没有与任何其他组件coelution可能出现在最终的提取。
鲁棒性。小实验参数应用的变化以及这些变化对分析性能的影响被评估,以确保该方法的鲁棒性。研究了参数如下:磷酸盐缓冲pH值(3.3±0.2),流量毫升/分钟(1.0±0.01),和波长210 nm±1.0和225海里±1.0 TMZ ATN,分别。只改变一个参数在时间和其他人保持不变。拟议中的变化对保留时间的影响,峰面积、尾矿的因素,和理论板数进行了评估。研究发现所有的小变化对方法性能无显著影响。
应用程序
制药平板电脑。优化成功应用高效液相色谱法(HPLC)测定研究药物的相应的平板电脑。好比例恢复没有任何辅料干扰了(表6);该方法可以适用于质量控制研究。
4所示。结论
rp与PDA检测方法是测定阿替洛尔和曲美他嗪的纯粹形式,制药平板电脑,和人类的尿液。该方法被发现简单、灵敏、准确。优化色谱分离条件允许研究药物的合理的时间没有任何辅料和/或干扰矩阵中提取组件。这种方法可以用于治疗药物监测的患者接受ATN和TMZ与此同时也可以申请的质量控制分析研究药物在制药平板电脑。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。