文摘

抗组胺药被广泛用来减轻过敏反应引起的症状。这些药物zwitterionicas和/或两性特征,它赋予额外的分析挑战。这项工作旨在发展一个环保和高效色谱分析方法7抗组胺药,即azelastine HCl、地氯雷他定,ebastine,盐酸盐酸非索非那定,酮替芬、盐酸氯雷他定,olopatadine。分离得到使用RP C-18 LUNA (150 x4.6mm, 5μ米)列。流动相由乙腈和水酸化(pH值2.1)以下比例:15:85,v / v地氯雷他定,25:75,v / v酮替芬和olopatadine 32:68, v / v的盐酸非索非那定,35:65,v / v azelastine和氯雷他定,v / v ebastine 45:55。所有分离得到小于7.0分钟。充分验证和原型方法应用于测定鼻azelastine HCl的解决方案。拟议的方法分析七高效抗组胺药,选择性和敏感。此外,所有的方法都可以被认为是优秀的绿色,总有机残留物< 2.5 mL /分析。一种改进的梯度法也称azelastine HCl及其相关杂质的分离。

1。介绍

据估计,大约4亿人受到过敏性鼻炎哮喘和3亿年的世界。在巴西,30 - 35%的人口提供了某种类型的过敏反应如过敏性鼻炎、哮喘、过敏性皮炎。总医疗费用超过9800万每年的第三个原因是住院治疗和住院治疗。这些开销超过结核病和艾滋病(1- - - - - -3]。

第二代抗组胺药被认为是作为一线治疗过敏性疾病和不引起嗜睡和抗胆碱能作用。改进的有效性,减少副作用,药物依从性显著的现代抗组胺剂药物可以归因于低亲油性和降低了大脑H1受体的亲和力4- - - - - -6]。

这项研究的第二代抗组胺剂药物选择哌啶除了azelastine (methylazepane导数)和olopatadine (dibenz [b, e] oxepin导数)。化学名称、分子结构和离解常数的azelastine盐酸(AZE)、地氯雷他定(DESl) ebastine (EB)、盐酸盐酸非索非那定(FEX),酮替芬(刃),氯雷他定(卤),盐酸和olopatadine(卡)中所描述的表1。

几种高效液相色谱方法定量测定的科学文献中发现了第二代抗组胺药,为一个单一的药物(不是引用)。英国药典描述专著AZE (7],DESL [8],EB [9],FEX [10),尿酮体(11),和卤11]在美国药典包含专著AZE (12],DESL [13,不要生气14),和阿尔卡15]。引用专著还描述分离方法各自的有机杂质。大多数这些方法费时,往往呈现峰值跟踪,利用缓冲盐,并生成大量的有机废物。

美国药典描述azelastine及其相关化合物的色谱分离方法B, D和E [12]。分离得到的含氰基的高效液相色谱柱组成的流动相乙腈,单碱的磷酸钾,和octanesulfonic酸钠盐。流量为2.0毫升分钟⁻¹和检测是在210海里。相邻峰之间的系统适用性解析≥1.5除杂质B和D (≥4.0)。

英国药典(7)和欧洲药典(16]也描述几乎相同的方法azelastine及其相关化合物的分离,B, C, D, E。

在上面的案例中,分离得到一个非传统列与腈组织化学结合多孔二氧化硅粒子与流动相组成的缓冲和离子配对盐。此外,流量太大,估计总运行时间超过15分钟。

据我们所知,没有发现环保高效液相色谱方法分离七第二代抗组胺药,与流动相有机小修改内容。

本研究旨在开发一个色谱7抗组胺剂药物制药配方的设置进行分析。我们打算提出高效、准确的高效液相色谱方法,遵守绿色分析化学(GAC)原则。此外,stability-indicating方法开发azelastine和三个相关杂质的分离。

2。实验

2.1。试剂、样品和标准

注册药品二级标准(纯度≥98%)azelastine HCl、地氯雷他定,ebastine,盐酸盐酸非索非那定,酮替芬、盐酸氯雷他定,olopatadine获得Sigma-Aldrich(美国圣路易斯,MA)。

azelastine杂质B (1-benzoyl-2 - [(4RS)1-methylhexahydro-1H-azepin-4-yl] diazane), azelastine杂质D (4 - (4-Chlorobenzyl phthalazin-1 (2)H)——)和azelastine杂质E (3 - (4-chlorobenzilidene isobenzofuran-1 (3)H)——)是来自欧洲药典(EP)参考标准Sigma-Aldrich(美国圣路易斯,MA)。

高效液相色谱级乙腈和分析年级盐酸(37%)来自默克公司(达姆施塔特,德国)。纯净水是获得微孔Milli-Q®+(美国布拉德福德微孔)。

鼻的解决方案包含0.9毫克毫升⁻¹azelastine是来自当地的药房。的Rino-Lastin®(疼痛制药实验室、巴西)制定规定包含以下辅料:苯扎氯铵、柠檬酸、山梨糖醇,hypromellose,纯化水、钠二水合物,和磷酸氢二钠水氯化亚锡。

2.2。仪器及色谱条件

高效液相色谱系统由两个溶剂输送泵,一个自我注射器配备20μL循环、在线脱气系统、列恒温烤箱,和UV / VIS光电二极管阵列检测器。输出信号的监测和综合使用类副总裁®软件(日本岛津公司公司(日本)。

分析条件的优化使用Luna-RP C18柱(250 x4.6毫米,5μ米),建立了流动相乙腈和水酸化(pH值2.1)以下比例:15:85,v / v DESL 25:75, v / v刃和卡蒂32:68,v / v FEX 35:65, v / v AZE和生气,对EB和45:55,v / v。流动相流速为1.1毫升/分钟,和紫外检测在220 nm (FEX), 254海里(EB)、271 nm(卤),279海里(DESL), 287海里(AZE),和298海里(刃和阿尔卡)。注入的体积是固定在20μl

所有的分析都是在室温下,列温度控制在25°C±1。流动相是准备新鲜的每一天,vacuum-filtered通过0.45μ米微孔®(高压)亲水膜。

2.3。制备的标准解决方案

azelastine HCl参考标准的股票的解决方案是由传输质量相当于25毫克的azelastine 25毫升容量瓶。体积与流动相获得1000年竣工μ克毫升¹azelastine标准储备溶液。杂质的B、D和E, 5毫克质量是可溶性5毫升的流动相,在单独的烧瓶。所有后续稀释是用流动相来获取目标浓度分析和验证方法。

FEX DESL的股票的解决方案,EB,尿酮体,特和卡蒂参考标准准备同样的,获得1000年μ克毫升¹每个引用的标准,在不同的烧瓶。

2.4。准备样本股票的解决方案

五AZE鼻制剂(声称0.9毫克mL的解决方案⁻¹AZE)都汇集到一个烧瓶。的整除相当于10毫克AZE被转移到一家50毫升容量瓶。体积与流动相获得200.0完成μ克毫升⁻¹AZE。超声波水浴用于5分钟,帮助提取和溶解。合成样本股票的解决方案被稀释,用于确定该方法的精密度和准确度。

2.5。系统适用性

根据官方指南,系统适用性测试方法开发[不可分割的一部分20.- - - - - -22]。一旦得到了最佳色谱条件,系统的七个抗组胺剂药物进行色谱分析。我们评估产能因素,保留因素、可重复性、峰值不对称,理论板数。在这个过程中,最合适的色谱条件,与可接受的相对标准偏差(RSD), 7抗组胺药,分别。

2.6。验证的原型HPLC-UV Azelastine HCl的方法

拟议的方法来演示adequateness 7抗组胺剂药物,azelastine HCl被选为原型药物。该方法根据国际准则完全验证验证的色谱制药药物产品和方法应用于分析AZE鼻解决方案(21- - - - - -24]。

该方法的选择性是评估通过分析的参考标准,样本,安慰剂的解决方案。此外,获得的色谱峰纯度指数被紫外二极管阵列检测器进行访问。

线性。平均峰面积(n = 3)策划针对各自的浓度范围从10.0到60.0μ克毫升⁻¹AZE。曲线的线性回归是访问的最小二乘法,在五个不同浓度水平。所有的解决方案都准备新鲜,稀释用流动相(pH = 2.1)。 在哪里峰面积;浓度;曲线的斜率,是拦截的曲线在轴上。

精度。内部和interday精度(重复性)被重复评估分析样品的解决方案(n = 10)。包含大约40.0新鲜样品的解决方案μ克毫升⁻¹AZE进行分析,另外,连续三天。表示为系统的内部,interday精度相对标准偏差(RSD)在分析反应(21,22]。

精度。精度是由复苏的标准样本矩阵。AZE示例解决方案上升与已知的标准解决方案,三个浓度水平,在单独的烧瓶。结果强化方法示例解决方案进行了分析。经济复苏(R)是通过比较理论计算量,发现大量的AZE标准(23]。

检出限(DL)和定量限制(QL)。DL和QL估计基于均值标准差和AZE校准曲线的斜率。DL的估算值(3 *信号/噪声比)和QL(10倍信号/噪声比)被反复核对实际分析的标准解决方案。

鲁棒性。该方法的鲁棒性是故意修改评价的色谱条件如有机质含量、流动相pH值和流量。这些变化的影响在AZE峰面积,保留时间( ),和拖尾因子( )进行了分析。被修改的色谱条件,单独和独立。AZE示例解决方案注入系统(n = 3)单变量条件下,结果进行统计分析。

3所示。结果与讨论

第三代抗组胺药物的发现带来了额外的分析挑战,除了治疗的好处。然而,有限的信息相关的杂质及其可能的人类cardiotoxic效果和药代动力学和长时间的药效学资料(25,26]。

第三代H1抗组胺药具有典型特征的分子结构。取决于介质的pH值,他们常常相反电荷电中性是由于在不同的不相邻原子和/或两性由于酸的存在和基本组织他们的分子结构17,27]。由于这些药物的两性离子和/或两性特征,他们经常出现额外的分析挑战,如过度的保留和峰值尾矿由于二级与固定相的交互28- - - - - -31日]。这些药物的溶解度低,在反相模式中,经常在色谱分离产生不利影响。

除了这些重要方面,有必要不断寻求快速和替代方法,提高工作效率,减少了溶剂,和样品消耗。大部分的溶剂用于液相色谱分析师危险和环境是由于固有的波动性,可燃性、毒性的溶剂(18]。高灵敏度是可取的,广汽与跟踪方法欢迎大量的有机废物(18,27,31日- - - - - -33]。

3.1。方法开发和优化

我们测试了一些反相列,如传统的C18和核壳技术使用C18固定相,此外,c8 - cn, - nh2列。初步获得的色谱参数与RP C-18 LUNA (250 x4.6mm, 5μ米列是令人满意的。这一列被选中为优化色谱分离条件七抗组胺剂药物和系统适用性测试。

乙腈的分离获得,作为有机相修饰符,都比同甲醇。整齐对称和峰值强度与乙腈可以归因于抗组胺剂药物的溶解度在乙腈(17]。

根据文献中描述的pH值依赖的溶解度曲线(17)和实验室实验工作,所有七个抗组胺剂药物的溶解度显著改善酸性媒体(离子形式)。例如,AZE适度溶于水是中性pH值(0.5毫克毫升⁻¹);但是在pH值1.7的值可能达到381.9毫克毫升⁻¹(17]。同样,显著改善DESL的溶解度,EB, FEX,刃,卤,卡被发现在pH值≤2.0。

提高柱效率和避免高峰尾矿在色谱运行期间,在反相模式下,必须保证一个离子形成的分子(29日,31日]。AZE的离解常数,DESL、EB FEX,尿酮体,特和卡蒂描述表1(17]。与pH值2.1是流动相选择,以确保几乎完全电离形式(更多的极地约旦种)以抗组胺药,在色谱运行。此外,选中的pH值可能促进药物增溶和传质色谱交互期间选择的抗组胺剂药物,在反相模式。

最后,大部分的商业反向阶段列是稳定在pH值在2.0和8.0之间。因此,流动相乙腈和水酸化(pH值2.1)组成的被选作进一步的方法开发和优化的色谱条件。

3.2。系统适用性试验

七个抗组胺剂药物选择研究结构相关,属于同一治疗类;然而色谱与列是不同的。开发一个独特的环保方法,流动相有机质含量等因素,优化流量,注入量为7抗组胺剂药物通过单变量实验设计方法。

AZE的最佳条件,DESL、EB FEX,尿酮体,特和阿尔卡固定基于方法的灵敏度(峰面积)、效率(理论板块),不对称因素(如),和快速洗脱(保留因子)。简单地说,是准备(200标准参考解决方案μ克毫升⁻¹)分别注入系统。流动相的有机成分进行优化快速洗脱的抗组胺药,分别。在以下步骤中,流动相流速调整(0.8,0.9,1.0,1.1,和1.2 mL.min⁻¹)。注入体积的影响,流动相流速峰值区域和不对称数据所示1- - - - - -4。最后,注入体积进行优化(2、5、10和20μL)。完全AZE优化条件,DESL, EB, FEX,刃,卤,卡蒂展示在表2。

AZE检测波长,DESL、EB FEX,尿酮体,特和卡蒂选择基于DAD检测器,和列温度维持在25°C±1。

数据5- - - - - -11显示AZE代表色谱、DESL EB, FEX,刃,卤,卡蒂。所有分离得到使用RP C-18 LUNA (150 x4.6mm, 5μ米)列。流动相由乙腈和水酸化(pH值2.1)以下比例:15:85,v / v地氯雷他定,25:75,v / v酮替芬和olopatadine 32:68, v / v的盐酸非索非那定,35:65,v / v azelastine和氯雷他定,v / v ebastine 45:55。流量为1.0毫升分钟⁻¹和紫外检测在220 nm (FEX), 254海里(EB)、271 nm(卤),279海里(DESL), 287海里(AZE),和298海里(刃和阿尔卡)。

3.3。绿色评价的方法

如前所述,7抗组胺剂药物更好的分离与乙腈与其他有机溶剂相比测试。因此,我们估计的绿色广汽原则基础上提出方法,描述在文献[18,19,32,34]。一种半定量的eco-scale被用来评估提出的绿色方法。十二广汽的原则,致力于分析方法五个关键参数和点球点被分配用于每个不利因素。表3显示了提出方法eco-scale总分数。自从eco-scale值大于75,提出的方法可以被认为是优秀的绿色(18,19]。

3.4。方法验证AZE

选择性。AZE鼻的辅料解决方案不干涉主峰。此外,色谱峰纯度指数AZE标准和样品的解决方案基于光电二极管阵列检测器进行评估。三峰纯度指数AZE参考标准和样品的解决方案都是相同的(≥0.99)。结果支持该方法的特异性。

线性。该方法被发现线性浓度范围从10.0到60.0μg.mL¹AZE。AZE浓度之间存在线性相关性,相应的峰面积(R2 = 0.9960);除了残差的标准差为1.4%。相关数据提出了提出方法的线性表4。

精度。方法精度是访问的可重复性(当天)和中间精密度(interday)测试。(40.0 AZE示例解决方案μ克毫升⁻¹)准备的新鲜和注入系统(n = 10),连续三天。表5显示发现数量有各自的变化(RSD)。RSD在结果低于2%。结果显示良好的AZE精密测定(23,24,35]。

经济复苏的方法访问三个浓度水平(低,中间,和高)。表6显示可接受的复苏azelastine样本矩阵的参考标准。结果表明,该方法具有较高的精度(23]。

检测和定量的限制。DL和QL的预计值分别为1.10和3.32μ克毫升⁻¹分别为(表4)。QL反复核对了实际分析标准溶液相当于3.3μ克毫升⁻¹(n = 3)。下面的RSD为1.62%,远低于推荐值(21,24,35]。

AZE方法的鲁棒性分析是评估故意改变流动相流速(0.9,1.0,和1.1毫升毫升⁻¹),注入体积(18、20和22 ul)和流动相的有机内容(ACN 33、35 e 37%)。有一个微不足道的影响峰值保持,峰面积和峰值不对称(数字1- - - - - -4)。

4所示。色谱方法分离Azelastine杂质

azelastine的色谱分离和杂质B, D, E是获得使用卢娜C18柱(150×4.6毫米x 5μ米),流动相是由解决方案(ACN 0.1%甲酸)和解决方案B与0.1%甲酸(纯化水)。梯度系统25 - 75%的解决方案在15分钟。流动相流速保持不变在1.0毫升分钟⁻¹在228纳米和紫外检测。注入的体积是固定在20μl分析都是在室温下完成,列温度控制在25°C±1。

AZE的最佳条件及相关杂质B, D和E是基于官方系统适用性参数固定,峰值不对称< 2.0,峰决议> 2.0 [7,12,21]。AZE鼻解决方案示例(250μ克毫升⁻¹)就被掺入了AZE杂质B, D和E (10μ克毫升⁻¹,每个)和注入系统。

描述的系统适用性参数表7,代表的色谱分离AZE和相关杂质B, D, E是呈现在图12。

方法的选择性访问峰纯度(> 0.99)和相对保留(k)杂质B (-0.35), AZE B(0.43),杂质D(3.04),和杂质E(5.04)标准的解决方案,分别。

系统适用性等参数峰决议相邻峰,峰对称性是根据规范中描述azelastine及其相关杂质的分离官方纲要(7,12,16]。

5。结论

提出生态正确方法可能造成七抗组胺剂药物的高通量分析,总有机残留物< 2.5 mL /分析。azelastine分离的方法和相关的有机杂质B, D, E是高效和经济。总时间是15分钟,分析流动相离子配对的是免费的代理和缓冲盐。所有分离得到传统的反相高效液相色谱系统和可以被认为是优秀的绿色。提出的方法可能补贴的评价质量、抗组胺剂药物的疗效和安全性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的圣保罗研究基金会(FAPESP)必须占州政府,巴西,在批准号2015/11210-1。