同时量化Brigatinib和Brigatinib-Analog在大鼠血浆和脑匀浆质/女士:应用程序比较药代动力学和大脑分布研究

文摘

Brigatinib和brigatinib-analog有效和选择性筛选抑制剂类似的结构。一个简单的和敏感的高性能液相色谱串联质谱法同时测定的(质/ MS)方法brigatinib brigatinib-analog在大鼠血浆和脑匀浆的开发和验证。在ODS柱色谱进行分离与乙腈和0.1%的甲酸水为流动相,梯度洗脱流速为0.5毫升/分钟。检测进行使用TSQ量子超质谱检测器与电喷雾电离(ESI)接口,在正离子模式下操作。使用了一个简单蛋白质沉淀制备过程。量化的下限(LLOQs) 1.0 ng / mL和0.5 ng / mL分析物在大鼠血浆和脑匀浆,分别。intrabatch和蛾区精密度和准确度brigatinib和brigatinib-analog变异的可接受范围内。简单的和敏感的质/ MS方法已成功应用于药代动力学和大脑分布研究单一口服后brigatinib brigatinib-analog老鼠。上述研究将为进一步的应用打下良好的基础brigatinib和brigatinib-analog。

1。介绍

肺癌是最常见的诊断全球肿瘤发病率和死亡率高(1),其发病率和死亡率继续增长。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC),其中非小细胞肺癌占肺癌的85%,包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌2,3]。SCLC仅占15%。与SCLC相比,非小细胞肺癌有较慢的转移和扩散。大约75%的非小细胞肺癌患者被发现是在中、晚期,和5年存活率非常低(4,5]。

分子研究近十年的发展意味着重大突破的诊断、检测和治疗非小细胞肺癌的肺癌。间变性淋巴瘤激酶(碱性),胰岛素受体家族的受体酪氨酸激酶,最初被确定为融合蛋白的一部分nucleophosmin-anaplastic淋巴瘤激酶(NPM-ALK)。碱之间的基因重排和棘皮动物microtubule-associated蛋白质像4 (EML4)变得更普遍比碱性基因重排,不超过5%的晚期非小细胞肺癌。最终产品的本构激酶活性致癌性(针对有eml4 - alk)代表的增长ALK-rearranged (ALK-positive)非小细胞肺癌6- - - - - -8]。

作为第二代筛选抑制剂,brigatinib (AP26113), FDA批准2017年4月,是一个高度选择性和高效筛选抑制剂治疗ALK-positive转移性非小细胞肺癌患者,可以克服了crizotinib抵抗第一代筛选抑制剂,特别是L1196M看门人突变(9,10]。Brigatinib-analog (AP26113-analog ALK-IN-1)是一种口服有效,有效和选择性筛选,表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂与brigatinib相似的结构。Brigatinib-analog结合,抑制碱性激酶和筛选融合蛋白和表皮生长因子受体突变形式。这导致碱性激酶和EGFR激酶的抑制,最终扰乱了他们的信号通路,抑制肿瘤细胞生长在敏感肿瘤细胞(3,11]。

据报道,brigatinib和brigatinib-analog有类似效力的三重突变IC50值< 100海里。此外,brigatinib和brigatinib-analog发挥治疗作用的脑转移由于能力到达中枢神经系统(CNS)通过血脑屏障12,13]。

我们所知,只有几项研究报告确定的浓度brigatinib在血浆和组织14,15),这是第一个研究报道brigatinib和brigatinib-analog的同时测定大鼠血浆和脑匀浆使用质/ MS方法。作为这项研究的主要目的,一个敏感、可靠和简单的质/女士同时量化的方法建立和验证brigatinib和brigatinib-analog在大鼠血浆和脑匀浆。同时,该方法成功地应用于药代动力学和大脑分布研究brigatinib和brigatinib-analog单一口服后老鼠。本研究将为进一步的应用提供基础brigatinib brigatinib-analog。

2。材料和方法

2.1。试剂和化学物质

Brigatinib (AP26113,中科院:1197953-54-0,99%纯度),brigatinib-analog (AP26113-analog ALK-IN-1, CAS: 1197958-12-5, 99%的纯度),和osimertinib (CAS: 1421373-65-0, 98%的纯度)请研究所提供的药物学,山东第一医科大学和山东医学科学院(济南,中国)。HPLC-grade甲醇是来自Tedia(费尔菲尔德,美国),和乙腈,高效液相色谱的年级,是由费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。HPLC-grade甲酸购买从大茂化学试剂厂(天津)。所有其他化学试剂均为分析级或更好。

2.2。仪器和质/ MS条件

分析收购TSQ量子超质谱检测器与电喷雾电离(ESI)接口(美国热科学),加上Dionex最终3000年超高效液相色谱系统组成的一个液化石油气- 3400 sdn泵、wps - 3000 tsl autosampler和苑- 3000 rs柱室。样品在一个反相分离Inertsil ODS-3列(50毫米×4.6毫米ID, 5μ米粒子大小、GL科学Inc .)在25°C和筛选了一个梯度流动相的水(包含0.1%甲酸)和乙腈的流量0.5 mL / min。连续程序如下:15%乙腈其次是线性增加到20%乙腈在0.2分钟期间,紧随其后的是一个线性梯度洗脱20%到50%的乙腈从0.2到1.9分钟,最后回到15%乙腈在0.01分钟,re-equilibrated起始条件,直到3分钟。保留时间是2.07,2.18,和2.40分钟,brigatinib brigatinib-analog,分别是,。

收购了使用选择反应监测(SRM)转换的质子化了的前体离子[M + H]⁺特定的女儿离子量化每个化合物。SRM条件定义如下:喷涂电压3500 V,蒸发器温度250°C,鞘气压35 arb,辅助气体压力10 arb,毛细管温度350°C。的SRM模式m / z584.26⟶484.08 [M + H]⁺brigatinib,m / z529.05⟶483.92 [M + H]⁺brigatinib-analog,m / z500.24⟶71.89 [M + H]⁺是在积极的电离模式被用作定量分析(图1)。所有的数据都是收购和加工使用Xcalibur软件(美国热科学)。

2.3。制备的标准解决方案,校准样品,和质量控制样品

主要股票的标准解决方案brigatinib和brigatinib-analog准备分别用作标准和质量控制(QC) 10.0毫克/毫升的浓度和乙醇混合量相等。混合标准溶液与甲醇进一步连续稀释。是股票的标准溶液制备与二甲亚砜(DMSO) 1.0毫克/毫升的浓度,进一步用甲醇稀释至1000 ng / mL。所有标准的解决方案是使用前保持在4°C。

校准标准包含brigatinib和brigatinib-analog被飙升准备适量的标准解决方案鼠空白血浆或脑匀浆(1:99年,v / v)。7个水平校准曲线的测定(n= 5)。

计算的校准方程最小二乘线性回归方法。最后在等离子体浓度分别为1.0,4.0,20日,80年,500年、1000年和2000年为brigatinib和brigatinib-analog ng / mL。质量控制(QC)样本同样准备空白血浆和最后的浓度分别为1.0,2.0,400和1600 ng / mL。最后在大脑中匀浆浓度分别为0.5,2.0,10日,40岁,250年、500年和1000年为brigatinib和brigatinib-analog ng / mL。QC样品的浓度都是0.5,1.0,200和800 ng / mL。所有的飙升样本处理按照biosample准备过程。

2.4。Biosample准备

30μL(鼠biosample(等离子体或脑匀浆)是100年混合μ和150 L的解决方案μL甲醇对蛋白质沉淀。然后,混合物是vortex-mixed 1分钟和离心机在4°C 14000 rpm为10分钟。离心后,上清液小心地分离,和10μL整除注入到质/ MS系统进行分析。

2.5。方法验证

验证程序的开发方法进行了根据美国食品和药物管理局(FDA)生物分析方法验证指南关于选择性,灵敏度,线性度,intrabatch蛾区精密度和准确度,复苏,基体效应,稳定,结转16]。

2.6。应用于药代动力学和大脑分布研究

七十二名男性的雄性sd大鼠中重180 - 220克(7 - 8周大,没有证书。SCXK(山东),2014 - 0007年)由山东实验动物中心,山东第一医科大学和山东医学科学院。所有塑料老鼠被关在笼子里12 h昼/夜循环温度控制(第23 - 25°C)和美联储与标准实验室老鼠的饮食和水随意。所有的动物福利和动物伦理委员会批准的实验过程研究所的药物学,山东第一医科大学和山东医学科学院(济南,中国),严格按照指导的护理和使用实验动物(美国国家研究委员会,1996)。

禁食后的药代动力学研究,用免费水至少12 h,十二大鼠随机分为两组(n= 6)。brigatinib和brigatinib-analog都溶解在乙醇- 0.5%甲基纤维素(1:19)剂量。两组老鼠intragastrically管理与brigatinib brigatinib-analog在同一剂量的5毫克/公斤,分别。

血液样本,大约100μL的,被安置在肝素化埃普多夫管初始剂量5,15日,30日,60岁,120,180,240,300,360,480,720,1440分钟postdose颈静脉的老鼠。血样立即离心机在3500 rpm 15分钟在4°C,和血浆样本被小心翼翼地从每个收集和储存在−20°C到分析(17,18]。

对大脑分布研究,剩下的六十老鼠被随机分成十组(n= 6,每组)。brigatinib的分布和brigatinib-analog在老鼠大脑也调查了5毫克/公斤的剂量单一口服后老鼠。整个大脑在5立即删除,60岁,240年,480年和1440分钟postdose,与0.9%生理盐水彻底冲洗,用滤纸擦。每个大脑样本重量准确、均相双蒸馏水(1:5 w / v)通过组织均质器(德国IKA)和冻结在−20°C到分析(19]。

2.7。数据分析

实验数据被表示为平均值±标准偏差(SD)。2.0药物和统计2.0 (DAS)软件包(数学药理学专业委员会,中国,上海,中国)是用于估计药代动力学和大脑noncompartmental分布参数的方法。统计分析与IBM SPSS统计软件进行统计20.0(美国、IBM公司,纽约Armonk)。两组之间的差异进行评估的t以及。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。质条件的优化

3.1.1。质谱

分析物和被发现最好的回应正离子化的加合物离子[M + H]⁺,提出了主要的山峰。他们的产品离子质谱图所示1。SRM模式被用来监视的转换m / z584.26⟶brigatinib 484.08,m / zbrigatinib-analog 529.05⟶483.92,m / z500.24⟶71.89。

3.1.2。液相色谱法

在选择质/ MS的流动相体系,是注意的影响流动相的色谱保留和女士的反应。甲酸改性剂可以提高离子化效率。不同浓度的甲酸含量为0.05%,0.1%和0.2%的水部分移动检查阶段。结果表明,添加0.1%的甲酸溶液部分足以实现brigatinib的最高灵敏度女士,brigatinib-analog,。大量的初步实验已经完成之后,它发现一个Inertsil ODS-3列(50毫米×4.6毫米ID, 5μ米颗粒大小)产生最好的两种化合物的分离。水的流动相组成(包含0.1%甲酸)和乙腈与梯度洗脱,这是用于缩小高峰和提高分析物的决议,是色谱法和卖空的运行时间。

此外,由于复杂的大鼠血浆和脑匀浆的性质,biosample是一个重大步骤的预处理去除蛋白质质/ MS分析之前和潜在的干扰。提取条件,包括蛋白质沉淀,液液萃取和固相萃取研究。特异性、灵敏度、稳定性和准确性的蛋白质沉淀,需要更少的时间和减少的成本分析,可以满足研究的要求。

3.2。方法验证

3.2.1之上。选择性

六个不同批次的空白biosample从六个不同的来源获得准备。没有干扰内源性物质的血浆和脑匀浆中观察到或分析物的保留区域(图2和补充材料图1)。

3.2.2。线性和LLOQ

校准曲线是通过绘图分析物的峰面积比值与相应浓度的分析物刚做好的老鼠biomatrix校准器。线性回归方程brigatinib和brigatinib-analog鼠血浆y= 5.65×10⁻⁴x+ 2.81×10⁻⁴和y= 5.21×10⁻⁴x+ 5.78×10⁻⁴,分别。平均相关系数(r²)的校准曲线均> 0.99浓度范围从1.0到2000 ng / mL的权重因子1 /x²。线性回归方程brigatinib和brigatinib-analog在老鼠脑匀浆浓度范围从0.5到1000 ng / mL的权重因子1 /x²是y= 7.43×10⁻⁴x−2.23×10⁻⁴(r²= 0.9904)和y= 6.51×10⁻⁴x+ 2.33×10⁻⁴(r²分别为= 0.9919)。量化的下限(LLOQs) brigatinib和brigatinib-analog都发现在大鼠血浆1.0 ng / mL,他们在老鼠脑匀浆0.5 ng / mL。

3.2.3。精密度和准确度

四个不同的质量控制水平被用来评估intrabatch蛾区精密度和准确度brigatinib和brigatinib-analog在大鼠血浆和脑匀浆通过分析六个复制的质量控制水平在三个不同批次使用独立准备校准曲线。所有浓度的测定值低于15% (< 20% LLOQ)和符合公认的变量限制,这证明了量化的方法是可靠的和可再生的brigatinib brigatinib-analog在大鼠血浆和脑匀浆(表1)。

3.2.4。提取复苏和基体效应

分析物的反应从低、中、高QC样品与已知量(A),分析物溶解在postextracted空白矩阵在同一质量浓度水平(B),在同一质量浓度和整洁的标准水平(C)测定,分别为(n= 3)。对C的比率是用来估计提取复苏,而B对C的比率是用来评估矩阵(表的影响2)。结果表明,提取复苏是在可接受的范围之内,并没有明显影响矩阵brigatinib和brigatinib-analog这个方法。

3.2.5。稳定和结转

brigatinib和brigatinib-analog稳定性的评估通过分析低浓度和高水平的QC样品在不同条件下(n= 6)。温度和时间条件如下:6 h在环境温度,储存在−20°C 10 d,三个冻融循环,autosampler 24小时在4°C。测量浓度都在可接受范围之内(±15%的名义浓度)在整个验证。结果表明,brigatinib和brigatinib-analog稳定条件下在这项研究中(表调查3)。结转是评估通过确定峰值区域brigatinib顺序和brigatinib-analog注射空白矩阵样本后最高的校准标准样品注入。此外,这一研究获得的没有延滞效应。

3.3。药代动力学和大脑分布应用程序

验证方法被成功地应用于研究brigatinib的药物动力学和brigatinib-analog填喂法大鼠的剂量的5毫克/公斤,分别。

没有显著的差异曲线下的面积(AUC;261528.73±86227.28和262436.45±74089.38 ng / mL·min),峰值时间(T_马克斯;260.00±30.98和260.00±48.99分钟),最大浓度(C_马克斯;537.85±185.55和734.41±83.06 ng / mL),表观分布容积(V_d;5.66±1.94和3.43±0.96 L /公斤),和间隙(CL_z/ F;0.022±0.010和0.021±0.006 L / min /公斤)观察老鼠brigatinib和brigatinib-analog之间。平均停留时间(捷运)和半衰期(T_1/2)在老鼠brigatinib 403.98±12.02分钟,189.41±20.55分钟。同时,相同的参数brigatinib-analog表现出显著降低捷运(328.55±35.68分钟)T_1/2(120.78±29.74分钟)相比brigatinib ( )。brigatinib的平均血浆浓度时间配置文件和brigatinib-analog老鼠在图进行了总结3。

建立质/ MS方法也成功应用于研究大脑brigatinib分布和brigatinib-analog后大鼠口服5毫克/公斤。大脑分布研究发现brigatinib和brigatinib-analog可以穿透血脑屏障(BBB)。分析物的能力穿透的BBB估计使用平均AUC的比率_{(0- t)}在老鼠大脑中等离子体(AUC)_大脑/ AUC_等离子体在同一剂量),假设1 g的脑组织相当于1毫升的等离子体。AUC的比率_大脑/ AUC_等离子体分别是0.223和0.088 brigatinib和brigatinib-analog,这意味着brigatinib具有较强的能力通过BBB比brigatinib-analog老鼠。此外,AUC有显著差异_(0-t)捷运,C_马克斯,V_d,CL_z/ F在老鼠大脑与brigatinib brigatinib-analog ( )。脑组织的平均浓度时间brigatinib概要文件和brigatinib-analog单一口服后老鼠呈现在图4。brigatinib的主要药代动力学参数和在大鼠血浆和脑组织brigatinib-analog表4。

4所示。结论

总之,一个高度敏感、可靠和简单的质/ MS方法开发和验证了brigatinib和brigatinib-analog的同时测定大鼠血浆和脑匀浆。验证质/ MS方法也被成功地应用于药物动力学和大脑分布研究brigatinib和brigatinib-analog单口服后在大鼠5毫克/公斤。药代动力学研究表明,仍有一些差异brigatinib和brigatinib-analog之间老鼠药代动力学特征。此外,与brigatinib-analog相比,brigatinib中枢神经system-penetrant走强。然而,未来的研究应该增加样本量实证的结论更有说服力。上述研究将为进一步的应用打下良好的基础brigatinib和brigatinib-analog。

数据可用性

生成的数据集和分析在当前的研究中并不公开由于机构的保密协议,但可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Bo李陆和最小的贡献同样工作。

补充材料

补充图1:SRM色谱brigatinib(我)和brigatinib-analog (II),在老鼠大脑匀浆:(A)空白老鼠大脑匀浆;(B)空白的大脑匀浆飙升的分析物(0.5 ng / mL);(C)一只老鼠脑匀浆样本收集4 h后5.0毫克/公斤brigatinib单一口服;(D)一只老鼠脑匀浆样本收集4 h后单口服5.0毫克/公斤brigatinib-analog。(补充材料)

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