羟基吲哚乙酸为底物的分析脂肪酶活性

文摘

脂酶在代谢中起关键作用的微生物,真菌、植物和动物,在分析化学,它们通常用于检测脂肪酸和甘油三酯。脂肪酶活性测定在毒理学也很重要,当脂肪酶的活动可以增加和减少了有机磷酸酯类和其他杀虫剂和药物对心脏疾病的诊断。脂肪酶活性测定的标准方法是基于在脂肪酶缓冲区包含渐变裂开酯债券。我们的目标是找到一个方法更快和更敏感的反应。众所周知,乙酰胆碱酯酶属于同一组的脂酶和水解酶酶裂解羟基吲哚乙酸,所以我们假设羟基吲哚乙酸可以用脂肪酶报告类似的反应。我们的方法是基于羟基吲哚乙酸作为脂肪酶的衬底,在羟基吲哚乙酸是由脂肪酶吲哚酚和醋酸裂解一部分创建和蓝色的靛蓝。不同的时间和数量的方法优化酶并与渐变检测的标准。校准曲线测量反应时间20分钟10μl脂肪酶的最佳分析参数,它显示Michaelis-Menten响应Michaelis-Menten常数等于8.72更易/ l。的吲哚酚acetate-based方法显示更快和更敏感的响应比标准的脂肪酶活性测定的方法,所以它有巨大的潜力在生物传感器结构可用于工业、医药、毒理学和惯例脂酶的活性在哪里需要测量。

1。介绍

所有脂酶属于三酰甘油水解酶(提到过3.1.1.3)类的酶。他们的功能是分裂在脂肪酯债券,主要是甘油三酯,甘油和脂肪酸。脂酶被称为丝氨酸水解酶催化中心因为含有丝氨酸,组氨酸,谷氨酸和天冬氨酸,这取决于类型的生物(1- - - - - -4]。然而,含有丝氨酸脂酶的活性中心,天冬氨酸和组氨酸打开/关闭构象主要是对所有类型的脂酶。脂酶发生在许多变化对源码,和他们是不同的在特定酶的性质如pH值、温度、稳定的金属离子和有机溶剂的存在,和底物特异性。这些因素影响活动和酶的性质(5,6]。

脂酶在代谢有重要的作用,他们的活动中可以找到的动物,植物,真菌和微生物的生物,他们大多是在消化脂肪的重要作用7,8]。他们也有一个重要的工业、医疗应用、生物技术(9- - - - - -11]。如今,脂酶的重要性已经日益增长的医疗行业,因为承认外部酶甚至可以作为癌症预防(12]。看来脂蛋白脂酶和功能异常与像肥胖的病理过程,阿尔茨海默病、动脉粥样硬化,和dyslipideamia与糖尿病和相关感染(13]。旁边,在毒理学脂酶有重要的作用,他们的活动可以增加和减少了一些有毒物质包括有机磷、氨基甲酸盐、乙醇。(14- - - - - -16]。有机磷和氨基甲酸盐在农业、医药、工业和他们一直由剧毒神经气体的化学处理。他们的知名效应是基于抑制乙酰胆碱酯酶(疼痛),导致神经传递的障碍,但他们影响整个代谢和生化途径17- - - - - -19]。

我们的目的是开发新的、快速、敏感、准确的方法基于衬底的脂肪酶活力测定羟基吲哚乙酸(IA)。IA不那么著名的作为脂肪酶活性测定的衬底,迄今为止,已很少应用和分析参数不存在或并不可用。例如,IA被用作基质咕噜声和脂肪酶活性测定的方法是基于试纸浸渍由IA (20.]。试卷被证明是容易处理,但灵敏度和其他分析参数被发现高度不够,所以IA不是进一步测试作为脂肪酶活性测定的合适的底物(21]。IA也是基质用于疼痛活动检测。疼痛对IA的影响是打通IA吲哚酚和醋酸基,紧随其后的是自发的蓝色靛蓝的创造。颜色的解决方案是可衡量的分光光度法在波长620纳米22,23]。

疼痛就像脂酶属于丝氨酸水解酶组(提到过3.1.1),及其催化三分子由三个氨基酸,丝氨酸,组氨酸,谷氨酸,非常类似于催化三分子的脂酶(24- - - - - -26]。这就是为什么我们认为IA也可以用作基质测定脂肪酶活性。根据自己的经验和IA作为脂肪酶活性衬底的决心,我们看到了潜力IA作为衬底,所以我们专注于新的IA-based方法的分析性能的提高。

2。材料和方法

2.1。化学物质

所有化学品都从商业来源获得分析品位,和化学品在使用前没有做调整。羟基吲哚乙酸(IA)、磷酸盐(pH值7.4),渐变,从猪胰脂肪酶(类型VI-S、≥20000单位/毫克蛋白冻干粉),三(羟甲基)甲胺盐酸盐(Tris-HCl) CaCl₂,渐变20都是从Sigma-Aldrich买(圣路易斯,密苏里州,美国),和绝对乙醇从五购买(布拉格,捷克共和国)。脂肪酶缓冲区由20更易与l Tris-HCl 80更易/ l CaCl₂,1%的渐变20。所有化学品适应实验室的温度条件下,和所有实验进行标准环境温度和压力下(SATP)。

2.2。装置

发现颜色的变化测量解决方案通过使用96 -通道分光光度计,Tecan日出(奥地利萨尔斯堡)。软化水制备反渗透过程使用设备水渗透2 (Aqua渗透、Tisnov捷克共和国)。缓冲区使用酸度计和其他解决方案准备,CyberScan pH值从6000 Eutech (Landsmeer、荷兰)。

2.3。标准方法基于渐变20

分析渐变20作为脂肪酶底物用作分解脂肪的测定标准方法的活动。我们的测量受Plou和合作者轻微修订工作(27]。我们使用渐变20浓度范围从0到50更易/ l(0、6.25、12.5, 25岁,和50更易/ l)在脂肪酶缓冲与脂肪酶(200 U)混合在一起,和我们测量吸光度的解决方案在时间范围从0到60分钟使用波长450纳米。

2.4。IA-Based方法

证明IA作为脂肪酶活性检测的底物浓度范围的试验进行的IA 0-50更易/ l(0、6.25、12.5, 25岁,和50更易/ l)。解决方案的总量是200μ40 l,添加了IA在量子μ5 l和脂肪酶在两个不同的数量μl或10μl(100和200 U)和残渣体积被磷酸缓冲完成。溶液的吸光度测定的时间范围从0到30分钟使用波长620纳米。反应的原理基于脂肪酶裂开IA如图1。

2.5。自发的IA的颜色

IA在浓度范围从0到50更易/ l(0、6.25、12.5, 25岁,和50更易/ l)测量有或没有在测定酶可能自发IA的颜色。与160年40毫升IA的混合在一起μ150年磷酸盐缓冲剂或lμl磷酸盐缓冲剂和10μ脂肪酶的l。解决方案通过使用分光光度计测量波长620 nm的时间范围从0到30分钟。

2.6。对接IA脂肪酶

加州大学旧金山分校嵌合体(版本1.11.2;由RBVI与NIH的支持,加州大学旧金山分校(28])是用于创建3 d图像和计算机预测。人类胰脂肪酶(PDB代码:2 pv (29日])是获取并使用码头准备工具准备对接。对接,七弦琴AutoDock工具被使用,和计算是蛋白石服务器上运行网络。

2.7。数据处理

所有测量在pentaplicate执行。测量数据处理软件起源9.1 (OriginLab公司,北安普顿,马萨诸塞州,美国)。信号与噪声等于三个标准(S / N = 3)用于LOD计算。Michaelis-Menten常数(K_米脂肪酶和IA或渐变20使用非线性曲线拟合和希尔函数计算协同系数n= 1。

3所示。结果

3.1。标准方法基于渐变20

增加吸光度响应增加浓度的渐变Michaelis-Menten行为,如图2分光光度计测量的波长450 nm。统计数据的曲线测量及时总结在表1。值得注意的是,最低的K_米和检测极限(LOD)测定曲线测量在60分钟的反应时间。

3.2。IA-Based方法

由于水解疼痛的函数,在IA裂开酯债券的能力,这是一个假设脂肪酶反应会同样的过程(23]。IA疼痛活动作为衬底的决心,它启发我们用IA作为脂肪酶活性衬底的决心。在的优化试验,脂肪酶是通过实验确定和10的体积μl脂肪酶(200 U)被设置为理想的体积,但浓度范围的IA也是测量体积的脂肪酶5μl (100 U)。曲线测量与5μl和10μ脂肪酶的l显示Michaelis-Menten(数据的依赖3和4),但测量结果与脂肪酶的数量更高更好的展示Michaelis-Menten依赖。浓度曲线5的数据μl和10μl的脂肪酶在表中进行了总结2和3。优化反应的时间也做,每次所示数据和曲线3和4。由于曲线测量的结果计算最小的区别在20日25日和30分钟,测量的合适时间是20分钟的最短时间的试验。增加吸光度对应于IA浓度的增加,所以我们认为是可以作为一个合适的底物脂肪酶活性测定。

3.3。自发的IA的颜色

增加吸光度测量解决方案的也可能是自发的结果IA的颜色,所以我们测量IA和无酶。结果在图5没有重大改变每个IA浓度的吸光度随着时间增加而酶是不习惯。使用酶结果显示显著增加时间为每个IA浓度在0更易与l浓度。因为我们记录没有自发的着色IA在试验期间,我们假设方法不受IA的自然颜色。

3.4。对接IA脂肪酶

之间存在氢键列伊78年IA和氢原子与氮分子(2.28)。这种交互是稳定的π- - - - - -πIA芳香体系的互动与芳香氨基酸在脂肪酶的结构(图6)。结合能预测这种交互是−0.5千卡每摩尔。在硅片方法预测的参数和结果总结在表4。

4所示。讨论

渐变的标准方法相比20使用IA和方法,我们使用IA在较短的时间达到更好的效果。IA-based方法显示低K_米比标准测定高敏感性和酶对底物的亲和力。酶活性的增加是监测浓度在不同时间的函数。可以提高灵敏度的延长时间分析;另一方面,不需要太长时间的分析标准流程。分析成立于时间的合适时间20分钟,因为测量分析参数足够足够不响应更好的方法(分析参数不显著提高)的延长时间。在Hernandez-Garcia和合作者30.),不同的基质进行了测试使用脂酶两个来源毛霉菌javanicus和荧光假单胞菌。K_米值计算使用基质,价值最低的是证明使用脂肪酶为棕榈酸酯毛霉菌并使用脂肪酶的豆蔻酸盐假单胞菌;的值K_米计算是0.95和0.57更易与l,分别。他们使用环境温度较高(50 - 60°C)根据脂肪酶的来源。这些值低于我们的约10倍,但在我们的测量,更高的温度是没有必要使用;另一方面,我们也可以减少K_米价值的增加对我们的IA衬底温度。还需要提到,对于不同的基质,K_米值是比得上我们的价值观(月桂酸盐K_米= 11.49更易/ l的脂肪酶毛霉菌),这意味着脂肪酶对我们的底物的亲和力是充分的和类似的其他研究。在[31日),p-nitrophenylphosphate测试作为脂肪酶活性衬底的决心,和酶的亲和力(脂肪酶假单胞菌cepacian)衬底是评估基础上的K_米价值等于12±1.6更易/ l;这些结果与我们的测量相对应。从可用的数据,我们可以评估较小的底物分子(IA,p-nitrophenylphosphate)非常相似K_米值高于一些较大的底物分子(棕榈酸酯和豆蔻酸盐),但主要是K_米值取决于脂肪酶的来源。猪脂肪酶的转化率和IA衬底也计算,是在0.087 - -0.183(表的范围2和3)。类似的结果使用丁香酚(0.67秒⁻¹)和真菌脂肪酶32),三醋精(0.1和0.32 s⁻¹),同时4-nitrophenyl醋酸(0.36和0.44 s⁻¹从水稻)使用脂肪酶33)和4-nitrophenyl丁酸(0.125和0.158 s⁻¹)使用脂肪酶基因的突变体葡萄球菌xylosus(34]。相比之下,三丁酸甘油酯使用脂肪酶基因突变体的转化率葡萄球菌xylosus发表在范围从450到1900年代⁻¹,根据突变类型35)和更高的骆驼和天蝎座模型(4333年代⁻¹和5370年代⁻¹分别)[36,37]。

在K_米值,IA与标准渐变衬底相比有更多的优势。脂肪酶的反应与IA是彩色的,所以它是由肉眼可见和半定量的检测没有使用的设备是可能的。这个事实可以有一个很好的应用。有时,筛查鉴定细菌脂肪酶和酯酶生产没有以前的净化酶是必需的。培养的具体执行的测试是在培养皿中微生物在琼脂板表面。通常,三丁酸甘油酯水解测试用于屏幕lipase-producing细菌脂肪酶的分析活动,滴定方法必须遵循三丁酸甘油酯测试(38- - - - - -40]。三丁酸甘油酯、三油精也经常用作基质lipase-producing细菌鉴定,但添加荧光,例如,罗丹明B是必需的,和测试比三丁酸甘油酯更复杂的测试在实践中主要是由于不一致的效果。渐变的蓝色尼罗河的指标也可以用于这种类型的测试,但可见的间隙测定脂肪酶的关键活动也不清楚(39]。IA可能是理想的基质的决心在测试类型的微生物脂肪酶存在因为颜色改变会发生在菌落的活跃脂肪酶存在和颜色改变会被肉眼没有任何荧光或颜色的应用指标。在Żądło-Dobrowolska和合作者,荧光探针用于检测脂肪酶,酯酶和蛋白酶活动的基础上,利用氨基甲酸酯可分裂的链接探针结构(41,42]。虽然荧光探针方法是高度复杂的,探测含水条件下是稳定的,不容易特异性的退化和基于IA的方法更简单,更节省成本。因此,它更容易观察蓝色着色IA琼脂浓度的解决方案比其他任何已知来执行测试。在未来,增加IA琼脂板可以尝试按照下面测试。

交互的IA胰脂肪酶在网上学习。没有晶体结构的猪胰脂肪酶PDB数据库中被发现,我们决定使用人类猪胰脂肪酶的结构非常相似。使用脂肪酶盖子很重要,在一个开放的构象,因为它模拟生理环境中活跃的酶。从图5,应该注意的是,羰基IA的一部分分子的取向是对残留检77年和153年低浓缩铀,oxyanion稳定形成中间的洞在152年与Ser互动(29日]。这可以作为了解正确取向IA脂肪酶活性部位;此外,IA相比是非常小分子长链脂肪酸,所以与疏水氨基酸在长腔输入是出乎意料的时候。从结果可以看出,少量的能量被释放表明IA脂肪酶亲和力较低。释放的能量与解理自然基质如软脂酸甘油酯或三丁酸甘油酯,脂肪酶的亲和力IA似乎低;然而,它仍然可以作为脂肪酶底物着色时的额外好处是用于筛选的脂肪酶的活性微生物培养物琼脂板(43,44]。另一方面,底物的亲和力不同类型的脂肪酶和使用衬底之间可以从文献[30.,31日]。尽管支持我们的研究结果的理论背景,它还只是预测应经x射线晶体学。

5。结论

一些方法利用IA合适的底物脂肪酶活性测定已经描述,但是一个好的敏感性和其他分析结果并没有观察到。没有工作用IA作为底物与标准方法比较的结果,和我们的分析给出了一个新的看IA作为脂肪酶活性测定一个方便的衬底。在我们看来,我们IA-based分析化学方法有一个有用的潜力,可以作为一个合适的,快速、简单的脂肪酶活性检测的方法。在测量中,脂肪酶活性测定的标准方法分光光度法与IA-based分光光度法方法。利用IA的改进方法是含蓄的,快速、更敏感。方法很简单,没有那么困难的准备和时间。在测量过程中,K_米价值较低的IA-based方法比标准方法,因此,显示了一个高灵敏度的脂肪酶底物。IA的新方法是适用于常见的利用率,医药、分析化学和毒理学脂肪酶活性测定。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称他们没有关于这篇文章的出版的利益冲突。

确认

这项工作得到了国防部的捷克Republic-long-term组织发展计划,医疗方面的大规模杀伤性武器的军事学院健康科学。具体的研究基金MSMT SV / FVZ201701(国防大学军事学院健康科学,捷克共和国)也感激地承认。

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