文摘

为了建立类黄酮的提取工艺石斛兰officinale叶子,一个方法结合Plackett-Burman设计(PBD),最大提升设计和中心合成设计开发优化类黄酮的提取。此外,黄酮类化合物的抑制酪氨酸酶活性进一步体外测试。PBD结果表明,乙醇浓度和提取是关键因素。响应面方法(RSM)表明,最优提取条件是78%的乙醇浓度,提取六次,2 h, 1:50固液比。在这些条件下,总类黄酮含量可达35毫克/ 50毫升。体外酪氨酸酶实验,提取总黄酮类化合物对酪氨酸酶活性的抑制作用最好βmonophenolase和diphenolase熊果苷,其抑制率超过了100%和70%,分别。这些结果表明,RSM能够有效改善类黄酮的提取石斛兰officinale叶子和类黄酮的前景被应用于食品和化妆品。

1。介绍

类黄酮,这是一个类的化合物2-phenylchromanthone结构和C6-C3-C6基本碳支架,通常与糖结合形成苷在植物和一小部分的形式免费(苷)1]。黄酮类化合物已被证明具有多种生物活性,如抗氧化、抗炎和antiapoptosis活动(2,3]。营养食品行业,大多数最近发现自然的酪氨酸酶抑制剂类黄酮,这是更安全、更有效的比某些合成酪氨酸酶抑制剂(4]。酪氨酸酶抑制剂可以减缓食品褐变过程中处理和存储通过抑制酪氨酸酶的作用和各种微生物的生长5]。类黄酮还可以被用来作为增白剂来实现美白功效。最潜在的酪氨酸酶抑制剂,黄酮类化合物被广泛应用于食品和化妆品;因此,寻找新的有效的酪氨酸酶抑制剂在天然黄酮类化合物是必要的(6]。

石斛兰officinale是一种兰科多年生草本植物在生物分类(7]。病史记录显示,该草本可以滋养阴,增加体液的产量,增强胃蠕动,降低血糖,延长寿命8]。珍贵的中草药,茎d . officinale在全国范围内食用,叶子和花也用作食品浙江、云南、分别。2018年,树叶和鲜花都包含在“食品安全法”管理。的不断发展d . officinale行业的人喜欢吃树叶和鲜花正在增长。我们的研究小组一直在测试的有效性的各个部分d . officinale几年来,结果表明,每个部分的化学成分d . officinale是相似的;特别是,叶中的总黄酮含量高于茎(9]。类黄酮提取的叶子d . officinale也被发现有抗氧化和抗高血压效果。此外,类黄酮可以抑制酪氨酸酶的作用[10),这意味着类黄酮可以充分利用酪氨酸酶抑制剂在食品和化妆品中。然而,普遍的叶片中黄酮类化合物的提取协议d . officinale不存在,其萃取率相对较低。

因此,单因素实验旨在提高黄酮的萃取率d . officinale叶子。结果的基础上,进一步优化了提取工艺Plackett-Burman设计(PBD),最大提升设计和响应面方法。此外,类黄酮对酪氨酸酶活性的抑制率是决定体外。

2。材料和方法

2.1。化合物、材料和试剂

d . officinale是由浙江Senyu工业有限公司。(京华,中国)。酪氨酸,β熊果苷、l - 3 4-dihydroxyphenylalanine(左旋多巴)购买从源叶生物科技有限公司(上海,中国)。乙醇是由华东制药有限公司有限公司(杭州)。标采购从分子设备(美国硅谷)。紫外分光光度计是来自日本岛津公司(日本京都)。恒温培养箱是由上海提供景洪实验设备有限公司有限公司(上海,中国),和一个旋转蒸发器是由河南昙花仪器有限公司,有限公司(河南,中国)。

2.2。含量测定

制备芦丁标准溶液是如下:大约10毫克的芦丁标准准确称重,放置在一个50毫升容量瓶中,用70%乙醇定容稀释,动摇了获取质量浓度为0.2毫克/毫升芦丁标准溶液。

绘制的标准曲线如下:芦丁标准解决方案为1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,和4.0毫升是精确地绘制和放置在10毫升插入测试容量的玻璃瓶。随后,70%乙醇加入5毫升;然后0.4毫升的5%纳米₂的解决方案是添加,把6分钟。艾尔(大约0.4毫升的10%₃)₃的解决方案是添加了6分钟,和4毫升的4%氢氧化钠溶液添加并放置15分钟。最后,试剂空白被用作参考测量吸光度在510海里。标准曲线绘制获得芦丁标准曲线的线性回归方程。

总黄酮类化合物的测定是如下:样本准确地获取和处理类似的标准方法。结果被纳入标准(11]。

2.3。实验设计

2.3.1。单因素试验

单因素实验被执行死刑来估计每个影响因素的最佳射程。乙醇浓度的影响(35% - -85%),拔牙(1 - 5),提取时间(0.5 - -2.5小时),流动性比率(1:10-1:60)类黄酮提取率的研究(12,13]。黄酮类化合物的含量进行评估和分析PBD确定最佳参数。

2.3.2。PBD

四个因素对黄酮提取的影响进行评估的PBD(表1)。单因素实验的结果证实,所选级别material-to-liquid比例为1:40一60,提取时间是1.5和2.5 h,拔牙的数量是3和5,乙醇浓度为70%和80%。12组实验条件设计由设计专家V.8.0.6软件(14,15]。

2.3.3。最大提升设计

最大提升设计确定这些关键因素的最佳地区。通过分析正面和负面影响的结果PBD,步长和空点的提取浓度和提取的数量分别为70%和1.5和1和1,分别(表2)。这些值增加的强度实验,该地区最好的效果接近[15,16]。

2.3.4。中心复合设计(CCD)

速上升的结果的基础上,设计、最佳乙醇浓度为77.5%,拔牙的数量是6个17,18]。双重CCD,涉及5个重复的中心点(表3),设计了。在这个设计,类黄酮含量的响应值,执行和数据分析中使用的每个因素设计专家V.8.0.6软件(19]。

2.3.5。石斛兰类黄酮的验证和分析

三个平行实验最优提取条件由CCD实验。得到的值是平均得到最终结果。

2.4。测定酪氨酸酶抑制活性

获得的提取物都集中到0.4 g / mL药材,离心机为30分钟在8000 r / min澄清,与50%乙醇冲洗掉ADS-17大孔树脂。提取集中到2、3、4、5和6毫克/毫升β熊果苷是集中在相同的浓度梯度。

酪氨酸和左旋多巴为底物,四组反应的液体被准确地吸收96 -孔板根据表中提供的体积4通过使用吸管枪。酪氨酸酶是添加到每个组30μ10分钟后L(0.25毫克/毫升的恒温37°C恒温的孵化器。的吸光度₀,一个₁, ,和在475 nm反应10分钟,30分钟,1 h, 2 h, 4 h是衡量一种酶标记工具。酪氨酸酶活性的抑制率是使用以下公式计算(20.]:

2.5。统计分析

PBD的结果,最大提升设计,并通过设计Expert.V.8.0.6软件分析了CCD。其他相关数据进行了分析通过SPSS 21.0和方差分析认为显著p < 0.05,高度显著p < 0.01。

3所示。结果与讨论

3.1。类黄酮提取的单因素实验

单因素优化实验的结果如图所示1。类黄酮含量先增加然后减少与四个各种因素的变化。符合曲线,提取时间,乙醇浓度,和material-to-liquid比施加明显对黄酮提取的影响。最优条件提取时间为2.5 h,四个拔牙、乙醇浓度75%,material-to-liquid 1:50的比率(21]。

3.2。PBD优化类黄酮提取的因素

单因素优化实验的结果的基础上,提取条件的影响,四个因素和两个水平被用来过滤乙醇浓度、数量的拔牙、萃取时间、和流动性比率,如表所示1。方差分析结果表5。鉴于PBD受雇,二次多项式方程,获得重要的条款如下:最后方程编码方面的因素:类黄酮= 2.80 + 25.86 + 2.15××C + D最后方程在实际的因素:类黄酮=−17.57651 + 2.80253×号+ 0.42966×甲醇

符合PBD实验的结果,软件分析得到的回归模型显示的重要平方0.8472;因此,方程与实际情况是一致的(22]。测试这两个因素,即提取和乙醇浓度,显著(p < 0.01)总类黄酮提取的影响,提取时间和material-to-liquid比率对类黄酮含量无显著影响。当抽取的数量从3提高到5,黄酮含量显著增加(p = 0.0003)可能由于综合提取黄酮类化合物。改变乙醇浓度从70%到80%就可以调整系统的极性和改变黄酮类化合物的溶解度23]。这两个因素进行评估的关键因素最大提升设计和单因素实验结果表明,最佳料液比例为1:50的提取时间2 h。

3.3。速上升类黄酮提取的优化设计

速上升的路径用于方法的最优区域两个提到的因素(24]。根据上一步的实验结果,零的拔牙是1(表的数量2),步长是1,零的乙醇浓度为70%,和步长为1.5。攀爬的实验是按照步长和空点,结果如表所示2。

爬实验的结果表明,类黄酮含量逐渐增加的数量提取和乙醇浓度。当拔牙的数量是6个,乙醇浓度为77.5%,最高的值达到33.81毫克/毫升,和提取的总黄酮含量进一步提高(25,26]。

3.4。响应面优化类黄酮提取的方法

速上升通过PBD和设计实验,重要参数(27被选中。表3显示了设计团队和相应的结果,表6介绍了方差分析的结果。研究结果表明,最优数量的抽取,六岁,和乙醇浓度为78%;在中央的条件下获得的结果是相同的。此外,根据CCD的结果,二次多项式方程表示如下:最后方程编码方面的因素:类黄酮= + 35.26 + 1.16××B + 1.34−−3.48×0.36××B²−2.60×B²最后方程在实际的因素:类黄酮甲醇+ 11.08481 =−9278.13580 + 238.81473××号+ 0.24249甲醇××号−1.54512×甲醇²−2.60128×号²

方差分析是用来评估优化的结果。一个小假定值表明显著影响响应变量(7]。模型的相关性p值0.0003 < 0.01,这表明,优化模型是很有意义的。此外,p值的提取和乙醇浓度分别为0.0207 < 0.05和0.0112 < 0.05,分别显示两个因素施加重大影响(28]。最后方程的实际因素显示,乙醇浓度和提取的数量增加的积极系数线性效应,而一个²和B²都有负的系数。缺乏合适的不显著,模型的拟合优度由估计的方差决定系数(R²),这是观察到0.9432;因此,这个因素可以解释94.32%的拟合模型(29日]。此外,平方值0.9432,接近0.9026的平方值调整,这暗示好统计模型(30.]。

在这项研究中,三维曲面(图2(一个))和二维轮廓图(图2 (b)),这解释了每个变量和实验水平之间的关系(29日创建相应的响应,提取时间和乙醇浓度为X和Y坐标,分别和类黄酮含量为Z坐标(31日]。在3 d曲面等高线图和2 d,观察一个交互两个选择之间的因素,但效果是毋庸置疑32]。

3.5。最佳条件的验证

进行验证性实验的基础上,从上述实验获得最佳提取条件。一个方法被认为是可信的,如果误差小于10% (7]。类黄酮提取效率模型的实验值平均为35.45±0.34毫克/ 50毫升。4.2%的差异观察之间的预测和验证性实验值(表7),证实了优化模型的有效性。

此外,我们的研究小组发现的黄酮类化合物d . officinale大多是芦丁的衍生品,是丰富的。通过指纹分析,确定的叶子d . officinale包含八类黄酮(9),如表所示8。

3.6。测定酪氨酸酶抑制活性

酪氨酸和左旋多巴为底物检测酪氨酸酶的抑制活性β熊果苷作为积极的控制(33,34]。如图3类黄酮提取物,β熊果苷具有很强的酪氨酸酶抑制活性。总的来说,类黄酮的抑制作用是更好的比β熊果苷。曲线的趋势表明,酪氨酸酶活性抑制剂量依赖性的方式。当总黄酮类化合物6毫克/毫升的浓度,抑制酪氨酸monophenolase率近100%,但抑制酪氨酸diphenolase率只有70%。因此,相比之下,酪氨酸diphenolase的抑制率(数字3(一个)- - - - - -3 (f)),酪氨酸monophenolase黄酮类提取物的抑制效果(数字3(我)- - - - - -3(左))是更重要的35]。

六个时间点进行测试,全面了解抑制酪氨酸monophenolase活动(数据3(一个)- - - - - -3 (f)(数据)和diphenolase活动3 (g)- - - - - -3(左)类黄酮提取物)。的抑制率βmonophenolase逐渐下降随着时间的推移,熊果苷,观察略有差异显著的浓度。然而,类黄酮提取物的抑制率monophenolase缓慢下降随着时间的增加,不同浓度的区别是显而易见的。当反应时间是10分钟(图3(一个)),抑制率β熊果苷是大大高于黄酮类提取物,除了在6毫克/毫升。当反应时间30分钟(图3 (b)),类黄酮提取物的抑制率大大高于β熊果苷,扩大的差距随着时间的增加;这种现象可能与强大的抗氧化活性黄酮类提取物对酪氨酸酶,催化酪氨酸的角色在自由基的存在36]。

数据3 (g)- - - - - -3(左)表明类黄酮提取的影响在diphenolase相比是更重要的β熊果苷。最好的抑制作用是观察在类黄酮提取物的浓度5毫克/毫升(图3(我))。类似于monophenolase抑制的作用,抑制率diphenolase略有改变。因此,类黄酮提取物对抑制效果比β熊果苷,monophenolase的抑制作用比在diphenolase [37]。

4所示。结论

本研究调查了类黄酮的提取RSM的叶子d . officinale并分析了类黄酮提取物对酪氨酸酶的抑制作用。PBD的结果的基础上,最大提升设计、CCD,确定了最佳的提取条件如下:乙醇浓度为78%,六个拔牙、material-to-liquid 1:50的比例,提取时间2 h,类黄酮含量35毫克/ 50毫升。类黄酮的提取d . officinale叶子在这些条件下增加。

结果表明,类黄酮提取物的叶子d . officinale可以有效地抑制酪氨酸酶活性,观察量效关系。在一定的浓度,类黄酮提取物对酪氨酸monophenolase和diphenolase展示了良好的抑制影响。此外,这些提取物有显著的抑制效果和强度比的β熊果苷,其抑制率高于monophenolase活动diphenolase。因此,酪氨酸酶抑制剂,类黄酮提取物的叶子d . officinale将来可能会成为一个组件hypopigmentation食品和化妆品。

然而,这个实验仍有一些局限性。类黄酮提取物的成分在未来可以进一步分析,以及黄酮类提取物与酪氨酸酶相互作用的类型可以进一步研究细胞和整体水平。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

不知陆和Ke杨同样这个工作和co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家重点研发项目(没有。2017 yfc1702200),中国国家科学基金会(没有。81673638,没有。81874352,没有。81703772,没有。81803760,没有。81803761),浙江大学的年轻人才项目资金技术(没有。GY17034148004),国家新药科技创造和开发项目(没有。2011 zx09101 - 002 - 07),浙江省重点实验室项目(没有。2012 e10002)。