文摘

的保留机制四个主要类胡萝卜素,叶黄素(即两个叶黄素和玉米黄质)和两个胡萝卜素(即。、番茄红素和 - - - - - -胡萝卜素),考察了在反相液相色谱热力学分析的目的。实验变量被认为是在这个研究是流动相的组成(MP)和温度。色谱洗脱下进行线性、权力平等主义的条件通过使用C18固定相,四个不同的议员组成(通过不同比例甲醇/乙腈从66.5/28.5到47.5/47.5 v / v),和列温度范围283 - 313 K。传统的范霍夫分析被用来估计标准焓的变化( )和吉布斯自由能 )与溶质转移从移动到固定相在每个流动相组成。热力学量的相关调查中类胡萝卜素的结构及其与十八烷基硅胶固定相交互。

1。介绍

类胡萝卜素在食品都是线性的多基因由八个异戊二烯单位,也叫做tetraterpenes,不同于彼此的一个或两个端基甚至顺反式构象。类胡萝卜素主要是分为两组根据氧原子的存在与否:含氧碳氢化合物类胡萝卜素被称为胡萝卜素,而称为叶黄素(1]。氧原子可以含有羟基、甲氧基、羧基、酮、环氧组。他们也广泛分布在植物、动物和细菌,光收获,包括光在光合作用和抗氧化剂1]。由于品质重要性标记在食品由于其医疗和生物影响,类胡萝卜素是一些出版物在分离科学的对象。大量的文章可以在文献中找到,旨在开发和验证高效液相色谱和LC / MS分析识别和确定这些分子在食品和生物矩阵(2- - - - - -4]。基本的调查在过去了解流动相修饰符对选择性的影响和解决(5,6),以及色谱行为与温度的依赖7,8]。此外,当时特别烷基静止阶段,如C30、开发和研究为提高类胡萝卜素的高效液相色谱分离及其同分异构体(9- - - - - -11]。

四个主要类胡萝卜素的食品中丰富叶黄素、玉米黄质, - - - - - -胡萝卜素、番茄红素(见图1)。叶黄素和玉米黄质属于叶黄素集团,而番茄红素 - - - - - -胡萝卜素是碳氢化合物的类胡萝卜素。番茄红素具有两个相同的线性2 6-dimethyl-1 5-heptadiene端基,形成鲜明对比 - - - - - -胡萝卜素在相同的原子排列成2,6 6-trimethyl-1-cyclohexene根。两个叶黄素显示而不是羟化环己烯端基:两个4-hydroxy-2, 6日6-trimethyl-1-cyclohexene玉米黄质,而叶黄素一末端,另一个是4-hydroxy-2之前,6 6-trimethyl-2-cyclohexene。

这项工作的目的是研究这些化合物的反相色谱行为之间的关系和他们的结构特点,考虑到保留的热力学过程。换句话说,这项研究的目的是调查的吉布斯自由能的变化(即及其贡献。熵和焓的变化)与溶质传输从移动到固定相。这已经通过范霍夫分析通过测量四个化合物的高效液相色谱保留在不同列的温度。范霍夫后发展的理论,热力学分析已广泛应用于大量的文学作品在色谱法研究不同分离系统(12- - - - - -14]。

2。理论

在线性条件下,保留因子( )通常是用来表达多久一个示例组件是弱智的比要经过固定相列与流动相的速度(MP) (15]。被定义为 在哪里和分别的保留和障碍卷。由于在线性色谱法,分配常数(分配系数)是独立的样本组件浓度;然后也等于一个示例组件的数量的比率固定在平衡和国会议员。因此, 与阶段的比率(即的比率和固定相卷)。在洗脱过程中,溶质分子不断转移从移动到固定相。分区平衡常数与标准自由能变化, ,与溶质转移从移动到固定相 通过阐述向左反应和熵的贡献(和 )来并结合(2)和(3),一个以对数形式获得 这表明,如果 , ,和被认为是独立于温度(T)、与 情节(范霍夫情节)是线性和允许的估计和 ,提供的相比例是已知的(16]。相关的测量热力学量保留代表平均值由于色谱表面的异质性。然而,保留数据可能产生线性范霍夫情节,提供相关的表面,溶质和溶剂性质不变。溶质分子在这个调查预计不会改变和T (T范围考虑)。类似地,非极性的密度保税链的固定相,溶质的可访问性,因此接触表面在绑定保持T不变。

3所示。实验

3.1。仪表

这项工作中所使用的液相色谱仪范霍夫分析是一个模块化的安捷伦1100(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。高效液相色谱是配备了溶剂输送系统,脱气器,一个二进制泵静态混合器,恒温器列车厢,和多个波长二极管阵列检测器(13μL流细胞)。数据采集频率为0.5赫兹。

HPLC-MS系统(热科学)由微液相色谱测量员+(泵、列恒温器室、autosampler和溶剂输送系统)和LTQ XL质谱仪用于多余的等温线测量。

3.2。列

Bakerbond 4.6×250毫米列挤满了5μ米键合硅胶粒子(Phillipsburg Mallinckrodt Baker, NJ)是用于所有测量。列滞留体积(通过比重瓶测定法测量;见以下)为2.60毫升,这也同意从多余的等温线测量(即获得价值。,2.54毫升)。

范霍夫分析数据收集范围内10-40°C, 277, 287, 291, 295, 298, 303, 308, 313±0.1 K。温度控制的数字温度计放置在柱室。

3.3。化学物质

乙腈(ACN),甲醇(甲醇),二氯甲烷(DCM),丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚),三乙胺(茶),醋酸铵,叶黄素(附近地区),玉米黄质(ZEAX),番茄红素(LYC) - - - - - -胡萝卜素(BCAR)购买的σ(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。

3.4。移动阶段

国会议员是由两个非水溶剂混合解决方案在三个不同的比例,该/通道b 70:30,比例,和50:50,通过二进制高效液相色谱泵。该发表了0.05醋酸铵、0.1% (w / v)二叔丁基对甲酚,和0.05% (v / v)茶在甲醇溶液:DCM 95:5 (v / v)。DCM作为非极性溶剂可能显著影响溶解度和样本的分布之间的固定和移动阶段化合物(保留和峰形的影响)。解决方案在通道b是一个0.1% (w / v)二叔丁基对甲酚和0.05% (v / v)在ACN / DCM 95:5茶的解决方案。因此,四个权力平等主义的议员组成的色谱测量甲醇:ACN: DCM 66.5:28.5:5:47.7:5 57:38:5, 47.5。

3.5。多余的等温线和Pycnometric测量

可以刻画一个色谱柱的热力学和动力学参数(即。,void volume, phase ratio, stationary phase volume, etc.) by means of specific measurements, such as pycnometry and determination of excess isotherms [17- - - - - -20.]。这里,多余的等温线的ACN ACN /甲醇混合测量设置方面的实验设计ACN体积分数了。其他研究过剩等温线超出了这个工作的目的。短的观点最相关的方程用于示踪脉冲色谱法测量等温线过剩将在补充材料(18,21- - - - - -25]。

最流行的静态方法测定孔隙体积比重瓶测定法(或重量差分法)。顺序称量的方法包括色谱柱填充不同密度的溶剂。pycnometric空白卷, ,因此计算(19,21,22] 在哪里和列满了溶剂的重量是1和2,分别和和他们的密度。人们普遍同意,给出了最大可能孔隙体积。

4所示。结果与讨论

数据2(一个),2 (b),2 (c)报告的值测量了在不同的温度下对每个议员组成:数字2(一个)指的是甲醇:ACN: DCM 66.5:28.5:5;图2 (b)指的是甲醇:ACN: DCM 57:38:5和图2 (c)指的是甲醇:ACN: DCM 47.5:47.5:5。实验点拟合线性一阶方程。故事情节透露了一些结构性差异叶黄素(类胡萝卜素含有氧原子)和胡萝卜素(碳氢化合物类胡萝卜素)。直线,事实上,在视觉上可以分为两组:上一个更强的保留化合物如胡萝卜素(LYC和BCAR)和下一个少保留物种包含叶黄素(ZEAX和附近地区)。此外,在所有情节的奇异行为LYC可以强调:拟合直线的斜率为LYC完全不同于其他三个。议员成分通过降低温度,LYC色谱行为的特点是由一个更大的增长比BCAR保留。深看一下这两个安装行参数显示,附近地区和ZEAX下降的斜率和截距增加ACN的议员;相反LYC和BCAR坡最高和最低ACN拦截在38%,而对于更小或更大值(分别为28.5%和47.5%)他们是大致相同的。适应参数变化对BCAR小很多,这导致了类胡萝卜素的一般行为保留(例如, )ACN的函数在议员只有LYC显示一个u型的趋势在调查范围内,而附近地区,ZEAX, BCAR减少他们保留ACN的增加。作为主要的后果,色谱分辨率(即。,the ratio between retention factors) between LUT/ZEAX and LYC/BCAR behaved differently with variation of ACN in MP: in particular, no significative change for the two xanthophylls was observed, while for the two carotenes resolution decreased by almost 9% when ACN increases.

保留数据用来估计热力学量通过范霍夫分析显示,保留BCAR总是比LYC议员组成和标准列温度。只有国会议员ACN /甲醇/ DCM 38/57/5和47.5 / 47.5/5 (v / v)它的发生,减少T, LYC之间的分辨率损失和BCAR可以首先观察到,然后倒置的这些化合物的洗脱顺序发生。

由于溶解度叶黄素被发现不显著改变的范围使用MP成分,保留的增加,与减少ACN的议员,可能用甲醇分子的竞争效应来解释。甲醇可能是能够与叶黄素(包含哦半个)残余硅醇存在于以derivatized二氧化硅表面。由于其疏水性(见图1),胡萝卜素明显比叶黄素留存。溶解度的胡萝卜素,叶黄素相反,显著降低在中等极性议员(即通过增加甲醇比例的议员),这可以解释观察到的保留。

为了更好的调查类胡萝卜素的色谱行为,向左反应和熵的贡献溶质传输从移动到固定相估计通过传统的范霍夫分析(4)。数据2(一个)- - - - - -2 (c)的情节作为议员的逆T的函数组成从事这项工作。类胡萝卜素,和有负面价值。影响保留因此相反:一个负面的导致增加 ,而消极的降低(见(4))。因此,我们可以预期某种焓熵补偿和这也可以讨论产生的吉布斯自由能 。首先,我们可以观察到LYC、和所有类胡萝卜素之间的最大绝对值,不管议员组成。另一侧,BCAR更大的区别和可以注意到,这最负的了国会议员。附近地区和ZEAX焓熵补偿更明显比两个胡萝卜素。特别是,当ACN = 47.5% (v / v)非常接近于0,这也发生BCAR(图3 (c))。

统计学意义的数据评估通过描述性统计与计算执行:相对标准偏差的回归范霍夫数据点总是低于1%。此外,多个比较t检验进行关键值在95%的概率评价的统计热力学量的变化之间的差别。这是误差的原因并没有报道,他们毫无意义的讨论结果。

我们的研究结果可以与叶黄素和胡萝卜素的分子结构(见图1)。特别是,他们反映的趋势弱极性物质驱逐,在吸附过程中,极性分子(即。、有机溶剂)和与其他极性的物种(即建立交互。,the octadecyl chains on the stationary phase) in order to maintain a favorable environment.

大大大观察LYC分子端基(即可以解释。,linear) of similar polarity and interactive characteristics with stationary phase which all contribute to a favorable change in the enthalpy associated with the phase transfer. The same did not happen with the other carotenoids considered in this work. The presence of rings (i.e., BCAR) and/or OH moieties (i.e., LUT and ZEAX) on the structures led to a less favorable在转会从移动到固定相。从这个分析也跟着LYC还负责的线性结构最大的观察项 。LYC发生一起的相转移相关损失这个分子的自由度。在分子吸附状态,假定的特权地位重叠烷基根和固定相上的烷基链是最大的。此外,一个完整的保留机制必须考虑到固定相组成(即。多余的等温线,见图S1在补充材料)。议员组成调查的基础上选择ACN过剩等温线:固定相上的最大ACN的浓度估计发生大约38% v / v,而另两个ACN内容被选中之前(即。,v / v)和之后(也就是28.5%。这个最大47.5%,v / v)。事实上,绝对的值和更小的数字3(一个)和3 (c),而最大的值出现ACN = 38% v / v(图3 (b))

这对附近地区发生和ZEAX极性BCAR不是非常不同于LYC同样对他们的溶解度发生。然而,在色谱保留分歧的原因可以归结于两个端环的存在的分子结构BCAR:这些末端基深刻影响分子在固定相上的安排。这是证明了的事实因为LYC(即最负面的价值。,见图3(一个)- - - - - -3 (c))。BCAR有值附近地区和ZEAX非常接近。为了充分理解保留模型,这些条件了要讨论的内容。这是有趣的观察,更多的极性分子,如附近地区和ZEAX(即。包含哦半个),提供了更多的负面值比BCAR(即。,enthalpy-entropy compensation). This ended up with smaller absolute显然比BCAR和这意味着,降低色谱保留。相反,LYC自由度(即最大的损失。,increasing order) upon the transfer from the mobile to the stationary phase. In two cases (see Figures3 (b)和3 (c))产生一个更大的焓熵补偿比附近地区和ZEAX,而只有在ACN = 28.5%(图3(一个))LYC稍微不那么负面比BCAR价值。附近地区的一个可能的原因描述热力学行为和ZEAX可以额外的熵减少发病的氢键相互作用哦,半个残余硅醇在固定相表面:羟基的作用在叶黄素和他们与固定相交互的方式与变化和附近地区和ZEAX议员的甲醇量。甲醇可以作为竞争对手附近地区和ZEAX这是流动相组成的原因是另一个需要考虑的重要变量。尽管给定影响热力学量流动相的相对量的甲醇可以预期,如果数据3(一个)- - - - - -3 (c)比较,对附近地区只有一个非常小的影响,ZEAX, BCAR将观察到的。自ACN相对量在议员调查在ACN的最大吸收,这些议员组成产生很少或甚至没有影响和 。LYC的变化和是更复杂的。当单独来看,焓和熵的变化随过剩等温线乙腈:最大在ACN = 38%(绝对)值和较低的(绝对)数量在ACN = 28.5%和47.5%。的绝对值随着ACN的增加下降:当ACN = 38%,变得稍微积极;当ACN = 47.5%,基本上是等于零(即。熵,焓/补偿)。这种效应可以主张一个可能的解释就是明证,如图S3(补充材料)。通过绘制与 ,线性的数据可以在附近地区的情况下,注意到ZEAX, LYC和,因此,这些化合物焓/熵补偿效应,影响最终似乎是合理的值。此外,同样的情节丝毫没有熵焓/补偿,或者至少在一个不同的级别从其他三个化合物。

5。结论

传统范霍夫分析应用于类胡萝卜素的研究已经证明,至少在四个调查的,有一个严格的他们的分子结构之间的相关性和C18柱上的色谱行为。由于其结构的存在与否哦半个,叶黄素(附近地区和ZEAX)或胡萝卜素(LYC和BCAR)表现出完全不同的特性和色谱行为可以解释的基础上观察到的向左反应吉布斯自由能和熵的贡献的溶质传输从移动到固定相。值得指出的是,关于保留上结构特性的影响的结论是基于四个化合物的行为,因此,推广到其他类胡萝卜素不能想当然。

特别是,线性结构的LYC负责最大(绝对值)吸附熵和焓的变化。通过改变温度可以反转洗脱顺序LYC和BCAR之间。从热力学角度来看,十八基硅选择性分离附近地区和ZEAX不够,由于相互作用哦半个不发生直接在C18链,但也许是次要的,非特定的相互作用存在,因为免费的二氧化硅表面硅醇。

数据可用性

色谱数据用于支持本研究的结果都包含在这篇文章,在补充信息文件。色谱生和阐述了数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究的部分资金由选票的地区在农村发展计划2014 - 2020相机会16.1.01-GO EIP-Agri-FA 5 c,公关,“BIOFACE”和协调CRPV和实验室Terra &水技术,能源和环境的集群成员,Technopole费拉拉的选票高技术网络(POR-FESR 2014 - 2020)。作者感谢这场金融支持。这项工作也一直支持的费拉拉大学作为当地资助机构(2018年为止)。

补充材料

这部分包括一个简短描述等温线过剩的理论背景,以及它如何可以通过实验测量。测量的多余的等温线图S1)显示在固定相的流动相乙腈。之间的高效液相色谱分离图S2报告一个示例四类胡萝卜素,本研究的对象。然后,图S3包括范霍夫测量的数据分析(例如,和 )实验证据的焓熵补偿叶黄素、玉米黄质,和番茄红素,但不是 - - - - - -胡萝卜素。(补充材料)