船体的化学和药理学评估Prunus Dulcis.坚果

抽象的

研究人员发现，杏仁壳(通常在坚果被利用后被浪费掉)含有一些生物活性化合物，而目前的研究正是基于这些化合物进行的。重点研究了分析物的质谱测定以及70%乙醇提取物中总多酚和总黄酮的含量。70%乙醇提取物在正己烷、氯仿、乙酸乙酯、n对其抗氧化、抗糖尿病和抗菌活性进行了评价。结果表明，总多酚类化合物为没食子酸当量(1% w/w)，总黄酮含量为槲皮素当量(0.2% w/w)。质谱分析鉴定了15个化合物，其中包括儿茶素、绿原酸、山奈酚、异鼠李素及其苷、熊果酸、杏仁内酯和苯甲酸衍生物。抗氧化活性实验表明，黄芩提取物的抗氧化活性最高n-丁醇萃取物，用IC测定₅₀值为76.04μ.g/ml，而己烷和氯仿提取物对PTP1B酶有较强的抑制作用₅₀值9.66μ.g / ml和37.95 μ.胃肠/ ml分别。己烷和氯仿馏分是活性的金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为9 mm和12 mm。

1.介绍

来自水果和蔬菜的船体和果皮被认为是获得酚类化合物如酚类化合物的源于抗氧化活性以及其他药理学活动[1- - - - - -4］．自从它们的各种营养和药理价值作为小吃或制造加工食品的组成部分以来已经使用了杏仁坚果[2］．杏仁壳被去除用于坚果的利用，在少数情况下，杏仁壳被浪费而不作任何用途或用作原料。研究人员已经证明，杏仁壳是杏仁坚果的宝贵副产品，其中包含许多生物活性化合物，如三萜类、酚类化合物及其衍生物。在三萜中，已鉴定出白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸，约占壳体的1% [5］．在杏仁壳中据报道了香兰-3-醇，肉桂酸和羟基苯甲酸[1，5，6］．糖基化的黄酮醇，如rhamnetin或isorhamnetin糖苷，槲皮素糖苷，kaempferol糖苷[1，7]和绿原酸及其衍生物[5]已经在杏仁壳的提取物中被鉴定。杏仁壳的挥发性成分也被研究过[8，9］．

本文对中国喀什地区采集的杏仁壳进行了研究。采用HPLC-MS/MS对70%乙醇提取物中的总多酚和总黄酮进行定量分析，并对化合物进行鉴定。并对所得提取物的抗氧化和抗菌活性进行了评价。

2.材料和方法

2.1。化学品和试剂

槲皮素(98%)、没食子酸(≥97%)、氯化铝、醋酸钠、Folin-Ciocalteu试剂(2 N)、DPPH、EDTA和维生素C购自Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim)。无水乙醇，甲醇，正己烷，氯仿，乙酸乙酯n- 丁醇是从天津白石化学公司（PVT），中国乌鲁木齐的。所有化学品和试剂都是分析级，在整个实验中使用双蒸馏水。

２.２.收集杏仁水果

杏仁水果(Prunus Dulcis.)是从中国喀什哈的一个杏仁农场获得的。果实经鉴定，代金券样品保存于中国科学院新疆理化技术研究所植物标本馆乌鲁木齐830011。船壳被移除，并通过中国澳立邦的粉碎机(型号:500A)粉碎成粒径为50-300目的粉末。

２.３.提取

杏仁壳粉末用70％乙醇萃取，植物对溶剂比为1：10，在室温下24小时，并重复萃取三次。将合并的提取物在50℃下真空降低至干燥度。将干燥的70％乙醇提取物悬浮在500ml水中，并依次用己烷（3×500mL），氯仿（3×500mL），乙酸乙酯（3×500mL）脱落，和n- 制备己烷，氯仿，乙酸乙酯和乙酸丁醇（3×500mL）和n丁醇分数。剩下的是水提取物。数字1给出了提取、分离杏仁壳粉的工艺流程图。

２.４.总多酚类化合物和总黄酮的测定

将干燥的杏仁壳70%乙醇提取物1克，在20 ml 70%甲醇中重新提取，用于总多酚类化合物和总黄酮含量的测定。Folin-Ciocalteu方法发表于文献[10.，11.)是用于估计总多酚化合物如下:FC试剂(2 N)是第一次用水稀释的比例1:10,然后5毫升的稀释FC试剂完全混合1毫升的空白(水),提取,分别在试管和工作标准的解决方案。反应8分钟后，加入4毫升钠₂有限公司_3.将溶液（7.5％）加入每个混合物中并充分混合。将样品在室温下保存2小时，远离强光。通过使用UV可见的分光光度计，在740nm处以740nm的制备的坯料读取这些测试溶液的吸光度。用作参考标准，用作参考标准，在水中浓度范围为0.02mg / ml至0.2mg / ml的工作标准。

采用已发表文献所述的方法测定总黄酮含量[11.，12.］．取1 g干提取物，用20 ml 70%乙醇复溶，真空干燥。将得到的残渣溶解在10ml甲醇中，用于进一步实验。将植物提取物、工作标准液和空白(甲醇)各0.5 ml加入1.5 ml甲醇，置于试管中。在提取液/标准试管中依次加入10%氯化铝(0.1 ml)、1m醋酸钾(0.1 ml)和蒸馏水(2.8 ml)制备类黄酮-铝复合物。溶液在每一步完全混合，30分钟后在415 nm处用紫外-可见分光光度计测量反应混合物的吸光度。在甲醇中制备浓度范围为0.01 mg/ml ~ 0.1 mg/ml的槲皮素工作标准溶液。

2．5．HPLC-MS / MS分析

通过来自AB Sciex的ISI界面连接到LC系统的线性离子阱质谱仪（4000 Q陷阱）对70％乙醇提取物进行分析。分析师1.5软件用于控制LC-ESI-MS。将样品在反相色谱柱上进行色谱分离（Xbridge™C18，粒径5 μ.M, 4.6 × 150 mm带护柱)。流动相为A(1%甲酸水溶液)和B(1%甲酸乙腈)。保持柱温为室温，流速为0.5 ml / min。梯度洗脱以5% B开始，30分钟后提高到60% B。将流动相的浓度改变为100% B至35分钟，并在100% B保持5分钟。整个分析在40分钟内完成。质谱在负电离模式下操作，扫描在米/z质量范围从100到2000。20毫升(20μ.l）将样品注入色谱柱。

2.6。抗氧化剂和抗糖尿病活动

根据文献中公布的程序测定DPPH（1,1-二苯基-2-富铬酰基）的所有提取物的抗氧化活性[13.，14.］．将提取物溶解在DMSO中，浓度为100ppm。将样品溶液（2.5mL）加入到96微孔板中。在每个孔中加入乙醇中0.3mm的0.3mm DPPH溶液，以产生测试溶液。DMSO（1mL）用作坯料溶液。通过将1mL DPPH溶液与DMSO（2.5mL）混合来制备阴性对照样品。使用抗坏血酸（维生素C）作为该测定中的阳性对照。将所有溶液在室温下保持在黑暗中30分钟。在517nm的波长下监测吸光度，半最大抑制浓度（IC₅₀使用观察到的吸光度值计算。

所有提取物的抗糖尿病活性根据文献中公布的程序采用PTP1B酶抑制法测定[15.］．通过将0.1g干燥的干酪溶解在1ml DMSO中来制备测试样品。1ml PTP1b蛋白质溶液（0.115mg / ml）和1 μ.将检测样品/阳性对照样品/DMSO的l加到包含178的96孔板中μ.以20 mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、150 mM NaCl和1 mM EDTA(乙二胺四乙酸)为缓冲液，将其混合均匀。96孔板在室温下孵育10 min，然后孵育20 minμ.加入l的pNPP溶液(35mm)。在25°C的黑暗中反应30分钟后，10μ.L 3 M NaOH溶液混合。使用Spectramax MD5（Molecular Devices，USA）在405nm波长下测定吸光度，并通过在没有PTP1b酶的35mM PNPP的非酶水解中测量405nm的吸光度的增加。抑制百分比（％）和IC₅₀计算价值。PTP1B抑制剂用作对照样品。

2.7。抗菌活性

使用琼脂孔扩散法测量粗提取物的抗微生物活性[16.，17.］．真菌和细菌病原体:念珠菌白葡萄酒（CA; ATCC10231），大肠杆菌(电子商务;ATCC11229),金黄色葡萄球菌（SA; ATCC6538），用氨苄青霉素钠盐和两性霉素B作为标准的该分析的指示菌株[18.］．将这些微生物无菌地接种到适当的液体介质中并在37℃下孵育。16小时后，将细胞以6000rpm离心10分钟，然后悬浮在无菌水中。在电镀之前将不同的细胞（1mL）加入到适当的琼脂培养基（100mL）中，并且使用琼脂孔制成孔。向这些孔中，加入具有100ppm浓度的提取物并随后在37℃下孵育24小时。通过测量微生物生长抑制区的直径来估计抑制区。值是从三个独立实验的平均值。

3。结果与讨论

3．1.总多酚类化合物和总黄酮含量

使用从校准曲线获得的回归方程计算总多酚化合物作为无碱酸等同物计算R²值为0.9956(图2）.从一式三份实验中获得的值平均，导致Poyphenolic化合物的总量为无碱化合物作为干燥提取物的1％w / w。

采用AlCl反应法测定总黄酮含量_3.提取液中含有游离黄酮类化合物，形成al -类黄酮复合物，在415 nm处吸收最大。观察槲皮素标准溶液在0.01 mg/mL ~ 0.1 mg/mL甲醇溶液中415 nm处的吸光度，使用MS Excel表格构建校准曲线(图)3.）.校正曲线R²获得0.9971，重复实验三次。这将总文体含量的平均值作为槲皮素当量作为0.2％w / w的干燥提取物递送。

3.2。HPLC-MS / MS分析

总离子色谱图如图所示4，而表格1通过LC-MS/MS分析显示了杏仁壳70%乙醇提取物中鉴定出的化合物及其峰保留时间、碎片形态和参考文献。根据所获得的分析物在给定保留时间的碎片模式与文献中所引用的碎片模式相匹配，对化合物的峰名进行了分配。

Protocatechuic酸在9.273分钟内达到峰值[m-H]^-离子在米/z具有MS的值153²片段at米/z109由于损失了44单位的质量，这可能是由于CO的去除₂来自伪分子离子[M-H-CO₂］^-．在10.051、10.687及13.658分钟发出[M-H]信号^-离子在米/z价值577给出了与(epi)儿茶素二聚体相似的碎片模式，这在文献中得到了证实。的主要片段组成的片段模式米/z值451是由于杂环裂变[M-C.₆H₆O_3.-H]^-， 425是由于反diels - alder解理[M-C]₈H₈O_3.-H]^-， 407是由于随后的脱水[M-C]₈H₈O_3.-H₂哦]^-289是由于[M ._{（EPI）儿茶素}-H]^-．

三聚儿茶素(epi)出现在10.616与[M-H]^-离子在米/z价值865。碎片模式中的主要片段如下米/z价值738 (mc₆H₆O_3.-H]^-713 (mc₈H₈O_3.-H]^-和695 [M-C .₈H₈O_3.-H₂哦]^-和跨劳动力债券破损产生离子米/z577和289. 11.099,28.821和29.672分钟的峰值归因于[M-H]的（EPI）儿茶素^-离子在米/z价值289。含[M-H]绿原酸^-离子在米/z值353在11.704分钟出现，在米/z335由于水分子的去除。22.167 min的峰为3-丙烯酰-4- o -β- 用[M-H] - 凝集吡喃糖基氧基-4-羟基苯甲酸^-离子在米/z价值367.基于[M-H]^-离子及其碎片模式，分别分别分配给Kaempferol rhamnoside和Kaempferol葡糖苷的峰值在13.048分钟和14.893分钟。Isorhamnetin Rutinoside和Isorhamnetin在16.119分钟和16.187分钟内发出信号。

峰值在20.207 min时出现单水合绿原酸的破碎模式。(mh)^-离子在米/z值371是由于气原酸的水合分子，其中损失了18 m.u的质量。（水分子）为此产生信号米/z值353，即绿原酸的值。山奈酚在21.258处有峰，(epi)儿茶素二水合分子在23.085和26.093 min有峰，显示信号米/z值325，连续损失为18 m.u.，在307和289处产生信号。单液水合（EPI）儿茶素出现在26.02,26.582和29.725分钟。将31.371分钟的峰分配给熊胆酸[m-h]^-离子在455，而37.803和39.084分钟的峰具有类似于杏仁酮的碎片模式，产生[M-H]^-离子米/z295。

除了二聚体、三聚体和水合儿茶素衍生物外，表中所示的所有化合物都已在杏仁壳中被鉴定出来。在以往已在杏仁壳中鉴定出的白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸三萜中，我们只能鉴定出熊果酸。熊果酸具有抗肿瘤、抗炎、抗高脂血症、抗hiv、保肝等多种药理活性[2，6］．

３．３．药理作用

3.3.1。抗氧化活性

DPPH是一种稳定的激进，主要用于评估抗氧化活性。它在波长517nm处具有特征吸收，在暴露于某些激进的清除剂时减少。波长517 nm处的较低吸收提供下部IC₅₀表示活动增强的值。采用DPPH法检测7个样品/提取物的抗氧化活性。与维生素C标准品相比，所有样品的抗自由基活性都很低₅₀价值5.34μ.克/毫升(表2）.在样品中，n-丁醇馏分对IC的活性最高₅₀价值76.04μ.克/毫升。我知道了₅₀氯仿，乙酸乙酯和70％乙醇提取物的值为128.17,148.32和167.11 μ.胃肠/ ml分别。我知道了₅₀正己烷和水馏分的值超过500μ.克/毫升。

3.3.2。抗糖尿病的活动

使用蛋白质酪氨酸磷酸酶-1b（PTP1b）抑制作用测定抗糖尿病活性。己烷和氯仿馏分呈IC显示抗糖尿病（PTP1B抑制）活性₅₀9.66μ.g / ml和37.95 μ.分别为g / ml(表2）.PTP1B抑制剂对IC有抑制作用₅₀1.46μ.克/毫升。其余提取物无活性。

3.3.3。抗菌活动

所有7个样本都对3种微生物菌株进行了筛选:念珠菌白葡萄酒（CA; ATCC10231;真菌），大肠杆菌(电子商务;ATCC11229;革兰氏阴性细菌),金黄色葡萄球菌(SA);ATCC6538;以氨苄西林钠盐和两性霉素B为标准品。正己烷和氯仿组分对SA的抑菌圈直径分别为9 mm和12 mm，而标准氨苄西林钠盐的抑菌圈直径为19 mm。

4。结论

这些分析证实，杏仁废物，即船体是一种丰富的药理活性代谢物源，基于船体可用于各种药物制剂。此外，用于获得这些化学物质的船体也可以降低这些船体浪费的成本，用于生产基于杏仁的产品的行业。

数据可用性

壳体的化学分析和药理评估数据Prunus Dulcis.用于支持本研究结果的坚果包括在文章中。

利益冲突

作者宣布本文出版物没有利益冲突。

致谢

This study was funded by the Projects of the International Cooperation and Exchange of the National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31110103908), President’s International Fellowship Initiative (Grant no. 2019PB0043), and the Central Asian Drug Discovery and Development Centre of Chinese Academy of Sciences (Grant no. CAM 201808). The authors acknowledge the Chinese Academy of Sciences for providing postdoctoral fellowships during the course of study.

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