文摘

一个简单ultraperformance液体chromatography-tandem质谱测定人类唾液皮质醇水平测量的开发和验证。唾液样本含皮质醇上升与tolperisone内部标准(是)和甲基叔丁基醚的混合物和己烷提取(宣告,v, v)。溶剂蒸发后,残留于100年重组μl流动相。分析了亚特兰蒂斯dC18列(2.1×100毫米,3μ米颗粒大小)组成的流动相乙腈和2毫米醋酸铵(50:50,v, v)和交货0.3毫升/分钟的流量。质谱进行收购与多个反应监测在正离子模式下皮质醇和(m / z: 363.1→121.0和246.0→97.9,分别)。皮质醇和保留时间是1.35和2.45分钟,分别。皮质醇水平和峰面积比之间的关系是线性的皮质醇0.5 -100 ng / ml的范围。内部,interday变异系数和偏差≤9.0%,≤12.0%,分别。意思是提取复苏的皮质醇和从唾液样本分别为92%和94%,分别。使用方法,发现皮质醇≥86%稳定在加工(24小时在室温下或48小时在-20°C),≥91%稳定在未加工(24小时在室温下或20周在-20°C)唾液样本。此外,该方法成功地应用于确定每日皮质醇在健康志愿者的唾液样本。

1。介绍

皮质醇是一种类固醇荷尔蒙,它起着重要的作用在调节各种生理和病理过程,包括免疫反应,电解质平衡,血压,和新陈代谢等(1,2]。皮质醇水平测量生物流体用于疾病的诊断肾上腺、垂体和下丘脑功能,包括库兴氏综合征和阿狄森氏病3,4]。

唾液样本测量的皮质醇水平尤其有吸引力,因为它反映了生物活性皮质醇和样本可以获得无压力(5,6]。几项研究评估唾液皮质醇水平,用放射免疫检定法(RIA) [7,8)、酶免疫测定(EIA) (9- - - - - -11),高效液相色谱法(HPLC) [12,13),或液体chromatography-tandem质谱(质/ MS) (14- - - - - -17]。唾液皮质醇水平衡量RIA强烈与水平来衡量一个高度敏感性环评相关(r = 0.98, P < 0.001) [11)和质/女士(r = 0.99, P < 0.01) (15]。然而,尽管免疫测定灵敏度高,他们经常遭受低选择性由于相关物质(大18]。另一方面大多数报道质/ MS分析是基于固相萃取(15,17)和/或使用deuterium-labeled皮质醇作为内部标准(是)14,16),这可能在某些临床实验室不可行。

在这里,我们描述一个简单、精确和快速ultraperformance液体chromatography-tandem质谱(UPLC-MS / MS)测定测定唾液皮质醇水平在人类使用tolperisone作为内部标准(是)。验证该方法根据美国FDA指南(19),用于确定唾液中皮质醇的稳定性在不同临床实验室条件和应用监控的皮质醇水平从健康志愿者唾液样本收集。

2。实验

2.1。化学药品和试剂

所有的化学试剂均为分析纯,除非否则。氢化可的松(皮质醇)和tolperisone从穿越购买有机食品,新泽西,美国Sigma-Aldrich,密苏里州,美国。醋酸铵,甲基叔丁基醚、己烷和乙腈(高效液相色谱级)购买的费舍尔科学,新泽西,美国。高效液相色谱级水是由反渗透,进一步纯化,通过协同水净化系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。这项研究是研究伦理委员会批准国王费萨尔专家医院和研究中心,利雅得,沙特阿拉伯,在研究咨询委员会(RAC # 2160008)。

2.2。仪器及色谱条件

液相色谱串联质谱仪(质/ MS)由Xevo-TQD探测器配备Z-spray、一个大气压电离接口(API), Acquity UPLC h级系统,集成的溶剂,和样品管理器(水公司,米尔福德,妈,美国)。分析了在室温下使用反相亚特兰蒂斯dC18列(2.1×100毫米,3μ米粒子大小),钢柱列警卫保护管路过滤器(2毫米,0.2μ米),流动相是由2毫米醋酸铵和乙腈(50:50,v, v)。这是过滤使用(47毫米,0.2μ孔隙大小)苏泊尔膜盘过滤(美国MI笼罩Gelman实验室)和交货0.3毫升/分钟的流量。电喷雾电离(ESI)来源是在正离子模式下运营的毛细管电压1.5 kV和锥36 V的电压。氮是用作喷洒和反溶剂气体的流量1000升/小时。氩作为碰撞气体细胞压力维持在3.6 E⁻⁰⁰³mbar。一个最佳的碰撞能量的20应用皮质醇和电动汽车。离子源和反溶剂温度维持在150°C和500°C,分别。皮质醇在正离子模式下检测和量化;产品离子响应测量multireaction监测(MRM)模式设置转换质量(m / z)收费363.1→121.0和246.0→97.9,分别。质量猞猁版本4.1(水公司,米尔福德,妈,美国)软件在微软窗口XP专业环境下工作是用来控制仪器参数,数据采集、集成、峰值平滑、峰值和信噪比的测量。

2.3。准备的标准和控制样品

皮质醇和股票的解决方案准备在甲醇(1.0μg / ml)。九校准标准0.5 -100 ng / ml的范围和四个质量控制浓度(0.5,1.5,50和90 ng / ml)准备在正常的人类唾液。工作方案(20 ng / ml)准备在水里。整除(1.0毫升)的唾液样本被转移到7毫升玻璃文化管和储存在-20°C到使用。

2.4。唾液样本校准标准和控制

如果健康志愿者收集他们的唾液样本,通过直接吐在无菌(110毫米×28毫米dia)康宁50毫升离心管(美国Sigma-Aldrich)和存储在-20°C到分析。

2.5。准备样品

50μl工作的解决方案(20 ng / ml)添加到每个1.0毫升未知的唾液样本,校准标准,或质量控制样品在7毫升玻璃文化管和涡流,持续30秒。4.0毫升甲基叔丁基醚和己烷的混合物(,v, v)补充说,涡两分钟,离心机在4000 rpm 15分钟20°C。上层清液明显层被转移到一个干净的硼硅酸盐文化管和干下温柔的蒸汽的氮在40°C。残留于100年重组μl流动相,2毫米醋酸铵和乙腈(50:50,v, v)和10μl的明显的解决方案是注入到质/ MS系统。

2.6。提取复苏

提取复苏的皮质醇测定皮质醇峰地区两个样本进行比较。在一个样本空白唾液与皮质醇上升,然后提取。在第二个示例中,空白的唾液提取,然后用相同数量的皮质醇上升。这样做是在四个复制四个浓度(0.5,1.5,50和90 ng / ml)。复苏的决心以相同的方式在20 ng / ml的浓度。提取复苏计算意味着皮质醇(或者是)在spiked-before-extraction样品峰面积除以意味着在spiked-after-extraction皮质醇(或者是)峰面积乘以100。

2.7。稳定性研究

两个QC样品浓度(1.5和90 ng / ml)在唾液被用于稳定研究。5整除的每个浓度提取并立即分析(基线)。5整除的浓度被允许站在桌上型在室温下24小时;五整除储存在-20°C 20周,前处理和分析;和五整除加工和储存在室温下24小时或-20°C分析前48小时。15整除的集中储存在−20°C 24小时。然后他们被完全无助的在室温下解冻。分析了五整除,其余储存在为另一个24小时-20°C。这个循环重复了三次。

2.8。计算

为了正确的内生“空白”唾液皮质醇水平,我们用峰面积比值的差异之间连续浓度的响应(而不是峰面积比)20.]。峰面积比的不同对浓度绘制。计算偏差(%)是测量之间的差异和名义浓度除以名义浓度乘以100,而变异系数(%)是计算标准差除以平均浓度乘以100。

2.9。基体效应

基体效应的峰值区域评估通过比较提取空白唾液皮质醇在当时越来越多四个浓度(0.5,1.5,50和90 ng / ml), (20 ng / ml)与相应的峰值区域获得的直接喷射流动相的标准解决方案准备。

2.10。方法验证

方法验证(特异性、复苏、线性、准确性、精度和稳定性)根据美国食品和药物管理局(FDA)生物分析方法验证指导(19]。

2.11。从一个健康志愿者唾液样本

约4.0毫升唾液样本收集20 - 30分钟内通过直接吐在无菌康宁50毫升离心管。样本收集从四点半开始,10点,下午15:30,7:30,22:00小时休息一天和一个工作天,储存在-20°C到分析。

3所示。结果

3.1。分离和量化

图1描述了化学结构的皮质醇和tolperisone(是)。液相色谱(LC)条件优化使用2毫米醋酸铵和组成的流动相乙腈(50:50,v, v)流量0.3毫升/分钟。乙腈的比例相对较高的促进列低背压和运行时间短(< 3.0分钟)。产品和前体离子注入标准测定皮质醇和tolperisone(1.0的混合物μ克/毫升甲醇)在质谱仪使用配置软件程序(IntelliStart,从水公司,米尔福德,妈,美国)。皮质醇和每个生产两个产品离子峰:363.1→121.0或363.1→97和246.0→97.9或246.0→69.9,分别。363.1→121.0过渡为皮质醇和过渡246.0→97.9被选出的是量化的皮质醇水平,因为他们给了最好的回应。图2描述了总离子电流(TIC)和皮质醇和MRM色谱。

3.2。基体效应

基体效应是常见的在大气压电离质/ MS分析。它主要是由于分子的干扰来自样本矩阵与感兴趣的化合物(s) coelute电离过程中,导致电离抑制或增强。基体效应,通常±15%,被认为是微不足道的(21,22]。基体效应是一个离子抑制皮质醇和的-9.7%和-13.7%,分别。

3.3。特异性

试验的特异性是由人类唾液筛选六个不同批次的空白,除了七cortisol-related化合物(孕激素可的松,17α——羟基孕激素强的松、强的松甲基强的松,睾酮)。所有的解决方案都是1.0μ克/毫升甲醇:水(1:1,v, v)和10μl是注入系统。没有干扰峰的皮质醇或。图3描述了代表人类唾液的色谱用于制备校准曲线和质量控制样品。

3.4。复苏

结果提取复苏的皮质醇和展示在表1。意味着皮质醇萃取回收率分别为92%和94%。

3.5。线性和极限的检测和量化

线性分析是评估通过分析一系列的皮质醇水平在九个不同浓度的范围0.5 -100 ng / ml的唾液。相应的峰面积比值和浓度进行回归分析。意味着方程获得八个标准曲线是y = 0.0188 (x) + 0.0117,与R²(SD) = 0.9960 (0.0039)。检测和量化限制为0.3 ng / ml和0.5 ng / ml,分别。图4女士代表UPLC-MS /色谱4 QC样品(0.5,1.5,50和90 ng / ml)服用的20 ng / ml。

3.6。精度和偏差

盘中interday精度和偏见(表2)进行评估通过分析四个QC样品(0.5,1.5,50和90 ng / ml)。盘中精度和偏见(n = 10)范围从2.4%到9.0%,从-5.5%提高到12.0%,分别。interday精度和偏差测定三种不同天(n = 20)。范围从3.9%到8.4%,从-2.0%提高到10.3%,分别。

3.7。稳定

皮质醇和稳定的加工和未加工的唾液样本调查(表3)。皮质醇在加工样品被发现在室温下稳定24小时(≥88%)和48小时−20°C (86%)。皮质醇在未处理的样品在室温下稳定至少24小时(≥92%),20周−20°C(≥91%),和三个冻融循环后(≥93%)。此外,皮质醇的色谱行为无显著变化,或者是在以上条件下观察到。

3.8。应用程序的方法

该方法用于确定唾液皮质醇在健康的志愿者在两个不同的日子。结果呈现在图5。正如所料,清晨皮质醇水平最高和拒绝不可测的水平10点到10:30。

4所示。讨论

测量的皮质醇水平中发挥着重要作用的诊断肾上腺功能障碍以及学习相关生理条件(1- - - - - -4]。已报告的液相色谱方法对皮质醇测定在各种生物矩阵(23,24]。测量唾液皮质醇水平在其他矩阵有几个优点,包括方便样本收集,避免压力与静脉穿刺和测量生物活性皮质醇水平而不是总皮质醇水平(5]。

很少有质/ MS-based化验报告唾液中皮质醇测定(14- - - - - -17];他们用固相萃取和/或deuterium-labeled皮质醇。一般deuterium-labeled分析物被用作质/ MS分析,因为他们允许相同的碎片和化验分析物。然而,进步质/ MS软件允许non-deuterium-labeled空间站的成功使用。我们选择使用类似的化学化合物皮质醇,tolperisone,作为一个。Tolperisone给主要碎片碰撞能量的峰值响应16 eV相比20 eV皮质醇。然而,20电动汽车碰撞能量产生可靠的和一致的结果,因此被选中。

我们使用一个简单的样品制备液液萃取。液液萃取是一个经典的方法,广泛用于样品制备进行定性和定量分析。它的主要优点是成本低,因为它不需要昂贵的设备相比,固相萃取。

唾液皮质醇水平范围从0.6至15 ng / ml (1.5 -40 nmol / L)当用免疫测定(7]。尽管免疫测定是高度敏感的,他们经常遭受大cortisol-related化合物。事实上,通过分析皮质醇水平高2.7倍比获得的质/女士[16]。使用当前的分析,我们发现,皮质醇水平大约是3.5 ng / ml清晨和晚上拒绝不可测的水平,与之前的报道相一致(25]。

5。结论

UPLC-MS描述/ MS方法简单、精确,并准确快速测量的人类使用1.0毫升唾液皮质醇水平。该方法使用现成的内部标准,并成功地用于确定皮质醇在各种实验室条件下稳定。进一步,它已成功应用于确定唾液皮质醇水平样本来自一个健康志愿者。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

赛义德·n·艾尔维执行实验,分析数据,并起草了手稿。默罕默德·m·Hammami批判性审查数据,修订后的手稿。