文摘

一些草药治疗的各种处理方法,以确保他们的安全、有效使用。然而,对于大多数中药毒性降低的化学基础尚不清楚。狼毒种群l,particularly the root (ruixianglangdu), is toxic. Thus, ruixianglangdu is commonly processed with vinegar or milk to reduce toxicity. Here, with help of multiple-ion monitoring (MIM)-based metabolomics, we comprehensively capture chemical information of ruixianglangdu. Then, 33 differential components between crude drugs and processed products were identified or tentatively characterized by multiple-ion monitoring–information dependent acquiring–enhanced product ion (MIM-IDA-EPI), whose level changed after being processed by vinegar or milk. It was found that flavonoids especially biflavonones could be the important chemical basis of toxicity reduction for processed ruixianglangdu. In addition, some coumarins and lignanoids could also play a role in reducing toxicity. It is believed that MIM-based metabolomics method was valuable for exploring chemical basis of toxicity reduction for processing. The data is critical to further study the mechanism of toxicity reducing for processed ruixianglangdu.

1。介绍

中草药材料的处理是一个制药技术基于中药(TCM)理论,旨在提高疗效和/或减少原油的毒性药物(1]。草药,许多处理方法可以用来减少原油的毒性药物根据不同的临床经验。然而,对于大多数中药化学毒性降低的基础尚不清楚。因为多个组件的草药,探索化学基础广泛抑制通过全面、准确地捕捉信息在复杂多组分样品。

狼毒种群l是一个属于瑞香科的多年生草本开花植物,原产于俄罗斯,中国,蒙古(2]。Ruixianglangdu,根狼毒种群l . (ruixianglangdu),是中医最常用的治疗疖痈和结核病的淋巴结,多种多样的生物活性,包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗炎活动(3- - - - - -5]。Ruixianglangdu毒药甚至杀死牛如果误摄入6]。现在,一些处理方法已经用来减弱ruixianglangdu毒性。处理牛奶是蒙古医学的特殊处理方法(7]。Ruixianglangdu处理最佳的醋是药典[描述的处理方法8]。他们都是代表ruixianglangdu的处理方法。

当前的方法包括薄层色谱法(TLC)和高效液相chromatography-ultraviolet分光光度法(HPLC-UV)用于测定多个组件在ruixianglangdu及其加工产品是不够的选择性和准确9,10]。他们只专注于总组件或几个组件,它不能全面探索多个组件的变化。高效液相色谱法,分析时间长,峰决议不确定多个组件。同时,多个组件的HPLC-UV分析受到低灵敏度和低信噪比的影响。因此,ultraperformance液体chromatography-triple四极串联质谱(UPLC-MS / MS)方法,使用不同的多反应监测(MRM)通道同时,将理论上适合同时量化的多个组件在复杂的矩阵。多离子监测(MIM)可以使用的情况下,MS / MS诊断片段是相同的,在强度和父离子的选择性(11,12]。到目前为止,使用MIM的代谢组学方法已经成功地应用于发现生物标志物在等离子体中,大米等等(13,14]。此外,MIM也被用来确定一些化合物在生物样品,如双环醇和肽,与可接受的精度、灵敏度和选择性15,16]。

在这项研究中,一个MIM-based代谢组学方法应用于探索化学毒性降低的基础加工ruixianglangdu使用质/女士配备一个应急服务国际公司的来源。在这里,我们使用原始ruixianglangdu和两个不同的程序处理ruixianglangdu(加工用醋或牛奶),为例。三个步骤包括探索降低毒性的化学基础:MIM-based代谢组学应用全面获取化学信息的样本;天然药之间的微分组件的分析,产品是由多离子监控信息依赖acquiring-enhanced产品离子(MIM-IDA-EPI)。

2。实验

2.1。试剂和化学物质

Neochamaejasmin从上海购买Jianglai生物科技有限公司(上海,中国)。Neochamaejasmin B, isochamaejasmin, daphnoretin购买从成都Chroma-Biotechnology有限公司有限公司(四川,中国)。四个标准的纯度> 95%。谷氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸从美国国立购买食品和药物控制(中国,北京)。HPLC-grade乙腈与霍尼韦尔(莫里斯,美国)和甲酸(高效液相色谱级)Sigma-Aldrich (Steinheim、德国)购买。米醋和新鲜牛奶是来自佛山海天调味食品有限公司(中国)和伊利(内蒙古伊利实业集团有限公司,中国),分别。超纯水制备使用Milli-Q SP系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。

2.2。植物材料和样品制备

Ruixianglangdu在安国采购购买(河北,中国)和确定桂花崔博士使用形态学和组织学方法,沉积在中药学研究所。生ruixianglangdu被醋和牛奶加工获得3加工产品。350克生ruixianglangdu与米醋或新鲜牛奶混合,浸泡6小时,然后煮30分钟,最后干。最终,6批样品均获得后续分析。

根据中医的使用,生的或加工产品(50克)和500毫升水,煮30分钟和大多数溶剂通过沸腾了。然后收集整个上层清液,用水稀释至100毫升,通过0.22毫米过滤器。滤液被储存在4°C在冰箱前质分析。

2.3。质分析

一个海域ACQUITY UPLC-QTRAP™5500质谱仪用于执行多离子监控信息依赖acquiring-enhanced离子(MIM-IDA-EPI)和MIM产品。美国一个水域ACQUITY UPLC(水域)配备一个二进制溶剂输送系统、autosampler和柱室使用。执行检测使用QTRAP™5500系统从应用生物系统公司/ MDS Sciex(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),混合三重四极线性离子阱质谱仪。仪器操作使用一个电喷雾电离(ESI)来源。离子喷雾电压设置为5.5 kV,和涡轮喷射温度维持在550°C。喷雾器气体(天然气1)和加热气体(天然气2)在50岁及50ψ,分别。窗帘气体是保持在35 psi和加热器的接口。氮作为喷雾器和辅助气体。逐步采用MIM在正面和负面的扫描,3扫描从m / z51,m / z350年,从m / z351年到m / z650年,从m / z651年到m / z950年,分别与质量步骤1.0 Da和停留时间5毫秒。三百年MIM在单个运行得到的转换。declustering势(DP)和碰撞能量(CE)的每个MIM设定在60 V和5 eV,分别。获取碎片离子,离子超过5000 cps被用来触发收购EPI光谱。女士扫描函数控制分析软件(1.6.2版本)从应用生物系统公司/ MDS Sciex。

水域的色谱分离进行了高速钢C₁₈列(2.1×100毫米,1.8μ米列温度设定在40°C。水的流动相由含0.1%甲酸(A)和乙腈(B),与线性梯度洗脱流速0.3毫升/分钟。梯度程序如下:99 - 70%(清廉分钟);70 - 55%(10到25分钟);1%(25 - 30分钟);99% (30-33 min)。注射试样的体积是1μl

2.4。统计数据分析

PCA的得分图是用SIMCA-P 12.0版本软件(期刊Umetrics AB,瑞典)。此外,一个独立的学习任务(p< 0.01)(Microsoft Office Excel 2010)是用于确定处理的变化在统计学上不同的单变量分析层面。此外,一个独立的学习任务(p< 0.01)(Microsoft Office Excel 2010)是用于分析和原始之间的微分组件milk-processed ruixianglangdu。同时,原始之间的微分组件和vinegar-processed ruixianglangdu也分析和t检验。组件与统计差异都标有星号。

3所示。结果与讨论

3.1。代谢分析Ruixianglangdu

全球逐步分析扫描采用MIM在积极和消极模式分析6批次的原料,vinegar-processed,和milk-processed ruixianglangdu,分别。ruixianglangdu的色谱图所示1。色谱,离子峰很容易检测和峰值区域可以通过分析计算软件。扫描范围从离子峰m / z651年到m / z950年是比在扫描范围从相对较少m / z51,m / z650年,大多数组件之前筛选了13分钟。建议的大多数化合物与高极性亲水。1175离子与信噪比(S / N) > 10人,其中包括563离子积极模式和612年负离子模式。结果二维矩阵,包括配对m / z保留时间、样品名称、和1175离子峰面积,利用主成分分析法(PCA)分析了可视化聚类和趋势。如图2ruixianglangdu之间,可以观察到一个明显的分离趋势及其加工产品。和2种加工产品也明显分离的PCA。

3.2。在处理组件,改变的识别

过滤后的碎片离子和同位素离子,37组件发现在积极和26组件发现在负模式筛选,处理后不同牛奶或醋。碎片概要文件使用MIM-IDA-EPI改变成分的快速分析。最终,33个化合物被确定或ruixianglangdu初步特征,其水平变化被醋或加工后的牛奶。这些组件包括14个黄酮类化合物,5香豆素类,8 lignanoids 5氨基酸,1双萜。他们提出了表的详细信息1,如加合物离子碎片离子 ,和保留时间。到目前为止,22个化合物被分离和鉴定ruixianglangdu [2,17]。化合物9、10、12、19和28-32可以明确确定为neochamaejasmin, neochamaejasmin B, isochamaejasmin, daphnoretin,谷氨酸,异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸,苯丙氨酸,分别通过比较他们的保留时间,离子加合物和产品离子与真实的标准。结构表征过程的详细描述如下:

类黄酮化合物1被确认为epiafzelechin-7-O-glucoside [M + H]⁺m / z437.1,一系列的碎片离子[M + H-Glc]⁺m / z275.2,[M +高度差₂O-Glc-H₂O)⁺m / z257.2,和特点的碎片RDA乳沟139.0 m / z。的女士²黄酮类化合物的光谱(2号和4),离子在705.18 m / z分散离子[m + H-Glc]⁺m / z543.1。考虑到isochamaejasmin-7-O-glucoside被隔绝的根源狼毒种群化合物2和4,初步确定为isochamaejasmin / chamaejasmine / neochamaejasmin neochamaejasmin B-7-O-glucoside。基于[M + H]⁺m / z275.1,一系列的碎片离子[M +高度差₂O)⁺m / z257.2,RDA的碎片劈理特征m / z139.0,化合物3被确认为epiafzelechin。化合物5和6是初步确认为naringenin-epiafzelechin或naringenin-afzelechin同意[M + H]⁺m / z545.1。他们的女士²谱了碎片离子409.1 m / z, RDA乳沟的碎片m / z153.0。化合物7展出deprotonated分子[M + H]⁺m / z341.1。主要碎片离子[M +高度差₂O)⁺m / z323.2,[M +·hc·₅H₉]⁺m / z271.2,RDA乳沟的片段m / z137.0 MS / MS谱中所示。因此,它像8-prenylnaringenin初步确认。的女士²离子光谱复合8日m / z543.1离子支离破碎m / z345.1,失去一个分子的bis (4-hydroxyphenyl)甲烷,和m / z199.2。它被确认为chamaechromone。四个biflavonones(号。9、10、11和12)有一系列相同的碎片离子m / z449.0,391.1,311.2,153.0。的峰值m / z391.1和153.0与RDA乳沟。化合物9号、10和12被确认为neochamaejasmin neochamaejasmin B, isochamaejasmin相比标准。化合物11被确认为chamaejasmine由于类似的碎片离子化合物9,10,12。化合物13展出[M + H]⁺m / z557.1、主要碎片离子m / z449.0,和特征碎片m / z153.0,类似化合物9 - 12,它被认定为7-methoxylneochaejasmin a一系列碎片离子化合物14了m / z445.1,419.2,355.1,337.2。的峰值m / z419.2与RDA乳沟。化合物14初步确认为chamaejasmenin a所有14类黄酮化合物除外7被隔绝的根源狼毒种群l . (17- - - - - -23]。

香豆素类化合物15展出[M + H]⁺m / z193.1。基于主要碎片离子[M + H-CH₃哦)⁺m / z161.0,[M + H-CH₃OH-CO]⁺m / z133.0,[M + H-CH₃OH-2CO]⁺m / z105.0,这种化合物是初步分配给东莨菪亭。化合物16初步确认为umbelliferone葡萄糖苷,一系列的碎片离子[M + H-Glc]⁺m / z163.0和[M + H-Glc-CO₂]⁺m / z119.1。化合物17被确认为瑞香素[M + H]⁺m / z177.0和一系列的碎片离子[M-H-CO]^{- - - - - -}m / z149.0,[M-H-CO₂]^{- - - - - -}m / z133.0,[M-H-CO-CO₂]^{- - - - - -}m / z105.1。的女士²光谱的复合18 (mh)^{- - - - - -}m / z161.0的特征碎片离子m / z133.1、117.0和105.1,与[M-H-CO]^{- - - - - -},(M-H-CO₂]^{- - - - - -},(M-H-2CO)^{- - - - - -}。这是作为umbelliferone初步确认。复合19的MS / MS质谱[M + H]⁺m / z353.1 [M + H-CH的特定片段₃]⁺m / z338.2。这是确认daphnoretin相比标准。所有的5个香豆素类被隔绝的根源狼毒种群l . (21,24,25]。

Lignanoids基化合物20和22的峰值m / z359.2。化合物20和22初步确认为isolariciresinol-4 -O-glucoside isolariciresinol-9-O-glucoside,基于他们的极性。两个化合物(没有。21和23)有相同的(mh)^{- - - - - -}m / z523.2和特征碎片(M-H-Glc)⁺m / z361.3。根据他们不同的极性化合物21和23日初步确认secoisolariciresinol-4-O-glucoside secoisolariciresinol-9-O-glucoside,分别基于他们的极性。基于特征片段(M-H-Glc)^{- - - - - -}m / z357.2,与(mh)化合物24^{- - - - - -}m / z519.2 pinoresinol-4-O-glucoside初步确认。初步确认化合物25是aschantin与一系列碎片离子[M +高度差₂O)⁺m / z383.2和特征碎片离子m / z167.2。与[M + H]化合物26⁺m / z419.2初步确认为syringaresinol,分散离子[M +高度差₂O)⁺m / z401.1和[M + H-HOCH₃]⁺m / z387.1。初步确认化合物27是pinoresinol与[M + H]⁺m / z359.1和一系列的碎片离子[M +高度差₂O)⁺m / z341.2,[M + H-2H₂O)⁺m / z323.2,137.0和特征碎片离子m / z。只有3lignanoids(没有。24、26和27)被隔绝的根源狼毒种群l . (21,26]。

5个氨基酸化合物(28-32)经与标准进行比较。初步确认化合物33是stelleramacrin B与[M + H]⁺m / z613.3和特征碎片离子[M +·hc·₁₄H₂₄- h₂O)⁺m / z405.2,被隔绝的根源狼毒种群l . (20.]。

3.3。探索化学毒性减少处理的基础

提取离子色谱(XIC) 33的组件被发现显著改变被醋和牛奶加工后如图3。界的33个组件之间的原始和牛奶/ vinegar-processed ruixianglangdu。如图4,当原始ruixianglangdu处理醋,25组件表现出显著变化,包括11类黄酮(没有。1 - 4、7 - 9和11 - 14),4香豆素(没有。15和17 - 19),7 lignanoids(没有。20日至21日和汽车),2氨基酸(没有。28和29),1双萜。十一25组件进行了浓度降低后醋加工,包括8类黄酮(没有。2 - 4、8、11 - 14),1香豆素(没有。18),2 lignanoids(没有。21和24)。组件的变化比在原始vinegar-processed ruixianglangdu在0.3 ~ 2.9范围。 When raw ruixianglangdu was processed by milk, 26 components exhibited significant changes, including 13 flavonoids (no. 1-8, 10-14), 2 coumarins (no. 16 and 19), 5 lignanoids (no. 21, 22, 24, 25, and 27), 5 amino acids (no. 28-30), and 1 diterpenoid. Sixteen of the 26 components exhibited decreasing tendency, including 11 flavonoids (no. 2-6, 7, 10-14), 2 coumarins (no. 16 and 19), and 3 lignanoids (no. 21, 22, and 24). It is worth noting that 10 components underwent a concentration decrease after processing with both milk and vinegar, including 8 flavonoids (chamaejasmine-7-O-glucoside, epiafzelechin, neochamaejasmin A-7-O-glucopyranoside, chamaechromone, chamaejasmine, isochamaejasmin, 7-methoxylneochaejasmin A, and chamaejasmenin A) and 2 lignanoids. Decreased flavonoid could be due to the thermic treatment performed during the raw ruixianglangdu extraction. For example, total flavonoid content of sea buckthorn extract reduction of 90.04% was observed as a result of heating at 100°C after 25 min [27]。和五个总类黄酮也显著降低在90°C新鲜卡拉卡拉汁加热后120分钟(28]。槲皮素在水溶液也不稳定,黄酮醇的水溶液稳定性与b环替换(29日]。

总黄酮类化合物从狼毒种群有老鼠和兔子显示强烈的毒性30.]。Chamaechromone(没有。8)和isochamaejasmin(没有。12)是主要成分与细胞毒性ruixianglangdu犬肾脏MDCK细胞(31日,32]。香豆素daphnoretin(没有。19)被发现的细胞毒性成分Dirca occidentalis(瑞香科)33]。基于这些变化的组件和文学、加工ruixianglangdu,黄酮类化合物特别是biflavonones可以降低毒性的重要化学基础。此外,一些香豆素和lignanoids减少处理后也可以扮演一个角色在减少毒性。

而milk-processed ruixianglangdu组,10组件包括8类黄酮有较低水平的vinegar-processed ruixianglangdu组。推断,用牛奶加工方法可以更好的减少毒性ruixianglangdu。根据文献,斑马鱼胚胎的死亡率更高的治疗后vinegar-processed ruixianglangdu比milk-processed ruixianglangdu [34),这是符合我们的推论。

4所示。结论

MIM-based代谢组学的帮助,这项研究说明加工ruixianglangdu毒性降低的化学基础。黄酮类化合物特别是biflavonones可能是重要的化学毒性降低的基础。此外,一些香豆素和lignanoids减少处理后也可以扮演一个角色在减少毒性。与醋加工相比,用牛奶加工方法可以更好的减少毒性ruixianglangdu。相信MIM-based代谢组学方法的探索化学基础加工中药的毒性降低。进一步研究至关重要的数据加工ruixianglangdu减少毒性机制。

数据可用性

数据支持本研究的发现中可用的文章。本研究的原始数据和附加信息可从相应的作者的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

魏杨和小李马贡献同样这项工作。

确认

经济研究已经由北京自然科学基金(7174325)、国家科技重大项目(2015 zx09501004 - 003 - 005)和国家自然科学基金青年科学基金(81803722)。