基于比色纸的分析装置的设计与优化，用于快速检测草药中的Allopurinol

摘要

传统的草药在印尼仍然有很大的需求，并且在社会上很受欢迎。印度尼西亚政府规定，草药不应含有化学药物，因为不受控制的食用会产生毒性。别嘌呤醇是中药中常用的治疗慢性痛风的药物之一。基于纸张的分析装置是一种最新的分析形式，已被广泛用于化学元素、环境污染、细菌等的鉴定。本实验采用Whatman 1号、2号、4号滤纸和Whatman色谱为纸进行实验，检测9种比色试剂对中草药中别嘌呤醇的检测。与别嘌呤醇反应阳性的特异性试剂有5种，可应用于纸张的试剂只有3种，即Folin-Ciocalteu、Tollens和p-DAB试剂。优化结果表明，最佳浸泡时间为60分钟，干燥时间为30分钟，温度为50℃。每种滤纸都有不同的特性;而当所有纸张均作为PAD检测别嘌呤醇时，差异无统计学意义。

1.介绍

传统草药含有草药混合物或植物提取物，以保持健康和治疗疾病[1］.由于传统医学的使用增加了印度尼西亚社会，因此将化学药物添加到一些传统草药中以增强治疗效果。其中一个是Allopurinol，其添加到草药中进行痛风处理。与此同时，印度尼西亚卫生法规部门认为草药不应含有合成化学品或药用分离结果[2］.别嘌呤醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，用于降低血尿酸水平，常用于治疗慢性痛风[3.］.慢性痛风的特征是由于血液中尿酸含量过高而在关节处形成晶体[4.］.别嘌呤醇能抑制黄嘌呤氧化酶产生尿酸。长期服用别嘌呤醇会产生多种影响，特别是在不加控制的情况下。据报道，在住院患者中别嘌呤醇显示急性不良反应，如血液学异常、腹泻和药物热[5.］.因此，在草药中监测Allopurinol对于控制Allopurinol的潜在毒性是重要的。

几种分析方法，如分光光度法测定[6.]及高效液相色谱法[7.]用于别嘌呤醇的检测。由于这两种方法都具有选择性和灵敏度，它们需要昂贵的仪器，不能用于现场分析。用于检测中草药中化学药物的指示条或光学传感膜的发展日益壮大。一些研究人员使用聚合物作为基底材料[2那8.］.最近，基于纸质的分析装置（垫）吸引了相当大的关注，因为它是一种简单，低成本，易于使用的环境和生物学分析工具[9.-11.］.PAD在有机分子的现场分析中已变得有效[12.)、金属(9.]和杀虫剂[13.］.PAD中最常用的检测方法之一是比色法，使用特定试剂来识别和检测样品中的分析物[14.-16.］.

本工作筛选了9种比色试剂，以筛选出最佳的别嘌呤醇检测比色试剂。这九种比色试剂是根据别嘌呤醇上的官能团与一种通用试剂作为比色试剂的反应而选择的。它们是Dragendorff试剂，氯化铁，Folin-Ciocalteu试剂，硝普钠，p-DAB试剂，希夫试剂，氯酸钾，Tollens试剂，亚硝酸钠[17.那18.］.采用Dragendorff试剂、p-DAB试剂、重氮反应检测别嘌呤醇中的胺基。氯化铁被用来分析酚类化合物、脂肪酸或苯基吡唑。福林-西卡图用于分析酚类化合物和硝普钠中的酮类或乙醛。用Tollens和Schiff试剂检测醛和酮。丙二酸试验采用氯酸钾;本试验专门用于检测化合物中的黄嘌呤基团。这些试剂被筛选并应用于各种Whatman滤纸，包括Whatman No. 1, No. 4, No. 6和Whatman 1色谱。并对其选择性、敏感性及在中草药中的应用进行了研究。结果表明，该方法适用于中药中别嘌呤醇的检测。

2.材料和方法

所使用的所有化学物质都是分析级，它们被使用而无需进一步纯化。使用蒸馏水制成所有溶液。从南京药物化学厂获得Allopurinol。2-萘酚，氢氧化铵25％，盐酸37％，亚硝酸铋，乙醇95％，氯化氢，氢氧化钾，碘化钾，氢氧化钠，氯酸钾晶体，亚硝酸钠，硝普钠，亚硫酸钠无水，硝酸亚硫酸钠，Dragendorff试剂，P-DAB和Folin-Ciocalteu试剂购自Merck。碱性紫素是从Sigma Aldrich购买的，并从西爪哇省Sumedangor周围的传统药店购买了样品包装草药。Wha MealthCare购买了Whatman No.1,4和第6号和Whatman 1色谱法定制级滤纸。使用1.0cm石英细胞，由UV可见光光度计分析jena规格200记录吸光度测量。

2．1．试剂的制备

在这个实验中使用了九种试剂。Merck直接使用Dragendorff, p-DAB和Folin-Ciocalteu试剂。5%的氯化铁在水中制成。1%的硝普钠在水中制成。Schiff试剂是将200mg碱性品红溶于120ml热水中冷却制成的。然后在20 mL水中加入2 g无水亚硫酸钠，加入2 mL浓盐酸，用水稀释至200 mL，静置至少2小时。将2 g p-DAB溶于50 mL 95%乙醇和50 mL浓盐酸中制备p-DAB试剂;试剂必须是新鲜的。用HCl 10 M、氯酸钾和氢氧化铵2 M作为试剂进行马来酸测试。将硝酸银溶解在100 mL的水溶液中，加入5%的氢氧化钠5 mL，制成Tollens试剂。 After that 7.5 mL of concentrated ammonium hydroxide was added. Diazotization test was carried out by dissolving the sample in HCl 2 M, adding 1 drop sodium nitrite 1%, and adding 1 drop of 2-naft-2-ol 4% in NaOH 2 M. These reagents were then tested against allopurinol solution (100 mg/ml) and NaOH 2 N as a blank reagent to observe the color changes.

2．2．纸上特定试剂试验的设计与优化

将Whatman滤纸1号、4号、6号和Whatman 1层析切成1 × 1cm的小片，间隔10、20、40、60分钟用别嘌呤醇专用试剂浸泡，然后在室温和50℃烘箱中烘干。所有时间间隔中颜色变化最快的PAD被用于进一步的研究。基于纸的分析装置是按照如图所示的通用pH指示剂条的设计设计的1。该设计由照片纸组成，作为支撑底座（5×0.5cm）和Whatman滤纸（1×1cm）作为含量特定试剂。用特定试剂浸泡的Whatman滤纸使用双胶带附着在支撑底座上。通过灵敏度测试和选择性测试观察垫的性能。

2．3.PAD在实际样品分析中的应用

采用薄层色谱法(TLC)、紫外-可见分光光度法(UV-Visible)和PAD对有或没有注册号的中药进行分析，以验证PAD在实际样品分析中的适用性。将总共400毫克的中草药细粉，用10毫升0.1 N NaOH溶解，然后超声15分钟，过滤。每种草药溶液1 mL用0.1 NaOH稀释至10 mL。TLC分析以硅胶GF 254为固定相，流动相为5 mL正丁醇:5 mL 25%氢氧化铵的溶液混合物。以对乙酰氨基酚和别嘌呤醇为标准化合物。在254 nm紫外灯下观察分析结果。用于分光光度法紫外可见分析，500mg中草药已被精细粉碎，用0.1 N NaOH溶解多达10 mL，超声15分钟并过滤。然后0.1 M HCl加入溶液至100 mL, 0.1 M HCl将10 mL溶液稀释至100 mL。再将溶液稀释至10 mL，加入100 mL盐酸0.1 M。在200 ~ 300 nm处记录吸光度谱。 For PAD analysis, 400 mg herbal medicine sample was dissolved in 10 mL of distilled water and 10 mL 2 M NaOH and then filtered. The PAD was immersed in the sample and the color change that occurs was observed.

3.结果和讨论

3.1。比色试剂与促氟醚醇在溶液中的相互作用的表征

用别嘌呤醇标准品测试9种试剂的比色感应能力。他们是德拉甘多夫试剂，氯化铁，福林- ciocalteu试剂，硝普钠，p-DAB试剂，希夫试剂，氯酸钾，Tollens试剂，亚硝酸钠。数字2显示了比色剂在别嘌呤醇溶液和NaOH 2n作为空白试剂存在下的颜色变化。

数字2表明，将Allopurinol溶液加入到试剂溶液中后，试剂的一些颜色改变。与Allopurinol溶液反应时，Folin-Ciocalteu给出深蓝色[18.而氯化铁的颜色_3.加入别嘌呤醇后，试剂无变化。重氮化试验表明，与别嘌呤醇中的胺基反应时呈暗红色或橘红色。但是随着试剂的颜色变化，颜色变化不明显，所以不再使用该试剂。当与化合物中的氨基反应时，德拉甘多夫试剂会产生橙色、红橙色或棕橙色沉积物。结果表明，当该试剂与别嘌呤醇反应时，纸张颜色呈双层，不能在纸张上延续。p-DAB试剂与化合物中的胺基反应时呈黄色。硝普试剂也没有继续，因为试剂的颜色没有变化。席夫试剂在化合物中存在醛或酮时使其呈紫色或紫罗兰色。换色剂不能继续，因为换色剂是由NaOH作为空白试剂的碱性条件而不是别嘌呤醇化合物引起的。当试剂与羰基在别嘌呤醇溶液上反应时，托伦斯给出银沉淀。 The amalic acid test gives a red, pink, or violet color when the reagent reacts with xanthine on allopurinol solution after the heating process. In this experiment, the heating procedure is avoided, because it is not applicable for PAD. Based on the result, Folin-Ciocalteu, p-DAB, and Tollens reagents continue to be used in PAD.

3.2。纸上特定试剂试验的设计与优化

本研究使用的Whatman滤纸是Whatman 1号、4号、6号滤纸和Whatman 1号色谱。Whatman No. 1滤纸是常规分析中使用最广泛的纸，具有中等的滞留率和流速，孔径为11µm. Whatman No. 4是过滤速度非常快的滤纸，孔径为20-25µm. Whatman No. 6孔径为3µm，用于水分析，而Whatman 1色谱是色谱分析中使用最广泛的纸张[19.］.数字3.显示了别嘌呤醇存在时Whatman滤纸在不同浸泡时间下的颜色变化。

结果显示最佳浸入时间为60分钟，因为此时颜色强度比另一个时间更强烈。每个Whatman滤纸都具有不同的特性，尤其是孔径。较小的孔径将吸收更多的试剂。然而，所有纸张没有显着差异吸收试剂并与Allopurinol反应。最佳干燥时间在室温和烘箱中进行。在室温下，纸张完全干燥的时间约为1小时，而在烤箱中的温度为50°C时，纸张完全干燥的时间是30分钟。因此，使用的纸张的温度和干燥时间设定在50℃下30分钟。基于纸的分析装置的设计如图所示4.。这种设计中使用的材料简单且便宜。该设计是为每个滤纸制作的。

3.3。纸质分析装置的性能

通过确定PAD可检出的别嘌呤醇的最低可测浓度，对每种滤纸进行灵敏度试验。在PAD中加入不同剂量的别嘌呤醇(0 ~ 100 mg/ml)。观察了在别嘌呤醇存在下PAD的颜色变化。每张纸浸入别嘌呤醇溶液后，颜色会在短时间内发生变化。所有的论文没有显著差异。灵敏度结果表明，最低可测浓度为75 mg/ml，因为在该浓度下三种试剂仍有适当的颜色变化，而当浓度小于75 mg/ml时，p-DAB试剂不变色。

对纸基分析装置(PAD)检测别嘌呤醇的选择性进行了测定。试验是将PAD浸在咖啡因和扑热息痛的溶液中进行的。这两种化学药物通常都包含在治疗痛风的草药中。数字5.结果表明，PAD浸入扑热息痛后，Folin试剂呈现绿色变化，而p-DAB试剂没有变色。在浸过咖啡因的PAD中，Folin试剂溶液不变色，而p-DAB试剂则变色为黄色。这一结果表明，PAD与其他干扰化合物反应时颜色变化不同，对别嘌呤醇的检测具有选择性。

3．4．PAD在实际样品分析中的应用

采用薄层色谱法、紫外-可见分光光度法和PAD对4种中草药样品进行分析，以验证PAD对实际样品的性能。数字6.显示样品的薄层色谱分析。TLC分析表明，样品a和d很可能含有对乙酰氨基酚，样品b可能含有别嘌呤醇，因为它们的Rf与对乙酰氨基酚和别嘌呤醇的标准品Rf相似，分别为0.75和0.47。样品c可能含有另一种化合物，因为它与这两种化合物的Rf值不同。样品b、c、d的斑点很弱，可能是样品中化合物含量很低所致。

样品b被预测含有别嘌呤醇，继续使用分光光度法紫外分析。

为了计算样品B中的Allopurinol水平，Allopurinol的标准曲线，浓度为6,8,10,12,14和16µg / ml。六种浓度在252nm波长下测量。然后绘制浓度与吸光度的曲线，得到方程y = 0.0469x - 0.0357，线性回归值r2为0.9954。由式可知，样品b中别嘌呤醇的浓度为7.44µ克/毫升。

PAD检测:样品b加70 mg/ml别嘌呤醇。样品溶于水和氢氧化钠，因为中药通常溶于水，而别嘌呤醇溶于氢氧化钠。结果表明，PAD法与薄层色谱法和分光光度法数据吻合较好。所有方法均证实样品b中含有别嘌呤醇。

4.结论

对9种比色试剂(Dragendorff试剂、氯化铁、Folin-Ciocalteu试剂、硝普钠、p-DAB试剂、希夫试剂、氯酸钾、Tollens试剂、亚硝酸钠)进行别嘌呤醇检测。从这些试剂中可以得到Folin-Ciocalteu、p-DAB和Tollens试剂用于PAD。该PAD具有良好的灵敏度和选择性。该方法对中草药样品中别嘌呤醇的检测结果与薄层色谱和分光光度法一致。该方法简便、快速、无仪器、选择性强，可用于中草药中别嘌呤醇的现场分析。

数据可用性

支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究得到了帕德贾兰大学药学院的财政支持，通过Hibah Internal Unpad, Riset Fundamental Unpad 2018。

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