色谱指纹图谱和商业的定量分析Pheretima洒水器由UPLC-DAD(广地龙)及其添加剂

文摘

广地龙是传统中药干身体的准备Pheretima洒水器(大肠毕雷矿泉水),一种蚯蚓。然而,广地龙的准备工作可能会被其他物种掺假和质量控制的方法是必要的。一个方法被开发来分析和验证商业广地龙,利用超高液相色谱(UHPLC)加上二极管阵列检测(爸爸)。设备包括一个Acquity UPLC高速钢T3列(100毫米×2.1毫米,1.8μ米)。移动阶段由乙腈和0.01%的甲酸,注入0.3毫升/分钟。波长检测在260海里。22批确认p .洒水器来自不同来源的样品(参考)和20批掺假样品进行分析建立一个参考指纹商业广地龙。五个山峰的指纹参考批次标识为特征;六个特征峰的指纹添加剂被确定通过比较他们的保留时间与引用。总42个批次的样本相对于参考指纹,指纹的p .洒水器样本相似。UHPLC-DAD方法可以同时测定6个化合物的内容(次黄嘌呤,黄嘌呤,尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷)的引用和掺假的批次。六个化合物表现出良好的回归(r> 0.9999)在测试范围。经济复苏(精度)是98.25到101.68%,相对标准偏差< 2.67%。总之,这个UHPLC-DAD方法结合了色谱指纹和量化分析,易于广地龙作为一种有效的质量控制方法。

1。介绍

广地龙是传统中药(TCM)组成的干的Pheretima洒水器(大肠毕雷矿泉水),一种蚯蚓。动物主要分布在广东、广西、海南省。中医,广地龙函数作为退热剂,平喘药,利尿剂和平静意识(1]。现代研究也表明,广地龙施加很多药理作用,如降低血压,预防血栓形成,预防癌症2]。某些制剂的广地龙已经批准临床使用在中国3]。

分类学上,药用蚯蚓包括三个家庭,四个属,49种(4]。一些蚯蚓广地龙中使用的原始动物相似,但不真实p .洒水器。没有有效的方法识别、混乱是可能的。因此,商业广地龙的验证是非常重要的。

近年来,许多方法已经尝试验证广地龙的真实性。这些方法包括DNA(脱氧核糖核酸)指纹,显微特征识别、定性鉴别、理化鉴别、薄层色谱法、凝胶电泳和DNA条码技术5- - - - - -11]。薄层色谱和凝胶电泳是快速和便宜,但结果只是定性或半定量的,因此通常只用于筛选样本。虽然DNA条形码最初承诺的蚯蚓分类,物种分化有时是困难的,因为兄弟姐妹种或亚种是可能的(12]。另一方面,超高液相色谱(UHPLC)加上二极管阵列检测(爸爸)突出以其灵敏度高、选择性和履行能力同时决定多个分析物在一个单一的运行。

广地龙含有核苷酸对人体新陈代谢至关重要,次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤等(13]。碱基、核苷提取广地龙证实有抗癫痫和抗血小板聚集的影响14- - - - - -16]。次黄嘌呤是舒张压的基础,抗组胺剂,和哮喘药物17]。黄嘌呤能扩张支气管和已用于治疗临床哮喘(18]。几项研究已经报道使用UHPLC进行定性和定量分析的这些组件p .洒水器和其他物种(19- - - - - -22]。然而,还没有报告关于广地龙的识别及其添加剂使用核苷为指标。

结合定量分析的色谱指纹几个标记中药的质量控制是对传统方法的改进。尤其是色谱指纹对草药的真实性很重要,虽然几个指标的量化更好地反映中药的质量(23]。

目前的研究开发和验证一个色谱指纹广地龙有别于其共同的目的。同时还建立了一个新的分析方法确定六核苷成分的内容广地龙进行评估的质量。该方法利用UHPLC-DAD不仅可以用于识别广地龙的真实性和质量评价,但也要保证其临床应用的安全性和有效性。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

参考标准,次黄嘌呤,黄嘌呤,尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷获得Bio-purify植物化学物质(中国成都;图1)。所有参考化合物的纯度> 98%,由标准化高效液相色谱峰地区发现的。

动物基因组DNA提取设备(通用),6×加载缓冲区(DNA), DL 2000个DNA标记从Tsingke购买(中国,北京)。引物合成在Tsingke(中国,北京)。'明星马克斯DNA聚合酶从豆类购买(中国大连)。GelRed和琼脂糖从Biotium阿拉丁,分别(两个,上海,中国)。乙腈和甲酸的高效液相色谱级和购买费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。所有其他试剂的解决方案的分析级从国药控股提供化学试剂(上海,中国)。去离子水是获得使用Milli-Q净水系统(美国微孔,Billerica的)。

广地龙材料从中国主要购买中药市场(市场在安徽亳州,广西玉林市场,和广东清平市场)。(表1)博士马治国验证所有的商业广地龙样品的干身体p .洒水器,Metaphire麦格纳,或Amynthas obscuritoporus使用形态学和组织学方法(24]。凭证标本存放岭南暨南大学中药研究中心的广州,中国(中国南方)。

2.2。聚合酶链反应(PCR)检测9- - - - - -11]

验证形态和组织学鉴定的结果,样品被DNA条形码识别也。首先,从样本中提取基因组DNA。DNA分离和纯化使用动物基因组DNA提取工具,按照制造商的说明。

提取的基因组DNA作为模板用于一对引物,这是16 sar / sbr (25),16 sar (5′-CGCCTGTTTAT-CAAAAACAT-3′) / 16 sbr (5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAC-GT 3′),放大样例16 s rRNA通过PCR基因。扩增程序如下:predegeneration,五分钟在95°C;40周期45 s在95°C的变性、退火45 s 55.2°C,和45 s在72°C扩展;最后扩展10分钟在72°C。PCR产品解决通过琼脂糖凝胶电泳和DNA标记PCR片段大小进行检测。识别的结果由DNA测序验证,是否有一个清晰的地带或没有杂原子约500个基点。最后,测序结果手工纠正和拼接并与基因库中的有关16 s rRNA序列数据库(表1)。

2.3。制备的标准解决方案

混合标准储备溶液包含次黄嘌呤(i)、黄嘌呤(ii)和鸟苷(v)准备在0.1%氨水,和尿苷(iii),肌苷(iv)和腺苷(vi)准备在水里。工作标准的解决方案是由稀释用0.1%氨水和水混合标准溶液的一系列合适的浓度范围内:0.68 - -33.50(我)μg / mL;(2)0.60 - -29.83μg / mL;(3)1.08 - -54.47μg / mL;(四)1.66 - -83.17μg / mL;(v) 1.14 - -56.83μg / mL;和(vi) 0.82 - -41.30μ克/毫升。所有标准的解决方案被储存在4°C到0.22使用和过滤μ前膜,注入。

2.4。制备样品的解决方案

商业广地龙样品(1.0 g, 24网)重与塞成一个锥形瓶100毫升,20毫升的5%甲醇溶液补充道。浸泡30分钟后,声波降解法(250 W, 40 kHz)在室温下进行了40分钟。然后,合成混合物与萃取剂调整原来的体重。离心后(13000 g×5分钟),上层清液储存在4°C,透过一个0.22μm膜前注入UHPLC系统进行分析。

2.5。器和色谱条件

UHPLC分析使用一个安捷伦1290 UHPLC系统(安捷伦科技、Waldbronn、德国)组成的一个四元泵六世(G7120A),二极管阵列检测器(G7117A,爸爸),一个取样器(G7129B)和柱室恒温器(G7116B)。该系统是由OpenLAB cd (ChemStation版)软件(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。一个Acquity UPLC高速钢T3列(100毫米×2.1毫米,1.8μ米)在30°C的使用和维护。流动相为0.01%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。梯度过程如下:0 - 1分钟,0% B;1 - 1.5分钟,0 - 0.5% B;0.5和1.5 -15分钟,-1% b .流量保持在0.3 mL / min。注射量是3μl .检测波长260纳米。

2.6。UHPLC的验证方法

每个化合物的校准曲线建立了绘制峰面积(y)与浓度(x每个分析物的)。检测的极限(LOD)和定量限度(定量限)六个分析物的信噪比估计3和10个,分别通过注射一系列已知浓度的稀溶液。

内部和interday变化,发达的精度的措施方法,研究了通过确定六个分析物在一天六个复制和复制实验连续三天。峰面积的变化作为精度和百分数表示标准偏差的措施。

确认可重复性,六个解决方案准备从相同的样本(23号)进行了分析。确认稳定,样品溶液(23号)进行了分析(0,1,2,3,4小时,分别。可变性和相对标准偏差(%)表示。

恢复测试是用来评估该方法的准确性。分析物的回收率测定的标准添加法在同一天。混合标准溶液上升到样例(23号),和经济复苏的结果计算上升之间的差异和未加料的样品在相同条件下分析。经济复苏是按照下列公式计算:恢复(%)=(发现——原始金额数量)/数量飙升×100%。

2.7。数据分析

相似性分析使用以下专业软件,推荐由中国国家食品药品监督管理局):中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年版中国药典委员会)。软件是用来计算每个色谱配置文件之间的相似商业广地龙样品和模拟色谱。这种方法是通过计算原始数据的相关系数,根据每个主要成分的相对峰面积。此外,相对保留时间和相对峰面积计算每个特征峰引用的色谱图。

3所示。结果与讨论

3.1。PCR结合特征的识别

比较与基因库数据库后,基因序列的同源性样品批次1无效。22是98%以上,确认被人类发现的组织p .洒水器(毕雷矿泉水,1872)26)(表1,图2)。基因序列的同源性为样品批次33-No。42是高于98%,证实这些被组织m·麦格纳(陈,1938)26]。结果同意提供的形态学和组织学识别博士马治国。然而,基因库数据库不包含的基因序列答:obscuritoporus(陈,1938)26]。因此,样品批次严禁。32与公共序列不匹配。

3.2。优化的提取过程

获得满意的提取效率,最好的提取溶剂,提取方法、提取时间进行了调查。确定最合适的萃取溶剂甲醇5%(包括5%甲醇、10%甲醇、水、和生理盐水)。超声波和回流提取也测试,和前获得更好的提取。

最后,1.0克样品粉末与20毫升的5%甲醇浸泡20分钟,然后提取超声破碎法对30岁,40或50分钟,确定最佳提取时间。完整的提取化合物可能在40分钟内完成。因此,40分钟被选为最佳提取时间。

3.3。UHPLC条件的优化

不同流阶段进行了优化UHPLC分析(图3)。乙腈比甲醇分离更适合移动阶段。甲酸作为流动相改性剂抑制峰值尾矿。紫外光谱的基础上的六个组件记录了从200年到400海里,260海里终于选定的监测。

3.4。UHPLC指纹色谱分析

不同样品的色谱指纹分析(前必须标准化数据3(一个)和3 (b))。标准化的过程包括选择常见的山峰色谱和所有常见的峰的保留时间正常化。42个样品的提取广地龙峰值被选为样本集。4,保留时间9.35分钟,被选为参考峰。通过观察所有的色谱峰p .洒水器五个特征峰被确定。

同样的方法被用来建立指纹m·麦格纳和答:obscuritoporus(数据3 (c)和3 (d))。的指纹m·麦格纳和答:obscuritoporus每一个包含六个特征峰。与标准化合物相比,6峰被确定为次黄嘌呤(i)、黄嘌呤(ii),尿苷(iii),肌苷(iv),鸟嘌呤核苷(v)和腺苷(vi)。

42个样本进行了相似的分析商业广地龙。计算出的相似度指标均值融合向量方法。之间的相关系数的每个色谱图22所示p .洒水器样品和模拟的意思是色谱图如下:0.977,0.997,0.811,0.995,0.973,0.948,0.948,0.938,0.995,0.998,0.968,0.995,0.955,0.997,0.998,0.998,0.997,0.879,0.939,0.879,0.910和0.933。22个样本的相似性指标p .洒水器高于0.811。这表明不同地区样本共享一个相似的色谱模式。

通过比较三种蚯蚓的常见的指纹模式物种,发现腺苷是添加剂的特性广地龙(例如,m·麦格纳和答:obscuritoporus),而没有腺苷p .洒水器。因此,腺苷酸的存在可以用来指示在广地龙添加剂的存在(p .洒水器)。

3.5。验证和定量测定方法

拟议中的HPLC-DAD定量分析方法验证了确定线性,LOD,定量限,内部interday精度,稳定性和准确性(表2和3)。所有的校准曲线显示良好的线性(r> 0.9999)在测试范围内。整体的钟表和定量限的范围0.0918 - -0.250和0.303 - -0.831μ分别g / mL。

内部的相对标准偏差值,interday变化,可重复性和稳定性的六个分析物(表< 2.84%3)。整体复苏躺在101.68%和98.25之间,相对标准偏差< 2.67%。此外,峰纯度被爸爸的数据分析,调查,没有杂质的迹象可能被发现。总的来说,结果表明,这种HPLC-DAD方法准确确定六个化学标记的样本商业广地龙。

同时发达UHPLC方法已成功应用于确定以下化学标记42商业广地龙(表的样本4):次黄嘌呤(我)、黄嘌呤(ii),尿苷(iii),肌苷(iv),鸟嘌呤核苷(v)和腺苷(vi),确定每个样本一式两份。色谱图的峰被同样的保留时间和在线紫外光谱与标准(图4)。

样品中腺苷的含量变化很大,从0到1119.9μg / g。这些化学成分的差异可能是由于多种因素,如环境条件和遗传变异。因此,建立质量控制方法,以确保产品的有效性和安全性至关重要。

4所示。结论

中药的质量控制的组合UHPLC指纹与定量分析的几个标志无疑是对传统方法的改进。在目前的研究中,一个简单、准确、可靠的UHPLC-DAD方法开发评估商业广地龙的质量。色谱指纹图谱建立了广地龙,同时定量分析的六个核苷,也就是说,次黄嘌呤,黄嘌呤,尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷。验证该方法准确、重现性好和很容易利用合适的商业广地龙的质量控制方法。42个批次的样品的定量分析表明,腺苷的存在可以从纯广地龙区分的目的。因此,开发方法可以方便地用于保证产品质量广地龙和掺假的检验。

数据可用性

研究数据来自本研究包含在这篇文章。

的利益冲突

所有作者声明,没有利益冲突。

确认

这项研究由国家标准化项目的中药学(ZYBZH-Y-GD-13)和技术转移和产业支持项目广东省科学院、中山科技局(2016 g1fc0011)。

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