文摘

一个敏感的和简单的液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)方法的开发和验证同时确定有毒和其他活性成分包括isovanillin,东莨菪亭,periplocin, periplogenin, periplocymarin口服后五加皮提取小鼠。血浆样本由蛋白质沉淀和甲醇。所有化合物分离列使用乙腈与梯度洗脱和甲酸水溶液(0.1%,v / v)作为流动相的流速0.3 mL / min。所有化合物的检测是通过multiple-reaction监控(MRM)积极电喷雾模式。质/ MS方法表现出良好的线性五分析物。量化的下限(LLOQ)对东莨菪亭0.48 ng / mL, periplogenin, periplocymarin;2.4 ng / mL isovanillin和periplocin。所有化合物的提取回收率超过90%,rsd为10%以下。结果发现,东莨菪亭和periplocin快速的吸收在活的有机体内口服后五加皮提取。此外,periplocymarin拥有丰富的等离子体接触。结果表明,验证方法有效申请isovanillin的药代动力学研究,东莨菪亭,periplocin, periplogenin, periplocymarin后口服五加皮提取。

1。介绍

中药(中药)扮演重要的角色在疾病的预防和治疗,在临床实践中使用几个世纪以来在中国(1]。针对常用的中药,其中有一些是有毒等西班牙飞(2),川乌(3),马马钱子L。(4)等。尽管其毒性,这些中药仍广泛应用于临床由于其特殊的药理作用。值得注意的是,有毒中药的临床不良反应限制了他们的应用程序在临床治疗。因此,有毒中药的安全性变得越来越重要。药代动力学的研究有助于评估安全通过分析吸收、分布、代谢和排泄的药物在活的有机体内(1,5]。因此,至关重要的是执行有毒的药代动力学研究和/或其他有毒中药的活性成分达到最好的治疗效果,减少中药的毒性6,7]。

五加皮叫做“xiangjiapi”作为一种有毒中药(TCM) (8,9),是根树皮Periploca海螵蛸知母。(家庭:萝摩科)10]。它已经广泛被用于减轻风湿性条件和熟化浮肿以及加强骨骼和肌肉组织临床多年(11,12]。目前,许多选民在cortex periplocae,如心脏苷、甾族化合物,低聚糖,孕烷苷,香豆素类、黄酮类化合物、三萜,已确定(13,14]。据报道,心脏苷periplocin等periplogenin, periplocymarin不仅c的有毒成分ortex periplocae(8),而且活性成分对心脏的影响和抗癌活性15- - - - - -17]。Isovanillin有抗痉挛药(18)和止泻的活动(19]。此外,一些以前的研究结果表明东莨菪亭具有抗炎,抗甲状腺,抗氧化和抗高血糖药活动,等等。20.- - - - - -22]。因此,有必要澄清这些有毒的药代动力学的命运和活性成分的安全性评价cortex periplocae。

有几个分析方法确定有毒或在中药活性成分在生物体液,如同时测定一个或多个化合物以及他们的提取条件的优化23- - - - - -25),药物动力学和/或组织分布研究的三个有毒成分(26- - - - - -29日),和药代动力学的研究在主茎的东莨菪亭Erycibes(30.]。还有一份报告关于periplocin的吸收参数在体外通过高效液相色谱法(31日]。然而,没有报告同时测定毒性和活性成分的口服后在生物体液五加皮提取。在目前的研究中,三个毒性和活性成分(periplocin、periplogenin periplocymarin)和其他两个活性成分(isovanillin和东莨菪亭)在大鼠血浆被液体同时量化chromatography-tandem质谱(质/ MS)。新成立的质/ MS方法已成功应用于药代动力学研究。

2。材料和方法

2.1。化学物质、试剂和材料

乙腈和甲醇从默克公司(达姆施塔特,德国),以及甲酸(美国纽瓦克罗伊)、高效液相色谱级。去离子水制备由Milli-Q系统(微孔、马、美国)。Periplocin(纯度:99.18%),periplocymarin(纯度:99.93%),periplogenin(纯度:99.81%),和东莨菪亭(纯度≥98%)提供从成都Dest生物技术有限公司有限公司(中国成都)。Isovanillin(纯度:98%)来自天津万象恒源科技有限公司有限公司(天津)。原儿茶醛(纯度:99%)和华法林(纯度:92.3%)提供了从国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。所有化合物的化学结构如图所示1。五加皮从山西省和购买凭证标本是沉积在天津中医药大学、中国天津。

2.2。仪器和分析条件

质/女士设备包括一个安捷伦1200 LC系统(二元泵、真空脱气装置单元、Hip-ALS autosampler)和一个API 3200三重四质谱仪(加拿大安大略省康科德)配备一个电喷雾电离(ESI)来源。

色谱分离分析上完成列(Eclipse + ,4.6毫米×100毫米,1.8μC m)和一名保安₁₈列(2.1毫米×12.5毫米,5μ米)(美国安捷伦)维持在20°C。的流动相由乙腈(A)和甲酸水溶液(0.1%,v / v)(B)使用梯度洗脱如下:在0-20分钟30 - 70%;在20 - 25分钟,70 - 75%的流量0.3 mL / min, re-equilibration梯度洗脱的时间是5分钟。注射成交15μl . multiple-reaction化合物监测的监测(MRM)模式与积极的电喷雾电离。这些离子转换m / zisovanillin 153.1→93.0, 193.1→133.1东莨菪亭,periplocin 719.6→719.4, 391.3→355.5 periplogenin, periplocymarin 535.3→355.3, 139.4→65.2原儿茶醛(IS1)和309.3→163.2华法林(IS2)。所有分析物的最优反应离子喷雾时获得的电压是4500 V与温度为550°C和窗帘气体在10 psi。此外,GS1和GS2 isovanillin 40 psi和40 psi,东莨菪亭,periplocin, periplogenin, periplocymarin IS1 50 psi, 50 IS2 psi。

2.3。五加皮提取物的制备

五加皮(2.0公斤)提取倍量的95%的酒精和6倍量的60%的酒精在热回流方法2 h,先后。Cortex periplocae提取得到综合提取时集中在减压干燥。提取率为15%。

2.4。制备校准标准和质量控制解决方案

适当数量的每个复合称重和溶解在甲醇达到1.0毫克/毫升的浓度作为主要股票的解决方案。(内部标准)股票的混合解决方案是准备用甲醇稀释股票的解决方案和最终的浓度是500 ng / mL和20 ng / mL原儿茶醛和华法林,分别。适当的校准标准的解决方案,每个分析物的体积股票的解决方案是混合在一起来获得所需的混合解决方案和混合物与甲醇稀释连续。质量控制(QC)解决方案的准备后,制备方法校准用标准的解决方案。所有的解决方案都是储存在4°C。

2.5。制备血浆样品和质量控制(QC)样本

100年的一项μL整除的血浆样品离心管,10μ300年,LμL甲醇是先后补充道。混合物是涡1分钟和离心10分钟14000 rpm。浮在表面的转移到另一个离心管,然后在14000转离心10分钟。QC样品准备通过增加10μ离心管,10 L质量控制解决方案μL的是,世行鼠血浆(100μL)和甲醇(300μL)先后添加,然后混合都遵循着相同的方法,对血浆样品浓度达到1.44,24岁,和东莨菪亭240 ng / mL, periplogenin, periplocymarin;7.2、120、1200 ng / mL isovanillin periplocin,分别。

2.6。方法验证

2.6.1。特异性

特异性是评估通过比较空白血浆样品的色谱图从六个不同的批次老鼠与分析物的空白血浆飙升(LLOQ),以及真正的大鼠血浆样本中管理五加皮提取一个剂量的18.9克/公斤。

2.6.2。校准曲线和敏感

标定样本由飙升10μL校准标准解决方案到一个离心管,然后其次是一样的方法,制备的QC样品的浓度在线性范围内达到0.48 -300 ng / mL(0.48, 0.8, 2.4, 4、12、20岁,60岁,100,和300 ng / mL)对东莨菪亭,periplogenin, periplocymarin;2.4 -1500 ng / mL(2.4、4、12、20岁,60岁,100年,300年,500年和1500 ng / mL) isovanillin和periplocin。校准曲线的分析物被分析物的峰面积比率计算是策划反对使用1 / X加权名义浓度。量化的下限(LLOQ)可以精确地确定最低浓度的校准曲线。

2.6.3。精密度和准确度

盘中inter-day精度和精度估计通过分析六个复制QC样品在一个连续三天,分别。相对标准偏差(RSD)是用来评估精度和计算浓度的百分比比标称浓度”指的是精度。

2.6.4。经济复苏和基体效应

经济复苏和基体效应是由QC样品在三个层次。复苏化验通过比较决定处理血浆样品中分析物的峰面积与样品进行后期处理越来越多。矩阵效应被正规化矩阵评估因素,分析物的峰面积比,和相应的后续处理样品的未经加工的样品。的恢复是评估在最后的浓度。

2.6.5。稳定

QC样品(n = 6)三个浓度(低、中、高)也用于评估所有分析物的稳定性。QC样品autosampler条件下24小时测定评价autosampler 24小时稳定。冻结/解冻周期稳定,QC样品储存在-80°C受到三个冻结解冻(室温)周期。QC样品储存在室温下24 h和-80°C 1月被用来评估短期稳定性和长期稳定性。混合分析物的解决方案(100 ng / mL),由稀释股票获得解决方案存储两个星期在4°C,被用来评估股票的稳定的解决方案。分析物的稳定工作的解决方案也评估了存储解决方案2周4°C。股票和空间站的工作解决方案的稳定性是由相同的程序分析物。

2.6.6。结转

结转是由先后注入LLOQ样本和ULOQ示例(空白血浆样品浓度最高的飙升在校准曲线)和三个空白血浆样品。认为结转时并不影响质/ MS测定分析物和反应在空白血浆样本低于20%的LLOQ响应和5%的工作方案,分别。

2.7。应用程序的药代动力学研究

的药代动力学研究是按照指南进行护理和使用实验动物和动物伦理委员会批准天津中医药大学。男性Sprague-Dawley老鼠(260 - 300 g)住笼子里禁食12 h和被允许免费使用水之前的实验。适当数量的五加皮提取悬浮在0.5%羧甲基纤维素钠盐溶液(CMC-Na)和口服的体积是100 mL / g。根据临床剂量,老鼠五加皮提取口服剂量的18.9克/公斤。老鼠用乙醚麻醉前撤军。血液样本(约250μL)被收集到离心管亚轨道的肝素钠静脉为0.033,0.083,0.167,0.25,0.5,1,2,4,6,8,12日,24日,36岁,48 h后剂量。以很短的间隔重复出血,流体替换(适当体积的生理盐水)是必需的。血液样本立即离心10分钟7000 rpm。获得等离子体被转移到另一个离心管和存储在-80°C进行分析。

2.8。数据分析

在等离子体(最高药物浓度 )和时间达到最高药物浓度( ),可以直接获得的值。其他关键参数如血浆浓度时间曲线下的面积(AUC),消除半衰期( ),和平均停留时间(捷运)计算与DAS(药物和统计1.0、皖南医学院、中国)使用non-compartmental模型。

3所示。结果与讨论

3.1。质/ MS方法的优化

为了单独的所有化合物,研究了流动相的组成和比例。结果表明,乙腈和甲酸水溶液(0.1%,v / v)与顶尖提供最好的梯度洗脱分离的化合物。流量为0.3毫升/分钟。质量状况,分析物的离子强度,在负离子模式下并不高,在正离子模式。此外,源参数也被优化以提高灵敏度和取得更好的反应。

3.2。优化样品制备

一个高效的样品制备过程可以实现预期的复苏和消除干扰内源性组件从矩阵。与乙腈沉淀蛋白与乙酸乙酯/甲醇方法和液液萃取方法研究了提取所有分析物从样品,分别。结果表明,蛋白质沉淀与甲醇可能会获得满意的提取复苏。最后,血浆样品处理的蛋白质沉淀和甲醇直接离心两次在14000转10分钟。随后,15μL解决方案注入质/ MS系统进行分析。

3.3。分析四个化合物的剂量的口服

isovanillin的内容,东莨菪亭、periplocin periplogenin, periplocymarin五加皮提取质/ MS测定。结果表明,isovanillin的剂量,东莨菪亭,periplocin, periplogenin, periplocymarin 32.76毫克/公斤,7.09毫克/公斤,28.89毫克/公斤,2.21毫克/公斤,1.34毫克/公斤,分别。

3.4。方法验证

3.4.1。特异性

所有化合物的典型的色谱图2。isovanillin的保留时间,东莨菪亭、periplocin periplogenin, periplocymarin, IS1(原儿茶醛)和IS2(华法林)是7.5分钟,7.72分,8.28分钟,12.16分,15.06分钟,5.49分,分别和22.12分钟。如图2,没有干扰内源性物质中等离子体的决心。

3.4.2。校准曲线和敏感

校准曲线方程如下:y = 0.00728 x - 0.000117 isovanillin, y = x + 0.265 0.0211东莨菪亭,periplocin x y = 0.00366 + 0.072, 0.0424 y = x + 0.00747 periplogenin, periplocymarin x和y = 0.0168 - 0.000106。显示的所有分析物显示良好的线性相关系数(r)超过0.99。LLOQ 0.48 ng / mL东莨菪亭,periplogenin, periplocymarin;2.4 ng / mL isovanillin periplocin,表明建立的敏感性方法非常好。

3.4.3。精密度和准确度

盘中的值和inter-day精密度和准确度进行了总结表1。对于所有分析物,rsd为盘中和inter-day不到13%,精度从92.6%到115%不等。结果表明,该方法精确和准确的确定在大鼠血浆所有分析物的浓度线性范围。

3.4.4。经济复苏和基体效应

复苏和基体效应的结果展示在表1。所有分析物的回收率超过90%,rsd小于10%。所有分析物的基体效应范围从0.87到1.08的标准偏差小于11%。结果表明,建立的蛋白质沉淀,有效提取所有分析物和甲醇方法没有明显的内源性物质从等离子体观察抑制或增强分析物的离子化。两个空间站的复苏(原儿茶醛和华法林)是81.6%和88.6%,分别。

3.4.5。稳定

综述了在表的稳定性数据2。结果表明,没有明显的降低等离子体观察,表明等离子体稳定的分析物autosampler 24小时,24小时在室温下,三个冻结/解冻周期在-80°C和1月-80°C。分析物也稳定的工作解决方案如表所示2。对于国际空间站的工作方案(IS1:原儿茶醛;IS2:华法林)的准确性101%和109%,RSD为4.93%和4.91%,分别。此外,分析物以及空间站股票的解决方案是稳定的数据表明,86.2% - -112%的标准偏差小于5%。

3.4.6。结转

没有山峰的三个空白样品注入质/注射后一个女士ULOQ样本。显然,结转并不影响分析物和空间站的决心。

3.5。药代动力学研究

发达质/ MS方法确定isovanillin的浓度,成功采用东莨菪亭,periplocin, periplogenin, periplocymarin老鼠口服后等离子体五加皮提取一个剂量的18.9克/公斤。值得注意的是,isovanillin没有口服后大鼠血浆中发现,这可能是由于以下原因:在大鼠血浆浓度低于LLOQ或不口服后吸收。此外,平均血浆浓度时间配置文件被显示在图3。很明显,non-compartmental模型是最适合描述分析物的药代动力学资料。东莨菪亭的主要药代动力学参数、periplocin periplogenin, periplocymarin被展示在表3。结果表明,东莨菪亭和periplocin最大血浆浓度在短时间内,特别是东莨菪亭0.10±0.03 h。结果显示,periplogenin比periplocymarin更快达到最大血浆浓度与以前的报告是一致的(26]。如图3,periplocymarin periplogenin出现双峰值和第二个峰值高于第一个峰值;这种高峰外观模式的原因之一是,老鼠periplocin代谢periplocymarin periplogenin。相比以前的文献[26),可以确定periplocin和浓度低于LLOQ口服后12 h;适当的原因是其他成分五加皮提取提升periplocin的吸收和只有9倍periplocymarin (125.96±96.42 ng / mL)比periplogenin (14.53±7.75 ng / mL),这归因于其他成分的影响五加皮提取。东莨菪亭在等离子体的浓度迅速下降。

对东莨菪亭是177.83±133.85 ng / mL,这表明,东莨菪亭在等离子体的浓度高而periplogenin获得低血浆浓度。此外,periplocymarin (h = 1689.73±1174.92 ng / mL)拥有丰富的等离子体接触。periplocin和东莨菪亭是1.21±1.11 h和0.19±0.08 h,显示他们的消除也快。

3.6。与现有的方法比较报告

几个研究periplocin、periplogenin periplocymarin在生物体液(20.- - - - - -22已报告。然而,这些分析方法不同时涉及有毒成分和其他活性成分。此外,口服后东莨菪亭的药代动力学特征五加皮提取尚未公布,尽管主茎的药物动力学Erycibes进行了(31日]。本文其他活性成分(isovanillin和东莨菪亭)除了三个有毒的组件也由质/女士。同时,通过直接的样品制备与甲醇沉淀蛋白比以前的方法更简单和更快。

4所示。结论

开发和验证质/ MS方法成功地应用于有毒和其他活性成分的同时测定(isovanillin,东莨菪亭,periplocin periplogenin, periplocymarin)口服后在大鼠血浆cortex periplocae提取和评估他们的药代动力学特征。结果表明,东莨菪亭和periplocin快速的吸收和消除。此外,periplogenin和periplocymarin出现双峰值。这些药代动力学结果的发展可以提供更多的信息分析物cortex periplocae在临床实践中。药代动力学特征是有用的评估的临床疗效以及安全性分析物从cortex periplocae提取和设计合理的剂量方案五加皮。此外,这些药代动力学结果将是很大的帮助来理解其药物动力学和促进的发展五加皮在临床实践中。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了大多数中国的科学与技术委员会(2014年zx09304307 - 001 - 005)和特殊项目的人才发展优秀青年学者在天津和PCSIRT (IRT-14R41)。