文摘

客观的。建立和验证一个简单、敏感和快速液相色谱串联质谱(质/ MS)方法测定甲氨蝶呤(MTX)及其主要代谢物7-hydroxy-methotrexate (7-OH-MTX)在人类血浆。方法。色谱分离是实现Zorbax C₁₈列(3.5μ米,2.1×100毫米)使用梯度洗脱和甲醇(B阶段)和0.2%甲酸水溶液(一阶段),流速为0.3毫升/分钟分析时间为3.5分钟。质谱检测了在triple-quadruple串联质谱仪在正离子模式下以下质量转换:455.1/308.1 m / z MTX, 7-OH-MTX 471.0/324.1, 458.2/311.1为内部标准。预处理过程进行优化与稀释后一步蛋白质沉淀。结果。甲氨蝶呤和7-OH-MTX的校准范围5.0 - -10000.0 ng / mL。盘中,interday精密度和准确度都低于15%,对分析物在±15%。经济复苏对MTX和7-OH-MTX超过90%和基体效应从97.90%到117.60%不等。结论。该方法成功开发和应用到常规治疗药物监测MTX和7-OH-MTX在人血浆。

1。介绍

据估计,有385700新发病例和199700例死亡的非霍奇金淋巴瘤(NHL)发生在2012年在世界范围内1]。NHL的发病率增加在大多数发达国家高达1990,之后趋于平稳2,3]。大剂量甲氨蝶呤(MTX) +钙叶醛酸(CF)是一个经典的治疗方案治疗NHL的。MTX叶酸类似物,竞争性抑制二氢叶酸还原酶和随后块tetrahydrofolate从二氢叶酸的形成。Tetrahydrofolate是核酸合成的一个碳捐赠(4]。同时,MTX会抑制蛋白质和磷脂的聚胺形成和甲基化5- - - - - -7]。MTX的关键代谢物,7-hydroxy-methotrexate (7-OH-MTX),是行之有效的在活的有机体内减少MTX的细胞内浓度(8,9]。7-OH-MTX积累的浓度也会影响MTX的药物动力学由于竞争细胞跨膜运输10,11],7-OH-MTX和肾毒性、肝毒性之间的关系也被报道(12]。

大剂量MTX (1 - 5 g / m²)可以穿透血脑屏障,blood-eye屏障blood-testis障碍,甚至克服耐药性的肿瘤细胞13]。结果,大剂量MTX规定中最好的病人患有NHL,骨肉瘤、绒毛膜癌、急性淋巴细胞白血病临床[14]。不属预定目标的代理,大剂量MTX与狭窄的治疗窗限制,特别是在肾脏或肝脏受损的病人。正常细胞迅速增殖期MTX也被抑制。MTX的副作用包括肾毒性、肝毒性,myelosuppression等等(15]。肾毒性的发生率、myelosuppression和血液毒性分别为20%,80%,和33%,分别为(16,17]。早期的报告显示,6%的死亡几率,因为大剂量MTX(中18]。关于预防大剂量MTX管理后的严重的副作用,CF将规定减轻核酸抑制有时,但一个不合时宜的救助可能减少治疗疗效,甚至提高副作用发生率。在临床,新目标平衡治疗疗效和副作用引起了医生的注意,他致力于优化CF的剂量和管理时间保证疗效和防止副作用。为了实现这一目标,对MTX治疗药物监测在临床开展基于免疫测定法、高效液相色谱(HPLC)法和高效液相色谱串联质谱分析方法。对于免疫测定方法,简称MTX及其代谢物7-OH-MTX之间的串扰,高成本和狭窄的监控范围内阻碍了其临床应用19),而内生的化合物也可能扰乱在活的有机体内量化的MTX(中20.]。的高效液相色谱方法显示缺点分析时间长,灵敏度低。近年来出现的质/ MS方法监测MTX曝光(中21- - - - - -30.]。一些优势,例如,分析时间短,灵敏度高,简单的预处理过程,和高多个药物的普遍性,被这些报道质/女士单独显示方法,但如果这些优势可以达到更好的临床应用系统集成在一个方法。在这里,我们报告一个新开发和验证UHPLC-MS / MS方法同时测定MTX和7-OH-MTX人血浆和应用程序在NHL患者的临床样本完成。

2。实验

2.1。化学药品和试剂

标准包括MTX, 7-OH-MTX MTX-d3买来大连Meilun生物技术有限公司有限公司(中国大连市。纯度> 98% MTX, 7-OH-MTX MTX-d3。很多没有。MB1156-S、J0211A J1213A)。化学结构的MTX, 7-OH-MTX MTX-d3图所示1。HPLC-grade甲醇和乙腈均从默克公司购买(默克公司,达姆施塔特,德国)。甲酸是购自Tedia公司和高效液相色谱年级(Tedia费尔菲尔德,美国)。去离子水制备使用Milli-Q试剂水系统在实验室(美国微孔,MA)。HPLC-grade氢氧化铵从罗获得科学企业有限公司(澳大利亚珀斯)。其他试剂均为分析纯。

2.2。仪表

所有实验进行一个安捷伦6460 triple-quadrupole质谱仪配有电喷雾电离源(安捷伦科技、马、美国)。进行色谱分离安捷伦1290系列超高液相色谱,它包含一个四元泵、在线脱气器,烤箱,autosampler。仪器的操作与MassHunter软件(0版本,安捷伦科技,妈,美国)。

2.3。液相色谱和质谱条件

色谱分离是实现一个安捷伦ZORBAX C₁₈列(2.1×100毫米,3.5μ米)和温度保持在35°C。包括流动相溶剂甲酸(0.2%水)和B溶剂(甲醇),在0.3毫升/分钟。梯度洗脱开始在8% B和变化如下:0 - 1分钟:8% - -30% B;1 - 2分钟:30% - -60% B;2 - 3分钟:60% - -70% B;3 - 3.5分钟:70% - -70% b列是平衡与初始阶段3分钟前第一次注射。注射量是5μL和总运行时间为6.5分钟。质谱检测分析物,进行安捷伦6460 a, triple-quadrupole质谱仪,在积极的电离模式下操作。量化是使用多反应监测(MRM)模式执行以下转变:m / z MTX, 455.1/308.1 m / z 7-OH-MTX 471.0/324.1,分别和m / z 458.2/311.1(图2)。7-OH-MTX MTX的fragmentor电压,优化在114 V, 110 V, 114 V,分别和碰撞能量13 eV, 8 eV,分别和17 eV。最优质谱参数如下:气体温度350°C;干气流(N₂)10升/分钟;喷雾器气体50 psi;鞘气体温度300°C;鞘气体流(N₂)12升/分钟;毛细管电压5000 V。为collision-induced离解、高纯氮是利用碰撞气体和交货0.2 MPa的压力。四极1和四极3维持在单位解决。所有分析物的停留时间是200 ms。

2.4。准备工作的股票和解决方案

股票简称MTX的解决方案,准备在甲醇(包括0.1%氢氧化铵)在1.0毫克/毫升,7-OH-MTX,准备在methanol-ammonium hydroxide-water (7:2:1, v / v / v)解决方案获得最终浓度为1.0毫克/毫升。股票的解决方案都是储存在−80°C到分析。工作解决方案的分析物(500 ng / mL)被进一步稀释股票刚做好的解决方案与甲醇-水(1:9,v / v)。

2.5。制备校准标准和质量控制样品

校准标准由适当体积的工作解决方案添加到空白的人血浆浓度的5,10,100,200,500,2000,5000,和10000 ng / mL MTX和7-OH-MTX。质量控制(QC)样品分别准备以同样的方式获得10浓度(LQC、低),500 (MQC、中)、5000(认证机构、高)对MTX和7-OH-MTX ng / mL。所有样品都是储存在−80°C。

2.6。样品预处理

100年的一项μL整除的样本,20μL是解决方案(500 ng / mL在甲醇-水解决方案中,1:9,v / v)和300年μL甲醇被添加。混合物是vortex-mixed 3分钟和离心机在室温下13600 g×5分钟。100μL的上层清液被转移到400年μL 20%甲醇水溶液。vortex-mixing 1分钟后,混合物是离心机的条件。一个5μL整除的上层清液注入到质/ MS系统进行分析。

2.7。方法验证

2.7.1。特异性

特异性是评估通过对比色谱从六个不同的许多空白和样品飙升样本,和相应的反应不足20%的LLOQ和5%的是被认为是合理的。

2.7.2。复苏和基体效应

经济复苏是评估通过比较上升和样品的峰值区域postextraction样品在同一浓度(n = 3),和基体效应估计通过比较postextraction样品的峰面积water-substituted样本在同一浓度(n = 3)。复苏和基体效应进行评估在低,中,高的分析物的浓度。MTX和7-OH-MTX是10,500,和5000 ng / mL,是研究在一个集中的500 ng / mL。

2.7.3。量化的线性和下限(LLOQ)

MTX的校正曲线和7-OH-MTX范围从5到10000 ng / mL和9校准标准准备对分析物在这个范围内。校准曲线被绘制退化分析物的峰面积比值与相应浓度使用1 /加权线性最小二乘回归模型(n = 5)。LLOQ被定义为最低浓度点的校准曲线应满足精度和精度标准(n = 5),和其他浓度反演计算点的偏差不应超过除LLOQ±15%,它有一个更广泛的偏差为±20%。

第2.7.4。Interday和日内精密度和准确度

盘中,interday精密度和准确度进行评估通过分析五个复制QC样品的浓度水平分开三天(至少2天)。精度是表示为相对标准偏差(RSD %)。精度是决定之间的偏差测量的浓度和名义浓度。盘中RSD % interday和精度不超过15%是合理的。盘中和interday准确性,再保险%(相对误差在±15%)被认为是可以接受的。

2.7.5。稳定

稳定性,包括冻融稳定性,短期稳定,长期和桌上型的稳定MTX, 7-OH-MTX,和等离子体,是调查。QC样品冻融后冻融稳定性评估三个周期。桌上型稳定性评估通过分析QC样品准备好,放在板凳上6 h。长期稳定性测试通过分析QC样品储存在-80°C 30天。短期稳定性评估通过分析提取的QC样品保存在4°C的autosampler 24 h。分析物的浓度计算使用附带的校准曲线。

2.7.6。遗留

遗留MTX和7-OH-MTX还测试了通过注入最高的校准标准样品注入一个空白样品之前,和在空白样品中分析物的反应不超过20%的LLOQ和5%的是被认为是可以接受的。

2.7.7。稀释效应

稀释效应评估通过比较测量浓度的名义稀释浓度。刚做好的飙升和样品浓度超出最高的校准标准应由相应的空白稀释矩阵在线性范围。每个稀释系数应该评估至少五次,和RSD %和%不应超过15%,在±15%。

2.8。临床应用MTX暴露监测中

实验协议进行审核和批准了长征医院伦理委员会(上海,中国),在长征医院。知情同意签署所有的参与者。最后,11恶性淋巴瘤患者(男5;女6)总共招募和样本收集在44岁,68年,和92 h后每个病人管理MTX使用静脉滴注法。平均年龄为53.45±9.75 (±SD)年。11个病人MTX的用量为0.77 ~ 3.50 g / m²基于他们的临床诊断。样本略有动摇然后在3000×g离心10分钟。上层清液(等离子体)收获和储存在−80°C到分析。

3所示。结果和讨论

3.1。质/ MS条件优化

质/ MS方法是基于色谱分离和质谱检测。一个优化色谱分离和质谱检测可以促进药物量化和分析过程。第一种方法来达到我们的目标是找到一个更好的流动相缓冲物质,和缓冲物质可以调整移动阶段pH值,提高电离效率获得更好的对称性和更高的峰值响应(31日]。优化的条件,不同的缓冲物质,例如,甲酸(0.05%,0.1%,0.2%,0.5%;V / V)、醋酸(0.1%;V / V)、醋酸铵(5更易与L 10更易/ L),添加了尾矿的抑制和反应增强。此外,有机试剂包括甲醇和乙腈及其混合物在不同比例进行洗脱能力和检测峰对称性。因此,0.2%的甲酸水阶段和甲醇被证明是最优移动MTX和7-OH-MTX治疗阶段的分离。同时,不同的列包含Poroshell 120 SB-C₁₈2.7(2.1毫米×75毫米μ米),ZORBAX C₁₈(2.1×100毫米,3.5μ米),Inertsil ODS-3(2.1毫米×50毫米,5μ米),XBridge本·C₁₈(3.5μ米,2.1×100毫米),XSelect CSH C₁₈(3.5μ米,2.1×100毫米)的保留和再现性测试MTX和7-OH-MTX, ZORBAX C₁₈(2.1×100毫米,3.5μ米)显示一个最优的结果。最后,离子源条件优化来获得一个更好的女士反应如上所述。

3.2。样品制备

质/ MS发展分析物的提取和纯化是最有挑战性的,据报道,大约有61%的时间被分配到提取和纯化过程质/发展[女士32]。一步蛋白质沉淀中使用这个方法是一个简单,有效和经济的方法已被广泛报道,一些研究人员(4,30.,33),而固相萃取和液液萃取更耗费时间和浪费。为进一步提高检测灵敏度,我们稀释后的浮在表面的蛋白质沉淀与不同比例的甲醇混合物。在这一步中,8%(初始阶段),20%,50%,和70%甲醇水溶液被添加到上层清液在不同比例(1:1,1:2,1:3、1:4、1:5;V / V)。结果表明,最高的灵敏度可以获得5倍稀释后用20%甲醇水溶液上层清液,提高了灵敏度为MTX和7-OH-MTX 5 ng / mL。

3.3。方法验证

3.3.1。特异性

图3MRM显示色谱空白样本,分析物在样品在LLOQ浓度,飙升的样本,实际样品。MTX的保留时间,7-OH-MTX,范围从2.46到2.88分钟。没有观察到显著干扰在保留时间的人血浆MTX, 7-OH-MTX,。

3.3.2。复苏和基体效应

7-OH-MTX MTX的复苏和基体效应,并提出了在桌子上1。MTX和7-OH-MTX治疗恢复在不同浓度水平分别为92.47% -97.61%,-97.87%和91.45%分别RSD %都不到15%。结果表明,提取过程稳定、高效。均值矩阵MTX和97.90%治疗效果为-117.60% 116.07% -102.96% 7-OH-MTX在三个浓度水平,分别,这表明,电离抑制或增强从人血浆矩阵是稳定的和可接受的在当前的方法。

3.3.3。线性和LLOQ

线性和LLOQ表进行了总结2。回归方程构造使用y = ax + b公式,代表了分析物的峰面积比和是名义上的分析物的浓度。相关系数(r)> 0.99的MTX和7-OH-MTX。结果显示良好的线性浓度范围。的最低浓度校准曲线的LLOQ MTX和7-OH-MTX,分别。LLOQ是足够MTX和7-OH-MTX治疗的治疗药物监测在临床实践中。

3.3.4。Interday和日内精密度和准确度

盘中,interday精密度和准确度的分析物在表三个浓度水平进行了综述3。的盘中精度分别为0.89% -6.86% -2.47%和1.90% MTX和7-OH-MTX,分别。的interday精度分别为1.84% -6.40% -3.41%和3.19% MTX和7-OH-MTX,分别。interday和MTX和7-OH-MTX治疗盘中的准确性在±15%。结果表明,该方法有一个可接受的再现性(表3)。

3.3.5。稳定

分析物的可接受的稳定性三个冻融循环后,在室温下6 h,被储存在−为30天,80°C,在4°C autosampler 24 h。所有QC样品的结果偏差在±15%,如表所示4。

3.3.6。遗留

结果显示一个明显MTX和7-OH-MTX反应中遗留的空白样品注入超过20%的最高的样本后LLOQ反应。为了解决这个问题,一个空白样品后添加高浓度样品洗提分析物剩余工资,和遗留的MTX和7-OH-MTX不到20%的LLOQ后洗脱的过程。

3.3.7。稀释效应

稀释效应评估,20000 ng / mL飙升的示例是刚做好的,稀释5倍到4000 ng / mL空白的等离子体。正在评估5次后,再保险%和RSD %的稀释系数小于15%,在±15%,符合标准。

3.4。应用程序的方法

最后,49个样本收集和定量分析新开发的方法。政府后,22个样本收集44小时;21个样本聚集在68 h;和其他样本收获92 h。研究提出了一个安全窗口MTX暴露浓度(34),我们的研究结果显示,31.82%的病人患有过度暴露在44 h MTX, 68 h, MTX暴露患者高于阈值占38.09%。此外,在活的有机体内暴露7-OH-MTX远高于MTX在所有三个采样点,这是与以前报道的结果一致26]。此外,一个过高的7-OH-MTX浓度被认为与MTX治疗后肝毒性和肾毒性(35,36]。我们的结果也显示巨大interpatient变化MTX和7-OH-MTX,建议及时和准确的治疗药物监测和拯救MTX和7-OH-MTX在临床实践(图是必要的4)。

4所示。结论

一个敏感、简单和高效UHPLC-MS / MS方法已成功开发和验证的同时测定MTX和7-OH-MTX在人血浆。量化的下限是5 MTX和7-OH-MTX治疗ng / mL。分析时间为3.5分钟,预处理过程是基于一个简单的蛋白质沉淀,开发了一种高通量样品分析。该方法应用于恶性淋巴瘤患者的临床样本结果是有利于避免大剂量MTX治疗后的副作用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突的内容。

作者的贡献

鑫鑫任和志鹏王同样这项工作。

确认

这项工作由上海市自然科学基金的支持,中国(没有。17411972400);上海关键临床药学专业工程(2016-40044-002);和上海重要的薄弱学科建设项目健康科学教育(2016 zb0303)。