文摘

一个创新的方法验证分析厄他培南钠通过毛细管电泳使用磷酸钾缓冲10毫米pH值7和15千伏电压,在70 - 120的浓度范围μ克毫升−1。厄他培南的迁移时间3.15分钟,线性曲线是y = 2281.7 x - 24495 R2= 0.9994。因此,我们提出一个常规分析方法符合绿色分析化学的原则通过毛细管电泳厄他培南钠的常规分析。

1。介绍

毛细管电泳是一个多才多艺的分离技术,可用于广泛的物质。技术由带电物种的迁移,出现在一个电解溶液在毛细管,电场作用,生成当前在其内部。毛细管电泳技术已被用于药物的分离。

2017年2月,在日内瓦,世界卫生组织(世卫组织)发布了首次的耐抗生素“优先病原体,”一个目录列表12家庭的细菌对人类健康构成最大的威胁。抗生素耐药性迅速增加,治疗方案已经丢失。列表中突出的威胁对多种抗生素耐药的革兰氏阴性细菌。厄他培南钠(ERTM) - - - - - -内酰胺从碳青霉烯类抗菌药物。这类药物对革兰氏阳性活动,革兰氏阴性需氧和厌氧细菌。

ERTM是极得复合(图1),由其阴离子区别于其他碳青霉烯侧链组成的苯甲酸酯组。取代苯甲酸的目标是至关重要的维持其抗菌谱;此外,它增加了分子量、亲油性。羧酸单元,电离在生理的pH值,导致净负电荷。因此,ERTM高度与血浆蛋白,每天只允许一次方便的管理(1]。此外,肾dehydropeptidase更稳定,不需要添加任何酶抑制剂与其他药物这一组(2]。


图1
厄他培南与pKa计算钠的化学结构以化学品处理。 来源:https://chemicalize.com/ /计算。

得物种代表的大多数化合物在制药行业分析。ERTM分子呈现酸性,基本和两性pka。使用在线平台pKa值计算以化学品处理这产生了酸性最强的pKa 3.22和最基本的pKa为9.03。

毛细管电泳(CE)是一种重要的技术分析许多制药和生物制药的物质。CE技术已被广泛用于分析小分子药物、辅料、制药和反离子,测定杂质的分析蛋白质,糖蛋白,复合碳水化合物,liposaccharides, DNA治疗,病毒粒子。CE是其中一个最强大的技术应用作为特征选择的方法和质量控制的生物分子在生物制药行业。这样一个强烈增长的行业,需求有一个不可避免的先进的分析技术,可应用于敏感和可靠的工具在开发这些产品和质量控制,以确保他们的安全和效率3- - - - - -6]。

目前,越来越多的需求更快、更经济、环保的分析方法。公元的分析分离技术,被认为是一个“绿色”的选择由于其低蒸气压,低样品体积,减少分析时间,因此可以减少溶剂的使用生成和减少浪费。因此大大有助于电力能源的有效利用,进一步使开发的方法不使用有毒溶剂,使其安全分析师。对于这些属性,它提出了一个环保的技术(7,8]。

毛细管电泳技术提出了常规分析框架的质量控制的药物制药配方(9- - - - - -12]。CE也被视为一个绿色食品替代分析(8]。,实验室已经开始考虑CE标准的常规程序分离的样品(13]。

绿色化学是一个当前的话题,一直被忽视的学术团体和不同地区是全球受到研究人员和企业环保意识。分析方法,优化环境可持续性已经在文献中提出环保的方法;生态方法;绿色分析方法;环境友好的方法([7,14- - - - - -23];Totoli et al ., 2014)。有效和可靠的分析方法,量化抗菌内容,评价药品质量至关重要。因此,这项工作提出了一种毛细管电泳方法,常规评价厄他培南钠注射用冻干粉。

2。实验

2.1。装置

方法进行P / ACE™最小检测量(贝克曼库尔特™)毛细管电泳系统与紫外检测器和熔融石英毛细管内直径为75μ375米,外径µ米,30厘米的有效长度,总长度40厘米。使用的电解质在pH值7 10毫米钠磷酸盐缓冲剂。分析天平模型SECURA2250-1S(缝匠肌™,Goettingen-Germany)使用。化学品使用厄他培南钠98.8%(身份证号码1407011333 e)和厄他培南钠注射用冻干粉(很多EB004C1)请由默克公司捐赠大幅& Dohme™。毛细管进行清洗与氢氧化钠溶液浓度的盐酸1米和0.1米和0.1米以及纯净水通过Milli-Q™+设备(美国微孔™)。所用的试剂退化0.01 M盐酸(Qhemis™), 0.01 M氢氧化钠(Cinetica™),和0.03% M / M过氧化氢(Vetec™)。所有的解决方案都是透过一个尼龙膜为0.45μ米孔隙大小和47毫米直径(微孔™)和脱气在超声波浴,型号2510 e-mt(美国Danbury-CT布兰森™)。

2.2。方法

毛细管电泳方法进行使用10毫米磷酸钠缓冲区作为电解液pH值7;在每个分析这种电解液的毛细管被2分钟。分析使用15千伏电压、电流48µ,注射时间5秒(0.5 psi)的压力。筒的温度是25°C和检测器波长被设定为214海里。电解液稀释剂的解决方案,解决方案用来促进退化,佐剂氢氧化钠和碳酸氢钠进行评估作为空白的解决方案,没有任何的痕迹ERTM,评估可能的干扰峰在分析。该方法验证按照指南(24,25]。定量限度,评估参数线性检测极限,选择性、精度(重复性精度和中间),精度和鲁棒性。

为了评估该方法的鲁棒性,管理者用缅甸语的因子矩阵。在这个数学模型可以评估同时小改变参数。这个阶乘矩阵已成功应用于鲁棒性的评估在许多分析技术([26- - - - - -32];Pedroso,萨尔加多,2014)

2.3。解决方案

ERTM参考化学标准(RCS)股票的解决方案是由传输10毫克的ERTM RCS 10毫升容量瓶,它充满了超纯水获得浓度为1000μ克毫升−1。整除从这个股票的解决方案被转移到10毫升容量的玻璃瓶,卷的完成与水,70年获得工作的解决方案,80年,90年,100年、110年和120年µ克毫升−1。五瓶ERTM注射用冻干粉称重,计算平均体重。这些瓶的内容不一。股票的解决方案从ERTM冻干粉准备以同样的方式作为ERTM RCS股票上面描述的解决方案。

2.4。电解液制备

准备的10毫米磷酸钾缓冲溶液pH值7,136毫克的磷酸氢二钾和40毫克的单碱的磷酸钾溶解在100毫升纯净水。必要时,pH值调整使用6到7米磷酸或10米氢氧化钾作为推荐的巴西药典[33]。

3所示。结果与讨论

初步测试进行评估的参数,在一起,可以提供一个可靠的方法。毛细管长度的定义是很重要的,因为迁移时间是影响有效长度(长度的注入点探测点),但也总毛细管长度和分离电压。这是决定工作最初的毛细管40厘米总长度和30厘米有效长度。如果有必要,这个长度可以调整,但是这似乎是足够的。

不同缓冲溶液在不同的小灵通作为电解质进行了测试。通常,缓冲系统是有效的pH值范围相应的pKa,正负一pH值单位。,一些选项的缓冲溶液作为电解质进行了测试。

在熔融石英毛细管,pH值的工作可能范围从2到11;然而,一个还应该考虑分子的稳定pH值范围和自己的pKa,然后选择合适的电解液。这就是为什么,当分离涉及分子酸碱性质,分子的电泳淌度取决于电解质博士在这种情况下,有效流动,包含产品的电泳淌度的物种平衡,每一物种的相对浓度分布的pH值,必须考虑。

因此,pH值控制建议,选择一个合适的缓冲溶液对分离的优化有直接的影响。通过这种方式,以化学品处理在线软件被用来评估约旦种的分布与pH值,通过这样做,定义电解质的最佳pH值范围。图2显示了ERTM这个约旦种分布。约旦种分布图表中的每一种颜色代表不同的质子化作用分子状态计算,允许我们把主要的质子化作用形式在pH值决定的。


图2
分布ERTM约旦种与可视化以化学品处理。约旦种的曲线被分配根据以下颜色代码:深蓝色:ERTM+;黄色:ERTM中性、绿色:ERTM中性;紫色:ERTM- - - - - -;橙色:ERTM2 -;浅蓝色:ERTM3 -;红色:ERTM4 -。 每一种颜色在约旦种分布图代表了质子化作用可以检查在线平台以化学品处理 https://chemicalize.com/ /计算。

在分析厄他培南钠的约旦种的分布在每个pH值,在pH值约的可能性或11验证了。因此,磷酸盐和硼酸缓冲选择了最初的测试。

硼酸缓冲是一种最缓冲区用于毛细管电泳;它是首选的,因为它有大量离子较低的流动性和可用于高浓度没有产生过热的缺点。然而,它的缺点是吸收更多的紫外线地区相比,磷酸缓冲。此外,它是使用一个不明智的电解质与酸碱接近工作极限,为了保持毛细管并保证结果的可重复性,因为高度碱性pH促进溶解二氧化硅毛细管中。因此,硼酸缓冲酸碱10和磷酸盐缓冲7选择厄他培南钠的分析。正如所料,ERTM高峰使用硼酸缓冲pH值10被扭曲了,前面的尾巴可能因为阴离子分子迁移不同于电解质离子迁移。相比之下,磷酸盐缓冲显示对称峰,因此选择进一步方法开发。

高电解质浓度和外加电压可以妥协分离由于多余的热量由焦耳效应引起的。焦耳加热导致的形成温度梯度和生成一个电流在毛细管内,导致已经分离的混合乐队和导致峰值的色散。这种效应可以最小化应用程序的适当的电压和低浓度的使用缓冲区加上良好的温度控制。然而,缓冲溶液与低浓度可能会增加分子的吸附趋势毛细管壁和峰值electropherogram尾矿可以观察到。此外,在低浓度时,电渗流量可能变得不稳定,阻碍了重复性的迁移时间和因此损害下物质的识别和量化分析。高电阻的高电场的毛细管允许应用程序,因为它会生成一个最小加热;此外,毛细管的形状提供了高效的损耗所产生的热量。使用高电压的优点是获得的分辨率和效率,减少分析时间34]。

电解液浓度和设备电压进行调整以获得电流不大于50μ,一系列的设备之前验证使用,尽管理论上说,它有能力工作到300年μ答:因此,磷酸盐缓冲剂的浓度被设定为10毫米和15千伏的电压。包含毛细管的筒的温度控制在25°C。

“死亡”迁移时间验证了利用电解液的空白解决方案本身。氢氧化钠和碳酸氢钠佐剂,以及使用的解决方案,促进药物降解ERTM没有任何痕迹,为了评估使用任何其他可能的山峰在分析。有辱人格的解决方案提供一个小基线在2分钟迁移时间振荡。在这个迁移时间,红色的小高峰出现在electropherogram图A1(补充材料)对应于m / m 0.03%过氧化氢溶液用来促进强迫药物降解。

因此,它已经发现,没有干扰退化的解决方案和/或制药配方中包含的佐剂ERTM量化的方法,由于ERTM的迁移时间是3.2分钟。定性分析是由比较ERTM RCS的重复与ERTM注射用冻干粉显示相同的迁移时间(图3)。


图3
比较ERTM重复RCS(蓝色)与ERTM注射用冻干粉(黑)的毛细管电泳方法。
3.1。系统适用性测试(SST)

进行系统适用性测试评估系统分辨率和重复性,确保完整的测试系统是适合目标应用程序。为了获得所需的数据,10解ERTM参考标准浓度的100μ克毫升−1准备和分析了CE。等参数校正峰面积、迁移时间,塔板数(N),和相对标准偏差(%相对标准偏差)计算及其验收范围进行分析根据玻色,2014年一样色谱法(35)(表1)。

表1
系统中参数评估合规分析,测定ERTM毛细管电泳。
3.2。冻干ERTM计算平均含量粉末注射

的平均含量ERTM冻干粉末注射的剂量计算化学与参考样本,一式三份,在100年的浓度μ克毫升−1。样品溶液的读数进行评估的波长214 nm。厄他培南钠的浓度计算出的样品(1)及其内容的比例(2)。内容发现平均为99.94%,RSD为0.85%。 在哪里 样品的浓度(μ克毫升−1), 是内容, 化学浓度的参考标准(μ克毫升−1), 是样品峰面积校正, 是参考标准纠正峰面积, 在样例ERTM的理论浓度(μ克毫升−1)。

3.3。方法验证

该方法验证根据国际协调委员会指南我,2005和协调指导单IUPAC实验室验证的分析方法(25,36)线性、选择性、准确性、精度、鲁棒性,检测极限,和量化的限制。

3.3.1。线性

ERTM进行了线性回归分析。分析曲线是由策划的平均浓度与纠正每个ERTM RCS浓度的峰面积值。三个不同的试验进行了一式三份。最小二乘法的回归直线计算(图A2在补充材料)。由方差分析(表统计评估2)。数据的方差齐性被绘制残差(图研究A3在补充材料),推荐的RDC # 166,提供了分析方法的验证和其他措施(24]。标准的残留物是不到2%,因此该模型是适合使用。值被报道的平均%相对标准偏差的校正曲线。

表2
方差分析校准曲线的厄他培南钠RS毛细管电泳。
3.3.2。检出限(LOD)和量化限制(定量限)

LOD和使用校准曲线是确定定量限一式三份和计算为3 /秒和10 / S,分别在“S”校准曲线的斜率和“ ”是响应的标准偏差。

3.3.3。精度

可重复性盘中(精度)精度和中间(interday精度):重复性研究执行七决定样本的平均浓度的校准曲线。当天准备的解决方案和分析在相同的实验条件。中间精度评估的一式三份的平均百分比RSD为获得分析在不同的日子。

3.3.4。精度

通过恢复试验,获得了精度ERTM已知数量的参考标准被添加到一个已知数量的样本。恢复了在3种不同浓度,R1, R2和R3,相当于80年,100年,120%的平均浓度(表3)。每个模拟样本(R1、R2和R3)化验在一个独立的审判。一式三份和比例恢复执行的分析(R %)计算根据方程(3)的协会的官方分析化学家。 在哪里

表3
毛细管电泳方法的准确性,通过恢复试验获得。

后总药物浓度测量的标准;

是完全配方中药物浓度;

是标准的浓度添加到配方。

表4总结了方法验证和百分比含量测定的结果。

表4
毛细管电泳的结果验证和百分比含量测定方法。
3.3.5。选择性强制降解的研究

压力的研究是由国民ERTM注射用冻干粉(100µ克毫升−1)加速降解碱性、酸性、中性、氧化、热,和光解的压力,为了评估ERTM定量上的降解产物的影响。酸水解进行了在0.01 M盐酸,基本在0.01 M氢氧化钠水解,氧化压力解决方案研究,样品溶液的ERTM准备使用M / M 0.03%过氧化氢水作为稀释剂。5天的解决方案进行评估。同时,也是一个控制样本(仅ERTM溶解在水里)是用于比较注射。ERTM的光解的压力是通过暴露的样本ERTM注射用冻干粉254纳米的紫外线。注入样品ERTM冻干粉,被包裹在铝箔,被用作黑暗控制没有干扰。真实样品和黑暗的控制被放置在单独的玻璃培养皿和遍布这道菜给不超过3毫米的厚度,按照我的指导方针。两个样品都暴露在紫外线5天。固态热应力,整除的ERTM注射用冻干粉被存储在强调每小时50°C和分析。结果如表所示5。

表5
强制降解的研究。
3.3.6。鲁棒性

鲁棒性是评估通过小改变参数来证明该方法的有效性。Plackett-Burman阶乘设计同时被选来评估这些参数,即15实验与7参数范围较高层和较低层。

的表6,7,8显示Plackett-Burman测试中使用的因子组合,字母A到G代表所选参数。数字1到15 th数量占实验(2 n + 1), n是参数的数量,(0)对应于正常的预设参数的过程和数字(1)和(1)是这些参数的较高层和较低层。

表6
因素和水平的变化使用Plackett-Burman的实验模型。
表7
鲁棒性测试使用Plackett-Burman的实验模型。
表8
因素评价Plackett-Burman的实验模型。

鲁棒性是决定从注射标准和样品的解决方案包含100μ克毫升−1在相同的实验条件下ERTM。每个参数的影响是由比较的平均剂量进行相应一式三份化验正常范围的平均用量对应修改后的水平。每个变量的平均效应之间的平均差异所作的观察修改水平和那些在最优水平。每一个参数的偏差计算通过使用的方法论Youden和斯坦纳(37,38]。方程(4)给出了一个例子关于这种方法评估更改参数的影响:缓冲浓度。类似的其他参数进行了评估。 在哪里

每个改变参数的偏差(DA, DB特区等)应小于√2年代推断所带来的价值变化的参数获得的影响不显著。所选择的方法是健壮的所有参数(表9)。

表9
结果通过CE ERTM分析的鲁棒性。

4所示。结论

毛细管电泳技术的应用程序有很多。一些研究涉及的监测环境污染物(39]。它也被用于金属测定(40),以及食品分析(41,42)和药物分析(43- - - - - -47]。在这项研究中,我们使用ERTM开发的协议验证的毛细管电泳方法基于绿色化学的原则,作为常规药物的选择分析。

系统适用性测试之前进行验证,确保所选参数足够了。拟议的毛细管电泳方法验证ERTM常规量化参数的选择性、线性度、精度、准确性、量化的限制,检测极限,建议在国际准则(25]。

ERTM迁移时间为3.2分钟,从而提供快速的毒品的决心。选择性是由对厄他培南钠样品应力条件的强制降解碱性,酸性,中性,氧化,光解的媒体。没有发现产品可能干扰药物量化。

校准曲线的线性评价建筑一式三份,提出了方程y = 2281.7 x - 24495 R20.9994。执行统计方差分析(方差分析),结果表明,没有重大偏差的线性度,因此,该方法的线性范围内70 - 120µ克毫升−1。

获得的平均含量在三个不同的浓度在线性范围内应该评估一式三份,RSD < 2%。厄他培南的内容分析样品中的钠为99.94%,RSD为0.85%。

该方法评估根据重复性和中间的精度。一式三份的水平获得ERTM RCS的化验与ERTM在注射用冻干粉提供了一个相对标准偏差< 2%。

Plackett-Burman阶乘的鲁棒性评估模型,在分析参数同时发生的小变化。没有改变效应提出了一个重要的结果相比,参考价值,从而证明方法是健壮的。

恢复测试的准确性是评价一个已知数量的分析物添加到样本,由官方分析化学家协会(24,48]。方法准确性由回收试验证明,自平均恢复比例为100.59%,RSD为1.09%。

因此,另一种方法色谱方法开发,使用减少样本数量的优点,还具有低分析时间和不使用任何类型的有机或者有毒溶剂,和安全分析师和不产生有毒废物处理。毛细管电泳是一个绿色分析技术,因为它不会对环境造成破坏。拟议的电泳方法线性、精密度、准确度,根据当前的指导方针和鲁棒性;因此,它可用于定量分析厄他培南钠在制药行业。

就像色谱,毛细管电泳分离技术,可用于广泛的物质。虽然不是用作色谱技术,毛细管电泳由于突出的高分离能力和少量的样本和试剂,低残留一代,低毒性、低成本分析,减少相比,高效液相色谱分析时间。毛细管电泳是一种互补分离技术对常规分析和获得利益由于其重要的绿色性格。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

在这项研究中,没有利益冲突。

确认

作者非常感谢实验室默克大幅& Dohme捐赠厄他培南,FAPESP-Fundacao德帕罗尽管Estado de圣保罗,巴西,项目2013/12959-0 2009/14825-6,财政支持。

补充材料

图A1:空白的解决方案:电解质、佐剂和有辱人格的解决方案没有任何ERTM的痕迹,与毛细管电泳分析方法。图A2:线性曲线ERTM CE。图A3:CE方法的方差齐性。图A4:中性的退化(室温在25°C),后120小时。图A5:光解的压力(短波紫外线254年光)。图A6:盐酸酸降解(0.01米),后120小时。图A7:碱性降解(0.01 m氢氧化钠),后36小时。图A8:氧化降解(0.3% H2O2),24小时后。图A9:热应力(烤箱在50°C), 1小时之后。(补充材料)