简单的量化Pentosidine人类尿液和血浆通过高效液相色谱法

文摘

Pentosidine是一种先进的糖化最终产品(年龄)和荧光化合物交联。一个简单的高效液相色谱(HPLC)方法开发的检测和量化pentosidine人类尿液和血浆。使用的流动相梯度系统改善pentosidine分离内生山峰,和色谱监测荧光激发和发射波长的检测器集的328和378海里,分别。pentosidine的保留时间为24.3分钟,量化的下限(LLOQ)在人类尿液和血浆1海里。盘中分析精度(变异系数)是普遍偏低,发现在5.19 - -7.49%和4.96 - -8.78%的范围为人类尿液和血浆,分别。相应的值的interday试验精度分别为9.45%和4.27%。精度(相对误差)从87.9%到115%不等。Pentosidine pH值稳定在一个范围的解决方案,人类的尿液,等离子体。总之,这种高效液相色谱的方法可以应用在未来的临床前和临床评价pentosidine的糖尿病患者。

1。介绍

Pentosidine是一种先进的糖化最终产品(年龄)和荧光化合物(图1)。准备从精氨酸、赖氨酸和戊糖通过连续的糖基化和氧化反应(1]。此外,pentosidine形成胶原蛋白中赖氨酸和精氨酸残基之间的交叉连接。

Pentosidine水平被发现是高架在终末期肾病,糖尿病,风湿性关节炎(2]。在患有2型糖尿病(T2DM)病人体内特别是pentosidine水平与糖尿病并发症的存在和严重性(3]。最近,pentosidine研究作为一个潜在的诊断制造商对这些疾病。Pentosidine水平升高在2型糖尿病患者的尿液和血清,与重要的高度组织的首次发现2型糖尿病患者(4,5]。研究糖尿病研究人员因此针对性pentosidine作为生物标志物通过测量交联胶原蛋白在不同组织(6]。最近的一份报告也表明,非酶的交联之间有很强的相关性的pentosidine骨头和血浆同型半胱氨酸。这两个参数是已知引发事故骨折,不论年龄和骨矿物质密度(7]。

这些研究,然而,面对困难测量pentosidine尿液和血浆等生物样品的水平。大多数分析方法的高性能脂质色谱采用盐酸水解与集中通过加热在110°C在一个密封的玻璃管。这种方法需要很长时间和带来严重危险由于强酸性2,8,9]。因此需要一个额外的方法来消除内源性废弃物和提取pentosidine,涉及复杂的高效液相色谱仪器如column-switching阀(10]。的酶联免疫吸附试验(ELISA),量化的下限(LLOQ) pentosidine是合理的(0.1点),但这种方法需要酶消化24 h和可再生的比高效液相色谱法(11]。

为了克服这些缺点,我们开发了一个简单、快速、准确的方法来分析人类尿液和血浆pentosidine水平。本文描述了一个简单的样品制备过程(除蛋白)其次是高效液相色谱法结合荧光检测。

2。实验

2.1。化学物质

Pentosidine是由开曼化学公司(美国安阿伯市MI)。Heptafluorobutyric酸(HFBA)从西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州,美国)。肝素钠和0.9% NaCl-injectable解决方案获得JW制药公司(韩国首尔)。人血浆从生物化学购买服务(美国弗吉尼亚州温彻斯特)。各种缓冲溶液的pH值2.0,4.01,7.0,9.21,和10.0买来梅特勒-托利多(美国哥伦布,哦)。其他化学物质是试剂级或高效液相色谱级和使用前未经纯化。

2.2。高效液相色谱仪器

色谱设备是Shimazu突出LC-20A高效液相色谱系统(Shimazu,京都,日本)配备低压梯度单元(LC-20A),一个autopurge,一个在线真空脱气autosampler (SIL-20A)和可编程温度控制,加热柱室和高度敏感的荧光检测器(RF-20A / RF-20Axs) (12]。高效液相色谱系统的所有组件都通过CBM-20A系统控制器控制。色谱分离pentosidine上执行一个C₁₈反相柱(AegisPak 4.6毫米身份证。,25厘米 ,粒度5μm,年轻的金Biochrom,凭借韩国)样本过滤后通过一个0.45μm过滤器(美国微孔,Billerica的)。

2.3。色谱条件

二元梯度系统使用的流动相的流速0.8 ml / min。溶剂是100%乙腈溶剂B HFBA 0.1%水。流动相开始90%溶剂B。3分钟后,溶剂B是改变使用的线性梯度从3到24分钟90 - 78%,紧随其后的是一个梯度的78 - 5%从24到33分钟。33分钟后,溶剂B是3分钟从5%上升到90%。平衡列,90%溶剂B是维持另一个3分钟。色谱监测了一套荧光检测器在激发和发射波长的328和378海里,分别。进样体积是100μl

2.4。制备生物液体样品标准

股票pentosidine溶液是溶解在二甲亚砜(DMSO) 2毫米的浓度。适当稀释股票的解决方案是用HPLC-grade水。pentosidine的标准解决方案在人类尿液和血浆与适当的体积由飙升pentosidine股票的解决方案给最终浓度为1,2,3,4,5、10、20、50 nM人类尿液和1、2、5、10、20、30、40、50 nM在人血浆。所有的样品都存储在一个−70°C冰箱直到pentosidine高效液相色谱分析。

2.5。生物样品制备

人类尿液从健康男性受试者。血浆和尿液样本从患者获得了亚州大学医院的内分泌和代谢单元,韩国水原韩国。协议和同意书制度审查委员会批准亚州大学医学院(ajirb -地中海- smp - 14 - 109)。pentosidine检测化验后最初的样品除蛋白方法。简单地说,200年μl(乙腈是添加到100年μl整除的尿液或等离子体和混合旋涡混合器。vortex-mixing后,混合物在12000转离心10分钟,和250年μl的上层清液转移到清洁管和蒸发下温柔的氮气流在40°C (Eyela、东京、日本)。由此产生的残渣与150年重组μHFBA l(0.1和100年μl被注入到高效液相色谱系统。

2.6。方法验证

2.6.1。选择性

基底内源性pentosidine水平首先测量nonpentosidine飙升尿液和血浆样本。尿液和血浆样本随后攀升pentosidine和每个nonspiked飙升样本化验一式三份。精度分析是评估通过测量pentosidine水平飙升样品和计算的比例附加测量pentosidine水平(13]。

2.6.2。线性

探测器响应的线性关系和pentosidine浓度确认1-50海里的浓度范围内对人类尿液和血浆样本。校准曲线的斜率、截距和测定系数的计算是通过绘制峰面积()pentosidine对标称浓度(人类尿液和血浆)的标准,使用 加权最小二乘线性回归(12,14]。

2.6.3。复苏

pentosidine的效率分析人类尿液和血浆的决心通过比较平均响应,从三个复制每个pentosidine标准样品浓度,在人类尿液和血浆,pentosidine从水的平均响应标准当量浓度除蛋白后的过程。复苏的pentosidine决心在人类尿液和血浆浓度范围研究。

2.6.4。精密度和准确度

评估方法的精密度和准确度,八点我们分析了标准样品浓度水平(最低,1海里;最高,尿液和血浆50 nM),三个复制在三个独立的日子。每个标准样本的响应因子计算减去nonspiked上升的响应因子标准响应因子,其次是除以飙升的浓度。平均值的标准偏差(SD)和SD比平均变异系数(CV)计算并用来评估的精度分析。测定的准确性进行比较计算平均浓度的实际浓度连续稀释。精度要求是在85 - 115%的名义浓度,和内部interday精度(由CV)不超过10%12,14]。

2.6.5。下限的检测和量化

检测下限(LLOD)被定义为信号的峰值pentosidine等于平均背景噪音水平的三倍。LLOQ被定义为pentosidine给的最低浓度之间的线性关系上升标准响应因子/ nonspiked响应因子和飙升的浓度的准确性 % (13]。

2.7。稳定性试验

pentosidine在生物样品的稳定性评估通过比较最终浓度的初始浓度pentosidine后在指定条件下孵化。最后一个数据被表示为一个百分比的初始浓度。

2.7.1。短期和长期稳定

pentosidine人类尿液和等离子体的稳定性是评估通过分析一式三份的样品暴露在不同条件下(孵化时间和温度),5和50 nM的浓度。短期稳定人类尿液和血浆评估通过分析样品保持在4,25岁和37°C, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12和24小时。长期稳定被分析样品确定后存储在70°C−1、2、4、7天,2,4,6,8周。最后的结果进行了比较与那些获得了刚做好的样品。所有样本被保存在冰箱−70°C到pentosidine的高效液相色谱分析。

2.7.2。稳定的缓冲方案在不同的pH值

Pentosidine股票的解决方案是在每个玻璃上升试管包含5毫升缓冲溶液的pH值2.0,4.01,7.0,9.21,和10.0最终Pentosidine浓度的5和50 nM。vortex-mixing之后,每个测试管被放置在一个水浴除尘在25岁和37°C 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12和24小时。孵化后,50μl整除的缓冲溶液被从每个试管在指定时间点和直接注入高效液相色谱柱。

3所示。结果与讨论

基于荧光吸收光谱,最佳的激发和发射波长出现在328和378海里,分别。这些波长pentosidine因此用于高效液相色谱分析,考虑到背景荧光和检测灵敏度15]。图2人类尿液(图显示典型的色谱图的空白2(一个)),人类尿液中掺入5 nM pentosidine(图2 (b))和尿液的2型糖尿病患者(图2 (c));人血浆的相应的色谱图如图3(一个),3 (b),3 (c),分别。pentosidine峰值被发现对称和筛选了大约24.3分钟。没有其他干扰内源性物质的生物样本,除了内生pentosidine基底。

相关系数()的标准曲线pentosidine人类尿液和血浆样本大于0.999和0.980,分别为(数字4(一)和4 (b)人类尿液和血浆)的LLOQ pentosidine 1纳米是基于响应因素之间的线性关系,减去nonspiked响应因子的飙升标准响应因子,以及飙升pentosidine浓度的准确性 %(表1和2)。

精度之间的CVs被定义为三个复制样品。的平均盘中CVs pentosidine人类尿液(表1)和等离子体(表2)通常是低,6.34(5.19 - -7.49%)和6.80%(4.96 - -8.78%),分别为。意味着interday CV值相同的样本在连续三天人类尿液和血浆分别为9.45和4.27%,分别。pentosidine的平均精度为89.5 -106%和87.9 -103%人类尿液和血浆,分别(表1和2)。精密度和准确度值是可以接受的范围内,所述由美国食品和药物管理局(16]。pentosidine人类尿液和血浆的平均恢复了109%(97.2 - -114%)和52.1%(41.6 - -57.3%),分别为(表1和2)。低的原因恢复pentosidine从人血浆可能在等离子体比尿液pH值越高(17];平均pH值5.5和7.4在人类尿液和血浆,分别。Pentosidine不溶于高pH值的解决方案,而不是完全从胶原蛋白在等离子体中恢复过来17]。

Pentosidine稳定在人类尿液4中,25岁和37°C;超过91.5%的化合物浓度保持在原来的5和50 nM 24 h后孵化(数据没有显示)。Pentosidine也稳定在人血浆5和50 nM 24 h孵化;超过92.0%的pentosidine在4孵化后恢复正常,25岁和37°C(数据未显示)。Pentosidine也是稳定的缓冲溶液的pH值为2.0,4.01,7.0,9.21,和10.0;飙升的复苏pentosidine(5和50 nM) 24小时后孵化范围从90.3到109%在25岁和37°C,分别(数据没有显示)。我们还发现pentosidine稳定在−70°C长时间;超过99.0%和94.0%的pentosidine仍长达8周人类尿液和血浆浓度分别在5和50海里(数据未显示)。

Pentosidine水平被发现在尿液和血清升高2型糖尿病患者(3- - - - - -5]。我们因此发达高效液相色谱法应用于2型糖尿病患者的尿液和血浆评价pentosidine pentosidine的水平,证实了检测病人的尿液和血浆样本在2型糖尿病患者。基于我们的研究结果,我们可以应用于新开发的高效液相色谱方法检测pentosidine人类尿液和血浆样本作为诊断糖尿病患者的标志。

4所示。结论

总之,开发了一个简单的和敏感的高效液相色谱方法测定pentosidine水平在人类尿液和血浆和验证基于美国食品和药物管理局的指导方针。此外,pentosidine人类尿液,被发现是稳定的等离子体和各种缓冲溶液pH值范围从2到10到24小时。这些结果支持使用pentosidine糖尿病在临床测试。

同意

在这项研究中使用的所有人血浆和尿液样本后获得受试者给书面知情同意。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

这项研究受到了亚州大学研究基金会(2016),韩国,和韩国卫生技术研发项目,通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI),这是由卫生部和福利,大韩民国(HI16C0992)。

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