一种测定脑膜炎球菌多糖疫苗分子大小分布的高通量尺寸排除色谱方法

摘要

脑膜炎球菌多糖疫苗的分子大小分布是一个很容易识别的参数，直接与免疫原性相关。本文报道了一种尺寸排除色谱法，以确定脑膜炎球菌多糖(ACWY)疫苗中a、C、W和Y血清群的分子尺寸分布和分布系数值。分析是在XK16/70柱上进行的，XK16/70柱含有6个不同批次的Ingovax®ACWY, Ingovax®ACWY是孟加拉国Incepta vaccine Ltd.生产的脑膜炎球菌多糖疫苗。采用火箭免疫电泳定量法测定各血清群多糖含量。计算出A、C、W、Y血清群的分布系数值为，，,，符合《英国药典》的要求。该方法被证明是一个稳健的确定分配系数值，这是一个强制性的要求，疫苗批次释放。

1.介绍

脑膜炎奈瑟氏菌是人类细菌性脑膜炎和致命败血症的主要原因[1，2]．由于较高的发病率和死亡率，它已成为全球公共卫生的严重威胁[3.，4]．在13个免疫不同的血清群中，只有6个(A、B、C、W、X和Y)与临床相关并与侵袭性脑膜炎球菌病有关[5]．在大多数情况下，A、C、W和Y血清组是流行性脑膜炎的主要原因，有针对这些血清组的保护性疫苗[6]．每个血清组的相对离散度随时间、种族、地理位置以及某些情况下的社会经济因素而变化[7- - - - - -9]．在非洲“脑膜炎地带”，对A和C血清组暴发的规模进行了监测[10]．血清组W在2000年和2001年对朝觐朝圣者是一个威胁[11- - - - - -13]．最近，流行病学监测显示，血清Y型脑膜炎球菌病在欧洲一些地区迅速增加[14]．在过去30年里，印度、印度尼西亚、蒙古、尼泊尔、巴基斯坦和越南反复发生了血清组a(或在越南发生C)脑膜炎球菌流行[15]．在孟加拉国，由脑膜炎球菌感染引起的细菌性脑膜炎在成人和儿童中造成了严重的发病率和死亡率[16，17]．据一项细菌性脑膜炎的研究报道，在189名确诊患者中，有136人患有脑膜炎脑膜炎奈瑟氏菌孟加拉国的A或C组感染。还声称，这些脑膜炎球菌感染的病死率为10%。

荚膜多糖的脑膜炎奈瑟菌是免疫原性的，用作预防脑膜炎球菌疾病的疫苗。脑膜炎球菌多糖ACWY (PS)疫苗是由A群脑膜炎球菌荚膜多糖(O-乙酰化的重复单位N-acetylmannosamine,与磷酸二酯键)，C (O-乙酰化的唾液酸重复单位，与糖苷键)，W (O-乙酰化唾液酸和d -半乳糖交替单位，与和糖苷键)和Y (O-乙酰化唾液酸和d -葡萄糖的交替单位，与和糖苷键)18，19]．特别是，PS疫苗的效力取决于特定的免疫化学和物理性质。多糖的分子大小是与疫苗免疫原性和效力直接相关的主要参数之一[20.- - - - - -22]．该参数直接参与诱导持久免疫记忆[23]．此外，在生产过程中，常规监测批到批一致性是至关重要的[20.- - - - - -22]．

基于分子大小的色谱分离，又称大小排斥色谱(SEC)，是由Synge首先提出的[24］．它是一种广泛用于确定高分子材料(如蛋白质、核酸和多糖)的分子大小分布(MSD)的技术[25]．色谱介质的选择对于测定分子大小分布(MSD)是必不可少的，因为介质规格的可变性[20.]．细菌荚膜多糖的MSD可以通过使用琼脂糖或交联琼脂糖(例如琼脂糖CL-4B)来确定[26]．McCauley和他的同事认为，sepharose CL-2B在治疗MSD方面比sepharose表现更好[27]．使用琼脂糖CL-4B(4%的交联琼脂糖基质)的研究报告显示比两种琼脂糖CL-2B更好[28]和sepharose 6B的性能[29]．

脑膜炎球菌多糖可以通过测定磷含量(血清A组)或唾液酸含量(血清C、Y和W组)来估计[19，30.]．然而，通过上述方法很难估计四价脑膜炎球菌PS疫苗中ACWY多糖混合物的血清特异性多糖含量。免疫化学方法可用于从混合多糖中提取血清特异性多糖。一种可靠的、定量的免疫化学方法对于估计多糖含量是至关重要的。为此，英国药典(BP) [19]及世界卫生组织(世卫组织)[26已将火箭免疫电泳列为一种广泛使用的工具。

多价疫苗中单个多糖的MSD分析一直是一个难题。建立一种快速、可重复性的测定ACWY脑膜炎球菌四价疫苗MSD的方法，有助于疫苗科研人员和产业界开发有效的多价疫苗。本文介绍了一种测定ACWY四价脑膜炎球菌多糖疫苗MSD的SEC方法。本实验主要对分配系数()的价值，每个血清组的6个不同批次的脑膜炎球菌PS疫苗。

2.实验

2．1．脑膜炎球菌PS疫苗制备

这项研究使用了孟加拉国Incepta疫苗有限公司生产的一种四价脑膜炎球菌多糖疫苗Ingovax ACWY。它是一种含有≥50种的冻干疫苗μ用6批Ingovax ACWY疫苗测定每个多糖血清群的洗脱谱。从每个批次中，40个含有≥2.0 mg PS的小瓶在2.5 mL 0.2 M NaCl (pH 7.39，第二。21.2 mS/cm)。

2．2．色谱柱制备

XK16/70 (GE医疗保健)列(孔隙度10μM)在本研究中使用。柱填料为琼脂糖CL-4B(粒径45μm - 165μ米)(通用电气医疗集团)。这些交联珠形成的琼脂糖基质颗粒的排除限制在70至20,000 KDa之间。所有色谱操作均在温度为．

2．3．尺寸排除色谱(SEC)

使用AKTA净化器100 (GE Healthcare)对MSD进行SEC分析。使用Unicorn 5.2软件包进行编程方法运行和数据分析。采用注入200的方法进行了柱性能试验μ用纯化水作为洗脱液，用2% (v/v)丙酮(Sigma)通过柱。利用Unicorn软件计算填充柱理论板数为7173板/m，峰不对称因子为1.05，符合sepharose CL-4B柱使用的接受标准(图1）.

用1.5 CV = 187.5 mL (1 CV = 125 mL) 0.2 M NaCl (pH 7.39, cond。21.2 mS/cm，温度25°C)。注射重组疫苗样品2ml(采用2ml样品回路)，流速为0.3 mL/min。采用自动分数收集器收集固定体积的2ml分数。这些馏分储存在−20℃，待进一步测试。

2．4．的决心

的Ingovax ACWY疫苗的数值按照Ackers的公式计算[31，32]， 在哪里无效卷,是床的总容积，和洗脱体积。

在这里,解释珠的外部部分，并通过使用一个分子，这是大于排除限制的特定矩阵。小分子洗脱液在柱的末端，被确定为．在这种方法中,和分别用0.2% (w/v)蓝色右旋糖酐2000、与蓝色染料共价结合的多糖、MW 2000 KDa (GE Healthcare)和0.5% (w/v)叠氮化钠(MW 65 Da) (Sigma)测定。蓝色右旋糖酐2000和叠氮化钠分别在206nm和260nm处的吸光度(图2）.洗脱体积()，通过估计多糖的主峰来计算。在本实验中，我们之前也计算了洗脱多糖的回收率值为0.50，公式如下:

2．5．火箭免疫电泳

采用火箭免疫电泳(RIE)法测定各血清组多糖含量。简单地说，琼脂糖(1%)(HiMedia)在20毫升的0.1 M Tris缓冲液中，pH值为8.2，在加热套中煮沸。液体琼脂糖被冷却到50-55°C和200°CμL (脑膜炎奈瑟氏菌加入抗血清(BD)，轻轻混合。凝胶被立即倒在放置在水平表面的凝胶托盘上。凝胶被允许固化，并使用凝胶穿孔机制作3毫米的样品孔。凝胶在电泳装置中凝固。参考标准(NIBSC, UK)溶液为100μg/mL多糖，0.1 M Tris缓冲液，pH 8.2。样品的总数分布在8个不同的池中，以适应我们的实验。8μL样品和标准品一式两份直接上样。在9 mA下电泳15小时。用含考马斯亮蓝0.1% (w/v)、甲醇45% (v/v)和冰乙酸10% (v/v)的染色液，用小型轨道摇床轻柔搅拌染色40分钟，在含乙酸7% (v/v)和甲醇10% (v/v)的染色液中染色。

多糖含量计算公式如下:

3.结果

在这项研究中，我们确定脑膜炎球菌多糖血清群A、C、W和Y在脑膜炎球菌PS疫苗中的价值。为了这个目的,和用蓝色右旋糖酐2000和叠氮化钠分别测定。数字1分别为35ml和125ml。考虑用6批Ingovax ACWY的个别洗脱谱进行MSD分析。血清组A、C、W和Y在206nm处出现对称峰(图)3.）.使用自动分数收集器以2ml的体积逐行收集分数，用火箭免疫电泳法测定单个血清群的多糖含量(见补充材料中的S1和S2，可在网上获得http://dx.doi.org/10.1155/2016/9404068）.色谱图显示，6个批次的峰均从35 mL开始(图3(一个)- - - - - -3 (f)）.

洗脱组分的RIE结果显示，在批次15001中，血清组A、C、W和Y的C10、C5、C5和B7分别出现了主峰;D1、C7、C7、C7分别为15002批;15003批次分别为C10、C5、C5、C5;和C5、C5、C5、B10，分别在15005批次。而在15004和15006批次中，所有血清组的主峰分别出现在B7和B11部位。

在15001批次，在C10馏分观察到A群脑膜炎球菌的主要峰值68毫升的．对于血清C组，主要峰值出现在C5 (毫升)。在血清组W和Y中，主要峰值在C5 (mL)及B7 (分别mL)。的A、C、W和Y血清组的值使用Ackers '公式计算[31，32，分别为0.37、0.26、0.26、0.03(图5)4;表格1）.然而，血清A组的主要峰值出现在D1部分(mL)在批次15002。对于血清组C、W和Y，主峰出现在同一组分C7 (毫升)。的血清组C、W和Y的值为0.30，血清组A的值为0.43。批次15001、15002、15003、15005洗脱模式难以区分。但是，15004批次和15006批次略有不同。有趣的是，在15004批次(B7，和15006 (B11，mL)，但洗脱模式不同。的15004批值为0.03,15006批值为0.12。在15001、15003和15005批次中，主峰出现在C5 (C和W血清组，而值为0.26。此外，对于血清A组，主要峰出现在C10 (毫升)15001和15003批次值为0.37。的意思是血清组A、C、W和Y，从6个不同批次的分析，对应，，,,分别。

另外，我们计算了之前洗脱的多糖的总回收率每6批血清组的值为0.5。A、C、W、Y的平均±SD回收率为，，,,分别。A、C、W血清组回收率最低的是第15004批(80.75%、84.42%、80.53%)，Y血清组回收率最低的是第15001批(81.16%)2）.每个批次的每个血清特异性多糖都符合BP的要求[19]．

4.讨论

MSD是工艺一致性的一个关键指标，确认疫苗的免疫原性和安全性[33- - - - - -37]．因此，建立一种可靠的测定脑膜炎球菌PS疫苗MSD的方法至关重要。von Hunolstein和她的合著者[21]报道了串联PL Aquagel-OH 60柱(7.5 × 300 mm)和PL Aquagel-OH守卫柱(50 mm × 7.5 mm)用于脑膜炎球菌PS疫苗MSD分析的SEC实验条件。在这项研究中，我们描述了一种用于脑膜炎球菌PS疫苗MSD分析的稳健SEC方法，该方法使用XK16/70柱，填充sepharose CL-4B。

我们确定了分析了6批Ingovax ACWY疫苗的价值，并分析了批次间的波动。较低的值表明多糖的分子大小越大，说明多糖具有更强的免疫原性[25，38]．在目前的调查中，在批次之间观察到很小的差异。结果表明，该方法准确、重现性好。再一次,对6个批次的单个血清组的值进行比较，15004和15006批次所有血清组的值都是最低的，而15002批次的值是最高的。这可以从一个事实来解释，即确定绝对分子大小分布是困难的，因为多分散范围在5 × 10⁴2 × 10⁵达(26]．因此，有些波动在值可以被认为是无关紧要的。配方和填充不当可能会影响多糖的结构完整性和大小[30.]和水解降低多糖的分子大小，这可能会恶化免疫原性[26，39]．在我们的研究中，多糖储存在−20℃，以减少这种降解的可能性。

根据BP的要求[19),血清A组和血清C组的主峰值不应大于0.70;血清Y组为0.57;脑膜炎球菌PS疫苗W血清组为0.68。在我们的研究中发现，在15002批中，A、C、W、Y血清组的最高值分别为0.43、0.30、0.30、0.30。因此,6批Ingovax ACWY疫苗各血清组的数值符合BP的要求[19]．此外，我们的方法可以用于计算单个脑膜炎球菌血清群多糖的回收率。根据BP的要求[19]，之前应至少洗去血清A组65%多糖，C组75%，W组80%，Y组80%值0.50。在本研究中，我们发现所有研究批次的Ingovax ACWY都符合BP的要求[19]对单个多糖的回收率(表2）.该实验的总体结果表明，Ingovax ACWY具有高度的免疫原性，可以作为一种潜在的脑膜炎球菌PS疫苗用于人类，符合BP [19]和世界卫生组织[26]．

5.结论

SEC可成功用于多糖疫苗的MSD分析，并可提取有关方法重现性和准确性的有意义的信息，以满足监管当局批准人用疫苗的要求。本研究首次报道了SEC对填充sepharose CL-4B的XK16/70柱的测定不同血清组的脑膜炎球菌多糖疫苗的价值，作为表明重复性、准确性和在工业环境中的性能的有效手段。

相互竞争的利益

作者声明，他们没有竞争利益的发表这篇论文。

作者的贡献

Imran Khan、K. M. Taufiqur Rahman和S. M. Saad Us Siraj同样对本文有贡献。

致谢

作者要感谢孟加拉国Khulna大学生物技术和遗传工程教授Morsaline Billah博士提出的建设性建议。

补充材料

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