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何鸿燊晋金, ”离子对试剂的开发和HPLC-UV方法检测和量化的六水溶性维生素在动物饲料中”,国际分析化学杂志》上, 卷。2016年, 文章的ID8357358, 6 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/8357358
离子对试剂的开发和HPLC-UV方法检测和量化的六水溶性维生素在动物饲料中
文摘
小说和简单的方法检测6水溶性维生素在动物饲料中使用高效液相色谱配有光电二极管阵列检测器(HPLC / PDA)和离子对试剂。六水溶性维生素被成功的色谱峰识别通过比较他们的保留时间和紫外光谱与参考标准。流动相是由缓冲CH(5毫米PICB-6 0.1%3羧基)和B(5毫米PICB-6 65%甲醇)。所有使用波长270 nm的峰值检测。方法验证了线性、灵敏度、选择性、准确度和精确度。检测的局限性(钟表)在这些实验中使用的仪器从25到197不等μ克/公斤,量化的限制(定量限)从84年到658年不等μ克/公斤。六水溶性维生素的平均恢复从82.3%到98.9%不等。方法复制导致盘中,interday峰面积的变化小于5.6%。发达的方法是具体的和可靠的,因此适用于水溶性维生素在动物饲料的常规分析。
1。介绍
维生素是必不可少的营养和生理功能,因此,摄入量对于人类和动物是必要的,因为人体不能合成这些增长所需的必需营养素1]。维生素可以分为水溶性和脂溶性维生素;前者包括烟酸、烟酰胺、维生素B6、维生素B2、维生素B1、叶酸、泛酸、维生素C,而后者包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K (2]。维生素有具体和重要的功能,因此,人类和动物都需要维生素来实现和维护健康和生产力3]。维生素功能来控制各种内源性代谢活动发生在身体,诸如能源和氨基酸代谢4]。虽然只需要少量的维生素,维生素缺乏(或实际上,)会导致脚气等疾病(5和皮炎2,6,7]。因此,为了防止维生素缺乏或过剩的动物,以及达到最大性能,饲料添加剂的控制是必要的(8]。实际上,动物维生素对维持正常的代谢过程至关重要,同时也保留他们的身体状况和性能。动物不能合成维生素,这些营养要求必须提供的少量的饲料(9]。
各种方法已报告描述的水溶性维生素,如高效液相色谱法(HPLC)加上紫外线(UV)检测(10,11),液相色谱与质谱(LC)耦合(女士)12),LC加上MS / MS (13),气相色谱法(14]。最常用的方法是基于高效液相色谱法测定维生素组件分离。质和质/女士提供的信息组件的分子质量和结构特性,被认为是比其他方法更有用的分离、鉴定和量化的维生素成分特征。然而,由于这些方法是昂贵的购买和维护,许多实验室喜欢HPLC-UV检测(15),成本较低,操作相对方便,适合常规分析维生素。Ion-paring试剂用于这个研究胺组,所以它适用于水溶性维生素分析以及碘物种形成分析和农药残留分析(16- - - - - -18]。
在这项研究中,六个水溶性维生素在动物饲料(烟酸(烟酸)、烟酰胺、叶酸、维生素b2、维生素B6(维生素B6)和硫胺素(维生素B1))(图1同时)进行了分析。完整的动物饲料有复杂的矩阵含有脂肪、蛋白质、碳水化合物、盐,等等。水溶性维生素我们目标有胺官能团代表极性。水溶性维生素的选择性增加复杂的矩阵,这些不属预定目标的矩阵应该被删除。此外,同时分析方法测定6水溶性维生素已经很少报道。此外,采用AOAC公认的方法或其他国际方法各有维生素的方法。因此,这种新开发的同步方法应该在各种饲料矩阵进行验证。因此报道一种新型分析方法,适用于检测和量化的维生素存在于动物饲料,饲料,同时协助管理标准。
2。实验
2.1。样品
水溶性维生素存在于动物饲料在这项研究目标。动物饲料样本从当地超市购买。总共30动物饲料样品被使用,和20干样品粉碎成细粉(羟甲基糠醛- 100,HANIL电气有限公司,首尔,韩国)。粉碎机是设定在最高时速22000 rpm给细粉规模从400年到1000年不等μ10 m。剩下的液化样本作为收到。所有样品都储存在4°C。
2.2。化学药品和试剂
高效液相色谱级乙腈、甲醇和醋酸从默克(达姆施塔特,德国),购买和PICB-6(图片,paired-ion色谱法;B,单独的基地)购买水域(美国圣米尔福德,MA)。水净化用Milli-Q®里奥斯™/ Elix®水净化系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。烟酸(烟酸)、烟酰胺、吡哆醇(维生素B6),核黄素,硫胺素(维生素B1),和叶酸标准从西格玛奥德里奇购买化学公司(美国宾夕法尼亚州Bellefonte)。所有其他化学物质和溶剂的试剂级或更高。
2.3。标准制剂
六个维生素被分为三组,组1、2和3,和股票的解决方案是使用预处理试剂准备,水,0.01 N氢氧化钠获得最后一个维生素浓度的100 mg / L。组1由硫胺素和吡哆醇,股票的解决方案是由与水混合的标准准备(100毫升)。组2由核黄素和叶酸,由混合标准制剂(10毫克),0.01 N氢氧化钠和水(100毫升)。组3由烟酸和烟酰胺,由混合标准制剂(10毫克)预处理试剂(100毫升)。解决方案被稀释股票的解决方案,准备工作和解决方案都是冷藏。
2.4。样品制备
样本准备提取的离子对试剂。每一个均质样本动物饲料(1.5 g)放入离心管和混合萃取剂(10毫升,5毫米PICB-6 CH 0.1%3羧基)。液化的一部分样本(10克)添加到25毫升容量瓶,体积是由25毫升使用萃取剂(5毫米PICB-6 CH 0.1%3羧基)。我们使用PICB-6作为离子对试剂,因为大多数的维生素时我们决定显示高分辨率使用PICB-6比其他离子对试剂。10分钟的混合物被均质,在室温下用近10分钟,在13000转离心10分钟在4°C。得到的上层清液过滤是0.45μm一次性过滤器(绘画纸)。所有测量进行了一式三份。最后,标准制剂的稳定性是决定在一个星期一个琥珀瓶在室温下,每24小时被采集样本进行分析。
2.5。高效液相色谱分析
高效液相色谱法进行了资生堂Nanospaceψ2系统(资生堂、东京、日本)配备一个二进制溶剂输送泵、autosampler和光电二极管阵列检测器(PDA)和控制使用EZChrome精英软件(美国安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。一个反相一致UK-C18(100×4.6毫米,3μ米颗粒大小)(日本东京)列在一列用于所有分离温度40°C。在使用之前,流动相过滤是0.45μm膜滤器(美国微孔,米尔福德,MA)和真空脱气。流动相是由缓冲CH(5毫米PICB-6 0.1%3羧基)和B(5毫米PICB-6 65%甲醇)与以下梯度洗脱:0分钟,10% B;0分钟,10% B;2-22 min, 70% B;27分钟,70% B;27 - 28日min, 10% B;28-35 min,进样体积是2 b . 10%μL,流量被设定为0.5毫升/分钟。所有使用波长270 nm的峰值检测。
2.6。方法验证
方法验证了根据设定的准则国际协调会议(我2005)[18),国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC, 2002)19]。线性的方法验证,灵敏度、选择性、准确性、精密,概述了在图2和表1。
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保留时间(分钟)。 系数的相关性。 检测极限,产生响应的分析物浓度最低可检测系统的噪声级以上。 限制的量化,分析物的最低水平,可以精确地测量。 决议。 不对称。 相对标准,用%表示。 平均复苏的两个峰值水平(高、低)。 |
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3所示。结果与讨论
3.1。方法验证
发达rp / UV方法将一个离子对试剂验证来验证其性能满足常规维生素的需求分析。几个性能特征测量,包括选择性、线性度、灵敏度、准确度和精确度。
选择性是由没有干涉色谱窗口的情况下,这是用空白的色谱图的具体量化波长(即。270海里)。如图2和表1,水溶性维生素的色谱表明成功的所有六个化合物的分离< 29分钟,具有良好的分辨率(5.55 - -34.85)和不对称(0.94 - -1.08),从而为高效液相色谱系统表示满意的选择性。
线性评估通过建立外部校准曲线为每个复合使用经过工作的解决方案。校准曲线获得的策划分析物的峰面积与它的浓度在七个不同的浓度。每个浓度的混合标准溶液注入一式三份,然后,回归参数计算。结果如表所示1。相关系数()所有化合物均获得研究。这些结果说明外部标准校准可以应用定量的目的。
开发方法的敏感性评价确定LOD和定量限的值。在上述色谱条件下,这些值计算基于响应和每个回归方程的斜率在信噪比()3:1和10:1,分别。为不同的组件,LOD值从25到197不等μg / kg,而定量限的值从84年到658年不等μ克/公斤。详细的数据如表所示1。
那时方法精度取决于测量内部和interday精度。盘中精度,六个复制1 d内混合标准的解决方案进行了分析,而解决方案一式三份检查连续三天盘中的精度。精度是表示为相对标准偏差的百分比(%相对标准偏差)。整个盘中%相对标准偏差值< 5.6%,而interday值< 4.8%(见表1)。
准确性是评价通过添加混合两个不同浓度的标准解决方案(高:20.0毫克/公斤;低:2.0毫克/公斤)饲料协会美国饲料控制官方(AFFCO 201591 -猪矿物质和维生素的补充)。混合使用开发的离子对试剂提取技术和高效液相色谱方法。所有的测试进行了一式三份。优秀回收率-98.9% - 82.3显示高水平的准确性的方法,详细的表1。
所有标准解决方案的稳定性也测试了超过7 d,绝大多数有分解在3 d。特别是在叶酸的情况下,快速分解后观察3 d相比其他水溶性维生素(即。92.12,63.38%的cf。-95.93%)。这些结果表明,有必要准备一个新的标准为每一个分析做准备。具体结果如表所示2。
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基于上面的验证数据,该方法得出的结论是提供良好的线性度,灵敏度、选择性、准确度和精确度的同时分析水溶性维生素。
3.2。应用程序的开发方法
30个不同的动物饲料中分析了在这项研究中,发现了维生素在所有动物饲料从超市购买(表3)。分析了每个样本一式三份。识别的六个化合物相比之下他们的保留时间和紫外光谱与标准和纯化合物。六个化合物的定性和定量成分在动物饲料显著不同。更具体地说,烟酸含量范围从1868到46289毫克/公斤平均含量为15969毫克/公斤,而烟酰胺含量范围从1339到49920毫克/公斤,平均的16257毫克/公斤。此外,叶酸的含量变化之间的102和5012毫克/公斤(平均= 813毫克/公斤),而吡哆醇之间的2065和49530毫克/公斤(平均= 17758毫克/公斤)。最后,核黄素和硫胺素含量范围从3015到36820毫克/公斤(平均= 13286毫克/公斤),从1359年到48930毫克/公斤(平均= 11786毫克/公斤),分别。
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因此,一个简单的、定性和定量方法同时检测和量化的六从动物饲料维生素化合物是成功开发和验证使用rp /紫外检测。此外,使用离子对试剂提取工艺进行优化。显示该方法准确度和精密度,并成功地用于分析不同类型的提要。分析结果表明,高效液相色谱方法为常规分析提供了一个不错的选择,由于它的简单性,特异性和灵敏度。最后,它展示了潜在的应用作为动物饲料的可靠的质量评价方法。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
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