基于DNA的可靠高效鉴定方法的发展烟草在烟草及其衍生产品中

抽象的

需要可靠的方法来发现烟草制品中烟草成分的存在，从而有效地控制走私，并对烟草工业的关税和消费税进行分类，以控制非法烟草贸易。本研究建立了两种敏感、特异的DNA检测方法，一种是实时定量PCR (qPCR)检测，另一种是环介导等温扩增(LAMP)检测。烟草)在各种烟草样品和商品中。两种检测都针对尿苷5 ' -单磷酸合酶(人民运动联盟)，并在不同植物材料上测定了其特异性和敏感性。qPCR和LAMP方法均可快速检测海关样品、重组烟草样品、本地购买卷烟等实际样品中的烟草成分，具有较高的应用潜力。特别是在烟草形态或化学成分被破坏的特殊情况下。因此，将两种方法结合起来，不仅有利于侦查烟草走私管制，而且有利于侦查关税分类和消费税。

1.介绍

烟草(烟草)作为一种重要的商业作物在世界范围内被种植，用于生产香烟、雪茄和其他烟草产品。1］．2014年，全球烟草行业售出约5.6万亿支香烟，市场价值约7440亿美元[2］．由于其巨大的经济重要性，包括走私在内的非法烟草贸易正在增加。3.］．全球每年约有6570亿支香烟被走私，价值约4050万美元[4］．非法烟草贸易是征收烟草消费税和税收的主要障碍，一旦消除，全球政府收入将至少增加310亿美元[5］．

市场上的烟草产品主要有三类:卷烟、雪茄烟和细切烟草(吸烟烟草)。香烟是一卷切得很细的烟草，有薄纸包装。雪茄由卷烟组成，卷烟卷在烟草/再造烟草和烟草外皮。雪茄的外皮也可以用再造的烟草制成，例如，在cigarillo，一种短而窄的雪茄。出于税收和消费税的目的，使用了这些定义，因此，这些烟草产品的分类主要基于外包装的组成。

再造烟草是用捣碎的烟草废物制成的纸浆制成的[6，7］．重组烟草(世界海关组织协调系统)的定义如下:“由烟叶、烟草垃圾或灰尘，不论是否在衬板上(例如烟草茎的纤维素片....)，将细分割的烟草制成。”包装上含有部分非烟草物质的再造烟草的产品也被视为雪茄/小雪茄。因为在许多欧洲国家，香烟和雪茄的消费税差异很大[8]，有必要检测任何与雪茄/雪茄的定义不匹配的任何零售雪茄/雪茄，因此应该作为卷烟销售。因此，需要一种可靠的方法来检测这些烟草制品的外包装中烟草的存在。

烟草鉴定通常基于检测尼古丁的存在，新生肽[6，维生素E [9和微观碎片[10］．虽然这些鉴定方法仍在使用，但在某些情况下(特别是再造烟草)，它们往往不起作用[7］．在实践中，在重组烟草中可能无法检测到微小的烟草碎片，另一方面，欺诈行为可能包括将尼古丁和新植二烯喷洒或浸渍到非烟草成分中。因此，为了成功地检测和鉴别烟草，需要其他方法。在欧盟海关，海关人员使用训练有素的动物，例如狗[11- - - - - -13]和巨大的非洲袋鼠(种老鼠) [13，才能成功地探测到烟草的气味。然而，由于烟草的气味可以很容易地增强或消除，这种方法可能在一定程度上对烟草走私有用，但显然不适用于关税分类和消费税，这需要基于DNA的方法。在之前的一项研究中，基于腐胺n -甲基转移酶(PMT1)基因,PMT1a，用于识别烟草在烟草产品中[7］．然而，因为还有另一个PMT1b烟草基因组中的基因及其序列PMT1b在数据库中不可用[7，因此，引物用于PMT1a可能是非特异性的PMT1a．此外，此外PMT1另外,3PMT（PMT2-PMT4)烟草基因组中存在彼此高度相似的基因[7，它利用PMT1a作为烟草内参基因的可靠性较差。

在本研究中，通过定位烟草尿苷5 ' -单磷酸合酶(人民运动联盟），我们开发了两种基于DNA的方法，一种新的定量实时PCR（QPCR）方法和环介导的等温扩增（灯）方法，以检测各种商品中烟草组分的存在。使用各种可用材料进行特异性和敏感性，包括海关样本，重构的烟草样品，固化的烟草样品，以及本地购买的香烟。我们的研究结果表明，基于的新型QPCR人民运动联盟是否比以前报道的检测下限低1.5倍，特异性更好PMT1a基于QPCR方法[7］．qPCR和LAMP均在此基础上发展起来人民运动联盟为烟草的快速鉴别提供了一种可靠、高效的方法。

2.材料和方法

２.１.植物材料

本研究使用的所有植物材料，包括不同的烟草和非烟草材料和产品，列于表中1．

２.２.基因组DNA的提取和纯化

使用商业化的DNA提取试剂盒DNeasy®Plant Mini试剂盒(Qiagen, Shanghai, China)提取基因组DNA。20 mg冻干的不同植物组织包括新鲜烟叶、未加工烟叶、再生烟叶、烟草茎、卷烟和卷烟白色包装的DNA分离。简单地说，在开始提取DNA之前，样本被收集并用1x PBS缓冲液洗涤。然后，样品在液氮的存在下被研磨。根据DNeasy Plant Mini试剂盒的说明提取DNA。使用NanoDrop 1000紫外/可见分光光度计(NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE, USA)，通过观察OD260/OD280和OD260/OD230和1%琼脂糖凝胶电泳0.5x TBE, GelRed染色，测定和评价提取的基因组DNA样品的质量和数量。所有纯化的DNA样品在−20℃保存至PCR分析。

２.３.DNA寡核苷酸引物和探针

LAMP检测的所有引物均采用Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，由Invitrogen公司(中国上海)合成。LAMP实验中有两个外引物和两个内引物。两种外引物包括一种正向外引物(F3)和一种反向外引物(B3)，两种内引物包括一种正向内引物(FIP)和一种反向内引物(BIP)。FIP由一个F1c(与F1互补)和一个感觉序列F2组成，BIP由一个B1c(与B1互补)和一个感觉序列B2组成[14］．同时，利用Primer Premier 5.0设计DNA寡核苷酸引物和TaqMan®探针，由Invitrogen公司(中国上海)合成。本研究使用的详细引物和探针序列见补充材料表S1http://dx.doi.org/10.1155/2016/4352308.．

２.４.灯试验

对于LAMP检测，每个反应在25℃内进行µL反应混合物含有20 mM三盐酸(pH 8.8)， 10 mM氯化钾，10 mM (NH₄）₂所以₄， 25毫米MgSO₄，0.1％Triton X-100,5米甜菜豆（Sigma，USA），10 µFIP和BIP引物各10µF3和B3引物各为M, dNTP各为2 mM, 2µL纯化的基因组DNA模板。加入DNA模板后，将反应混合物在95℃下孵育5 min，立即冰封冷却，加入8 UBstDNA聚合酶大片段(新英格兰生物实验室)。然后将反应混合物在TaKaRa PCR热循环仪(TaKaRa Bio Inc.， Japan)中64°C孵育60分钟。无模板对照(NTC)用水代替DNA模板，LAMP检测重复三次。扩增的LAMP产品通过1000x SYBR Green I (Generay Biotech Co.， Ltd, Shanghai, China)目测或琼脂糖凝胶电泳(AGE)分析。

2．5．qPCR化验

qPCR检测采用ABI 7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems, USA)， 96孔板。实时PCR反应混合物(25µL)含有以下试剂:12.5µl塔克曼基因表达主混合物（应用生物系统），1.0 µL (0.4µm）每个底漆，0.5 µL (0.2µM)探头，5.0µL (ddH₂啊,和5.0µ基因组DNA的L。Real-time PCR扩增条件为:95℃条件下1个循环，10 min, 95℃条件下15 s, 60℃条件下60 s, 45个循环。在退火步骤，每个PCR周期检测荧光信号。PCR数据采用ABI 7900HT软件SDS 2.4版本进行分析。real-time PCR反应重复3个重复，每3个重复。

3.结果与讨论

３.１.基因组DNA提取

基因组DNA从新鲜的叶子不同监测和烟草样品很容易和快速提取使用DNeasy植物迷你包(试剂盒、上海、中国),根据制造商的指示,并成功获得的DNA直接用于灯和qPCR化验,在协议与以前的研究(7］．然而，使用同一试剂盒从干燥/烘干烟叶、重建烟叶样品、烟草茎和卷烟中分离的基因组DNA纯度不够，无法进行LAMP和qPCR检测。因此，在进行DNA提取之前，需要用1倍PBS缓冲液额外洗涤2-3次样品。我们假设用PBS缓冲液洗涤可以去除污染物，特别是灰尘、抑制/干扰化学物质以及分解DNA或干扰后续DNA分离和纯度的微生物。事实上，采用这种方法分离的DNA样本在LAMP和实时PCR检测中都具有可靠和可重复的结果。

３．２．特异性试验

烟草基因人民运动联盟是一种双功能酶，在包括烟草在内的高等真核生物中催化保守嘧啶生物合成途径的最后两步。在茄科物种中，它出现在基因组中只有一个副本[15］．因此，本研究选择其作为烟草检测标记基因的适用性进行研究。然后使用BLAST(基本局部比对搜索工具)，并使用烟草的一个独特区域设计适合LAMP和qPCR检测的引物集(表S1)。

特异性测定人民运动联盟对1份烟草阳性对照植株进行LAMP和qPCR检测1和表S2)。如图所示1， LAMP只在阳性对照中检测到典型的梯形图案产品，这是通过可视化测试确认的，最终的绿色也出现在阳性对照中(图)1(一)和1 (b)）.qPCR检测结果显示人民运动联盟仅在阳性对照中(图1 (c))，也验证了其特异性人民运动联盟．因此，这两种方法都开发了人民运动联盟基因对烟草具有高度特异性。在该测试中，我们还包括茄子和喇叭花，在同一Solananceae家族中作为烟草。据报道，茄子也会产生尼古丁[16］．检测的失败人民运动联盟在茄子和矮牵牛花中进一步表明，这两种方法对烟草都有特异性，这也与我们的BLAST结果一致。

３．3.敏感性分析

检出限(LOD)是指通过可接受的标准可可靠检测的分析物的最低量或浓度[17］．为了确定开发灯和QPCR测定的床，从新鲜烟叶中分离的基因组DNA，未加工的烟草和将重构的烟草样品连续地稀释至60,30,15,7.5,3.75,1.88,0.94和0.47的最终浓度 ng/µL适用于LAMP和24、12、6、3、1.5、0.75、0.38、0.19、0.095、0.048、0.024和0.012 ng/µL为qPCR，分别用1 × TE缓冲液。2µL和5µ每个稀释的DNA的L分别在灯测定中用作模板和QPCR测定。

如图所示2，当用新鲜烟草DNA进行LAMP检测时，除0.94 ng/外，每一稀释DNA水平的反应均由橙色变为绿色µL(图2(一个)）.琼脂糖凝胶电泳分析证实了这一点(图2 (b)），表明灯检测的绝对床位人民运动联盟基因为1.88 ng (0.94 ng/µl2µ)，这相当于平均395份烟草基因组DNA (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html）.在重组烟草样品(图S1A和1B)和烤烟样品(图S2A和2B)的检测中也获得了相同的灵敏度分析的LAMP结果。在qPCR检测中，通过绘制平均Ct值与已知数量的烟草基因组DNA的曲线生成标准曲线(图)2 (c)）和QPCR的床位人民运动联盟为0.024 ng/µl5µ当使用新鲜烟草样品时，平均相当于烟草基因组DNA的25个拷贝，比报道的LOD要好PMT1a(0.37 ng，相当于平均39份烟草基因组DNA副本)[7］．qPCR的LODs人民运动联盟在重建烟草样品和烤烟样品中分别为0.47 ng和0.24 ng，分别相当于大约100拷贝和50拷贝的烟草基因组DNA(图S1C和S2C)。我们用连续稀释的新分离的DNA重复了这些实验几次，并复制了结果。

我们上述结果表明，虽然加工程度不影响灯法的灵敏度，但它确实显着影响了QPCR方法的灵敏度。据报道，加工烟草样品的DNA产量与未加工的样品有显着差异[7］．另一方面，我们的研究表明，即使使用相同数量的DNA进行PCR反应，加工烟草样品的qPCR LOD也高于未加工烟草样品的qPCR LOD，表明加工过程影响了基因组DNA的完整性，并导致了目标基因的分解或破坏。此外，我们的结果表明，qPCR方法的LOD比LAMP方法低4 ~ 10倍。

3．4．在各种实际样品中的应用

首次利用LAMP和real-time PCR方法在不同烟草品种中检测目标基因的存在(见表S2)。如图所示3.，似乎他的存在人民运动联盟该基因在供试品种中是保守的，且该区域不存在单核苷酸多态性，可能会影响其在供试品种中的检测。因此，这一结果强烈地表明人民运动联盟可作为烟草特异性基因，用于烟草成分的LAMP或qPCR检测。

利用LAMP和实时PCR方法检测各种实际样品中烟草的存在，如阳性对照、阴性对照和其他样品，如非烟草样品、重组烟草样品、烟草茎、卷烟和香烟白色包装(见表)1和表S3)。如图所示4和图S3-S5, LAMP和qPCR方法均能准确检测出阳性对照、烟茎、重组烟和除卷烟白包装纸外的卷烟样品中烟草成分的存在。这些结果表明，无论加工程度如何，这两种方法对烟草成分的检测都是有效和可靠的，表明这两种方法在关税澄清和消费税服务中用于可靠和准确的烟草检测具有很高的潜力。

4.结论

在本研究中，我们建立了两种基于DNA的方法，LAMP和qPCR，来检测烟草成分的存在。前者可用于烟草成分的快速和视觉识别，就像LAMP法通常用于其他基于DNA的检测案件一样[18]，对现场分析特别有用，而后者可用于实验室常规分析中烟草及其产品的准确定性鉴别，其LOD比以前的TaqMan方法低[7］．这两种方法不仅适用于新鲜样品，也适用于任何烟草品种中烟草形态或化学成分发生改变的加工样品。此外，这两种基于烟草特定DNA的方法不同于目前海关使用的基于气味的方法，不仅可以用于走私管制，还可以用于烟草贸易的关税分类和消费税。未来还将对更多的烟草和非烟草植物以及更多的实际样品进行检测，进一步确认这两种方法的特异性和适用性。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Sukumar Biswas和Wei Fan对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

欧盟FP7项目(no . 613908);高校学科引进人才计划(no . 111)， no . B14016。关键词:土力学，有限元，数值模拟，数值模拟

补充材料

参考

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