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周Mengrui杨,王敏,剑Yinqing歌,王Tongtong, ”认证的参考材料的表征和不确定性评估氯霉素在甲醇(GBW 082557 (E))”,国际分析化学杂志》上, 卷。2016年, 文章的ID2348257, 8 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/2348257
认证的参考材料的表征和不确定性评估氯霉素在甲醇(GBW 082557 (E))
文摘
之前准备CRM候选人氯霉素的甲醇浓度为100 mg / L,两个独立的方法包括质量平衡(MB)和定量核磁共振(qNMR)是用来精确测量纯氯霉素材料的质量分数。分配给99.8%的质量分数是0.3%的不确定性。氯霉素的同质性测试和稳定性研究甲醇利用高效液相色谱检测。此外,不确定性来自CRM发展全面评估的过程。实验结果表明这个CRM的属性值是均匀和稳定在4°C至少六个月。新CRM (GBW 082557 (E))可以适用于校准仪器,保证结果的准确性和可比性的常规测量。
1。介绍
经过认证的参考材料(CRM),这被称为一种物质或物质的拥有一个或多个同质和稳定的属性值与不确定性特定的置信水平下,起着非常重要的作用指的计量科学仪器校准、分析方法验证和转移数量和可追溯性(1]。因此,精确和准确的分配属性值应该是一个优先级的CRM的发展。纯有机物质,一系列的测量方法是识别和推荐的局国际des重量等措施(BIPM)。质量平衡(MB)方法是一种间接的纯度测量手段相结合的方法实现几个传统仪器测量包括有机化合物的色谱分析、费歇尔滴定法对水、电感耦合等离子体质谱法和原子吸收光谱对无机离子、重力和热分析(TGA)非易失性无机杂质(2- - - - - -4]。此外,差示扫描量热法(DSC)的基础上熔点抑郁症引起的杂质通常适用于精确的纯度测量,而中可溶性杂质融化状态和主要成分的纯度超过98.5% (5- - - - - -7]。最近,定量核磁共振(qNMR)上升BIPM纯度分析,提出的技术,可以直接由使用理想的内部标准。qNMR方法经常应用在计量领域,可以被视为一个主要方法8]。因此,它变得越来越受欢迎的在纯度测定有机化合物(9- - - - - -12]。然而,内部的选择标准是重要的,纯度测量的关键。首先,选择内标必须是一个CRM以确保测量结果的可追溯性SI单位。其次,它必须溶于普通溶剂和没有干扰峰与目标物质。此外,它是非常重要的,指出信号峰值的主要成分应该是合适的,没有干扰来自有机杂质和内部标准相关的结构。
氯霉素是一个共同的和著名的抗生素药物,已经禁止在牲畜和家禽的育种过程,因为在agroproducts可能导致药物残留通过食物链对人体有毒副作用。因此,一系列的测试标准测定蜂蜜中氯霉素残留,动物产品,和动物饲料。同时,氯霉素crm已被证明是重要的和必要的实现这些测试标准。虽然各种商业CRM与氯霉素可根据相关信息从数据库COMAR(国际认证的参考资料数据库),如纯度CRM氯霉素的尼姆(国家计量研究院、中国)和矩阵有猪肉和氯霉素的蜂蜜从这里好吃的多样性氯霉素CRM不仅浓缩了CRM数据库还提供更多的选择和合适的CRM在实验室日常工作。CRM发展之前,利用的调查氯霉素CRM在测试标准进行。发现校准解决方案通常是单独准备在每一个测试实验室通过溶解纯氯霉素CRM为甲醇或乙腈浓度~ 100 mg / L。减少操作步骤和最小化误差从制备校准解决方案在每一个实验室,一个用户友好的和节省时间的CRM氯霉素的甲醇会欢迎。
氯霉素材料的质量分数,正是由使用qNMR方法决定的。确认测量结果,MB作为另一个独立的方法进行纯度的决心。氯霉素的质量分数是准确的分配,CRM的氯霉素甲醇首次开发严格按照ISO指导34和35和JJF 1006 - 1994(中国技术标准主要参考资料)13- - - - - -15]。此外,建立qNMR细节和MB氯霉素的质量分数赋值方法,制备氯霉素的甲醇,同质性测试和稳定性研究,和不确定性评估足够描述。
2。材料和方法
2.1。材料
所有的高纯度有机溶剂从默克购买。认证的参考资料乙尼泊金(GBW 100064 (E))证书的价值99.7%作为内部标准qNMR测量和氯霉素(GBW 060907 (E))证书的价值99.8%由国家计量研究院(NIM),中国。Methanol-D4从Sigma-Aldrich获得。氯霉素的粉末材料的标记纯度为99.8%购买从东京化工(TCI)有限公司、有限公司、日本。
2.2。装置
高效液相色谱系统(日本岛津公司、日本)配备安捷伦Zorbax XDB-C18(250毫米×4.6毫米,5.0μ米)柱和紫外检测器应用于同质性测试,稳定性研究,测量的主要成分和未知有机杂质。费歇尔滴定法(梅特勒-托利多DL39)是用于测量水的含量氯霉素原材料。非易失性杂质和挥发性有机杂质的分析是进行热重力分析(PerkinElmer Pyris1,美国),气相色谱法加上火焰离子化检测器(GC-FID),分别。一个力量皇冠三世光谱仪在400 MHz冷冻器是用来测量氯霉素的质量分数。所有样品都是重使用梅特勒AL104分析天平与计量检定证书。定性分析进行一个力量顶点70红外光谱学和安捷伦质谱,分别。
2.3。纯度测定氯霉素
2.3.1。质量平衡方法
纯度测定使用质量平衡方法可以用下面的方程描述: 在哪里主要内容由使用高效液相色谱面积归一化法和水的质量分数;是挥发性杂质的质量分数;和非易失性无机杂质的质量分数。
氯霉素主要内容和有机杂质的测定采用高效液相色谱面积归一化法,一个安捷伦Zorbax XDB-C18(250×4.6毫米,5μ米列是使用和紫外探测器设置在280 nm波长。甲醇和水的流动相是由调整以0.2%醋酸的比例40:60。注入体积和柱温箱的温度是10μL和30°C,分别。此外,水的质量分数()、挥发性杂质()和非易失性无机杂质(费歇尔滴定法)测量使用,顶部空间气相色谱FID检测器相结合,分别和万有引力热分析。
2.3.2。定量核磁共振
氯霉素的纯度()衡量qNMR可以由以下公式计算: 在哪里和集成氯霉素和内标峰面积,分别;和分别是旋转的内部标准和氯霉素;和分别是氯霉素的分子量和内部标准;和内部质量标准和氯霉素在确定样本。是纯洁的内部标准。
纯度测量进行力量皇冠三世400 MHz1H qNMR光谱仪配备脉冲场梯度的探针在293.4 K的温度。设置参数如下:3.98秒的脉冲宽度在90°光谱带宽为8223.43赫兹,60年代的延迟时间,转换16的数量。一个示例包括10毫克乙尼泊金CRM作为内部标准和20毫克氯霉素溶解在0.75毫升methanol-D4溶剂,进行了分析。
收购力量乐器是基于命令。NMR收购期间,稳态脉冲应用前放松衰变。十六个虚拟扫描之前获得的数据修正。接收机增益是由仪器自动设置的。每个样本都花了10分钟完成。七个样品在相同条件下测量。通过使用MestReNova软件所有qNMR光谱进行了分析。傅里叶变换衰减信号自动处理。所有光谱的化学位移是残余的引用1H在氘溶剂为3.31 ppm信号的CD3OD。相位校正基线校正和自动应用根据软件的过程指南。集成被设置为一个相同的峰值为每个光谱范围。
2.4。CRM的准备
根据确定纯度,CRM溶解在甲醇制备氯霉素的精确加权100毫克氯霉素为1000毫升甲醇在严格控制温度和湿度。足够的混合和解散后,CRM的氯霉素在甲醇与1.0毫升/每个安瓿瓶。一批CRM候选人包括约1000辆是生产和储存在4°C条件。
2.5。均匀性和稳定性测试
均匀性和稳定性测试是通过使用HPLC-UV方法进行。25瓶被随机选中的批处理和检查测试between-bottle甲醇中氯霉素的同质性。每个瓶子都以一式三份测试within-bottle同质性。均匀性测试结果统计分析了单向方差分析(方差分析)。
短期和长期稳定性测试是评估在八天,6个月,分别。短期稳定,CRM瓶被暴露在20°C和40°C预定2天,4,6,8;对于长期稳定,CRM瓶储存在4°C条件分析了1日3日,6个月。一个新的氯霉素校准解决方案是刚做好的稳定性测试。在每一个时间,一个校准溶液和两瓶由HPLC-UV方法分析了CRM。稳定性测试的数据进行回归分析。
3所示。结果与讨论
3.1。纯度测定
定量核磁共振(qNMR)作为表征方法纯度测量最近被BIPM推荐。获得纯度精密,准确的结果,测量过程中应注意的几个原则规则。测量条件包括相位校正、基线校正、脉冲间隔和光谱窗口系统的优化。首先,经过认证的参考材料作为内部标准是必要的实现可追溯性测试结果SI单位。第二,选择的内部标准和目标分析物应同时溶于同一和共同氘标记溶剂。第三,指出信号峰值量化必须为对方没有干扰。乙尼泊金CRM通常被认为是一种理想的内部标准纯度测量在很多研究;因此,乙尼泊金被选在这个研究。与光谱相比只有乙尼泊金在图1(一)H峰归因于内部标准和分析物可以轻易的识别出图1 (b)显示的核磁共振谱methanol-D乙基尼泊金和氯霉素的混合物4。如表所示1峰的三双不同的化学变化与氯霉素没有重叠为定量分析选择;然而,不同纯度从98.94%到99.82%不等结果根据方程获得的部分2.3。2。评判结果更准确、可靠,核磁共振光谱的基线是放大如图2。发现只有两座山峰在一对在相同级别的基准周期1,周期2所示。然而,有更多的小山峰周期1,3,4,从结构被认为是相关的有机杂质仅通过比较光谱的内部标准。由于不可避免的杂质干扰,一个商业氯霉素CRM是用于检查杂质和评估其影响赋值。虽然类似的结构相关的有机杂质也观察到,贡献的峰值整合qNMR可以忽略。在这种情况下,它是假定相同的基础上,选择定量峰基线水平可能更本研究的关键。因此,纯度99.82%的被认为是最接近真实价值在三个结果。
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| ””意味着不同的数据集在相同条件下测量。 |
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(一)乙基尼泊金
(b)乙基尼泊金+氯霉素
为进一步确认,质量平衡(MB)方法进行纯度的测量。与qNMR相反,MB是间接纯度测量方法,是通过精确测量的杂质包括有机杂质,水分,挥发性和非挥发性的杂质。有机杂质的分析通常是通过使用色谱法测量。在这个研究中,HPLC-UV氯霉素的有机杂质进行分析。为了识别和度量杂质充分和全面,甲醇(空白)和氯霉素在甲醇浓度为100 mg / L和2000 mg / L测定的紫外吸光度280海里。与甲醇空白相比,氯霉素和杂质峰的观察和分离在图3。总共有七个杂质峰检测到的浓度2000 mg / L,而两座山峰(杂质4和杂质7)明显观察到浓度为100 mg / L如图3(b)和3(c)。它应该强调,纯洁的浓度测量通过使用高效液相色谱面积归一化法必须准备尽可能高杂质充分保证信号响应。因此,纯度由HPLC-UV 99.84%和0.02%的标准偏差表所示2。测量水的费歇尔使用电量滴定仪。水质量分数的确定和计算了0.025%与0.003%的标准差如表所示2。在这项研究中,非易失性无机杂质测量通过加热样品从35°C到600°C 10°C /分钟。逐渐蒸发过程获得的曲线和样品的重量没有改变通过加热到600°C。挥发性有机杂质被GC-FID决定。覆进行气相色谱FID检测器相结合柱db - 624 (30 m×0.32毫米,1.8μ米)来确定挥发性杂质与十二种传统溶剂包括甲醇和乙腈。参数设置如下:氢、40毫升/分钟,空气,400毫升/分钟,传输线温度、100°C,和注射体积,50μl .初始温度是45°C和5分钟。温度增加到120°C在7°C /分钟和230°C举行15°C /分钟和8分钟。发现几个峰强度小于3倍信噪比(LOD)被发现。因此,非易失性无机的质量分数和挥发性有机杂质可以忽略。
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3.2。均匀性测试
均匀性测试,25安瓿瓶样本选择从该批crm随机和确定为每个使用一式三份HPLC-UV优化方法在上面提到的部分。信号峰的面积被HPLC-UV记录面积归一化法,如表所示3。根据参考资料的一般特征和统计原则JJF 1343 - 20012年的数据分析了单向方差分析(方差分析)和结果见表4。这是发现计算值低于临界值。它已经表明,甲醇的氯霉素的同质性是同质的最小采样下10μl
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3.3。稳定性研究
3.3.1。短期稳定性研究
在交付评估温度变化的影响,部分样本预存储在20°C和40°C模拟装运条件。两个安瓿瓶样本存储在每个温度为2,4,6,8天。表示存储期后,样品刚做好的氯霉素,甲醇作为校准解决方案使用HPLC-UV方法测定一式三份。稳定在20°C和40°C数据绘制与时间,分别和回归计算(见表5)。观察到的边坡测试的意义使用吗t以及,斜率的不确定性重要的95%的置信水平和价值自由度。如表所示3,没有发现意义斜率储存温度20°C (),而斜率是非常重要的储存温度40°C ()。这导致了一个结论,如果货物温度不高于20°C,短期稳定性的不确定性在40°C可以被认为是可以忽略的。
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3.3.2。长期稳定性研究
满足需求的crm,氯霉素的甲醇,储存在4°C,测量在1日、3日和6个月。长期稳定的氯霉素在甲醇检查通过使用相同的分析方法和统计分析方法中描述的短期稳定性研究。如表所示6边坡被发现,没有意义。这表明氯霉素在甲醇是稳定在4°C至少6个月。
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3.4。评估的不确定性
严格按照参考资料的一般特征和统计原则JJF 1343 - 2012 (16),甲醇CRM中氯霉素的不确定性的来源可以分为三个主要部分(见图4):不确定性从同质性测试,从长期和短期稳定的不确定性和和不确定性特征。与此同时,是由下列事项:平衡精度,容量瓶的体积变化,和纯洁的氯霉素材料纯度的不确定度是通过结合评估的不确定性来自纯度测定过程由两个独立的质量平衡方法和qNMR橙色虚线所示矩形图吗4。
MB的方法,标准的不确定性可以由以下公式计算: 在这可以通过使用以下公式计算: 在哪里不确定性来自HPLC-UV测量的标准偏差;从不同的紫外线响应不确定性因素的杂质,可以估计以下方程: 在哪里杂质的最大百分比吗在特定的波长;杂质的百分比吗在特征波长;不确定性的杂质。在这项研究中,选择波长为210 nm、235 nm、254 nm、280 nm和300 nm。
此外,水分测量的不确定度可以扩展通过使用测量的均值,分别。在这种情况下,属性值是更加可靠和合理的技术限制。此外,不确定性的和可以忽略。
qNMR,标准的不确定性可以由以下公式计算: 在哪里被测量的相对标准偏差表示;和从平衡重量;获得的证书乙尼泊金CRM (GBW 100064 (E));和的计算是通过以下方程: 在哪里是原子的数量元素;不确定性的相对原子质量的从IUPAC表元素的引用元素的原子的重量。
因此,纯度测量的不确定度评估如下:
正如我们上面提到的,氯霉素溶解在甲醇制备氯霉素为甲醇。因此,浓度的CRM解决方案可以由以下公式计算: 在哪里是氯霉素在甲醇的浓度(毫克/升);是数量的氯霉素(毫克);氯霉素的纯度;是体积的甲醇(mL)。可以表达的相对不确定性描述以下方程:
根据以上分析的不确定性,不确定性评估结果总结表7。
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3.5。值验证
为了检查的可靠性和精度的分配价值氯霉素在本开发项目,甲醇CRM中现有的认证参考材料的氯霉素(GBW 060907 (E))被选为校准器氯霉素的属性值测量甲醇CRM。氯霉素的校准溶液浓度为100.9 mg / L,近似的分配值()mg / L,正是由验证平衡和容量瓶。氯霉素的CRM开发甲醇作为未知样本测量一式三份。如表所示8,测量值的均值为99.7 mg / L标准偏差为0.2 mg / L。发现测量值是由指定的准确值。因此,它可以被批准的指定值氯霉素在甲醇是可靠和准确的。
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4所示。结论
氯霉素的用户友好的和节省时间的CRM甲醇(GBW 082557 (E))是成功开发和批准质量监督、检验、检疫。在这项研究中,qNMR和质量平衡方法被用于氯霉素纯洁的精确测量。的同质性、稳定性和不确定性的CRM足够研究根据技术规范。此外,选择qNMR频谱纯度测量质子峰值的比较研究。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者承认金融支持中国农业部(专项基金用于研究热点之一GJFP201501503)和创新研讨会中国农业科学院的项目。
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