新HPLC-ELSD方法同时测定N-Acetylglucosamine和N-Acetylgalactosamine乳制品

文摘

快速高效液相色谱测定方法与蒸发光散射检测(HPLC-ELSD),使用碳水化合物列,开发的同时测定N-acetylglucosamine (GlcNAc)和N-acetylgalactosamine (GalNAc)乳制品。样品制备是由使用乙腈沉淀。检测的极限是2.097 mg / L为GalNAc GlcNAc和3.247 mg / L。量化的极限是6.043 mg / L为GalNAc GlcNAc和9.125 mg / L。精度范围从105.7%至96.4为GalNAc GlcNAc和从97.1到104.1%。方法的精密度< 1.7%为GalNAc GlcNAc和< 2.2%。意味着复苏的方法测量了样品飙升12.5 30.0 -120.0 mg / L GlcNAc或-50.0 mg / L GalNAc和被发现为GalNAc GlcNAc 95.1 - -105.5%和99.5 - -105.9%。标准解决方案的稳定性测试结果储存在4日,20和40°C GalNAc GlcNAc分别为96.2 -104.7%和98.0 -106.5%。本研究确定GlcNAc使用HPLC-ELSD方法和GalNAc乳制品。这种快速,同时定量方法可能是有用的作为一个意味着乳制品的质量控制方便。

1。介绍

N-Acetylgalactosamine (GalNAc)被认为是最有效的抑制剂trypsin-treated兔红细胞的凝集,比半乳糖或被抑制的6倍α与半乳糖di -或三糖(蜜二糖或蜜三糖)(1]。N-Acetylglucosamine (GlcNAc)已被证明能提高灵活性以及软骨和加强皮肤保湿的条件(2- - - - - -5]。鲁宾的研究,进行了10人问题的灵活性和后每天摄入1.5 g poly-GlcNAc 6周,6种个人证明增加血药浓度和提高灵活性6]。

GlcNAc和GalNAc牛奶中碳水化合物的7,8]。免费GlcNAc被发现在浓度从1.1到11毫克/ 100毫升,(8,9)和GalNAc已经发现水平从2.5到3.0毫克/ 100毫升(7]。牛奶中含有少量的GlcNAc GalNAc。出于这个原因,开发一个精确的检测方法极其少量的GlcNAc和GalNAc乳制品已经成为至关重要的。Recio Belloque报道,GlcNAc的内容和GalNAc增加存储期间的商业UHT牛奶在室温下(7,10]。

GalNAc(图1(一)(2)- Acetylamino 2-deoxy-d-galactose C₈H₁₅没有₆GalNAc)是一种氨基糖半乳糖的导数。GlcNAc(图1 (b)(2)- Acetylamino 2-deoxy-d-glucose C₈H₁₅没有₆GlcNAc)单糖葡萄糖的导数。这是一个酰胺葡萄糖胺和乙酸之间的化学结构。分子的质量都是一样的,这些结构是密切相关的色谱分离困难。一些技术方法被用来测量内容GalNAc和GlcNAc包括气相色谱法(GC) (7]。的主要缺点包括样品衍生化GC方法。衍生化限制在他们的应用程序示例分析,检测波长短,检测灵敏度低,稳定性差,降低了再现性。因此,对于GlcNAc和GalNAc其他技术方法的测定要求。单糖的分析和更复杂的碳水化合物通常是由液相色谱(LC)技术,使用amino-bonded硅列(11]。高效阴离子交换色谱法与脉冲电流检测(HPAEC-PAD)也为分析开发的碳水化合物(12,13]。有许多其他的方法分离的mono和二糖,如伴刀豆球蛋白亲和色谱法(14),气相色谱质谱(GC / MS) [15,16与吸光度[],毛细管区带电泳17]。

(一)

(b)

这些先前的方法不同时分析确定GlcNAc和GalNAc。分析果糖,鼠李糖、阿拉伯糖、galactinol、半乳糖等单糖的一部分,更复杂的碳水化合物。大多数碳水化合物的分析研究是由复杂的衍生化过程(13,17]。此外在索里亚时的蒸发过程进行研究需要长时间在样品制备15]。为了避免样品衍生化,一个通用模式的检测可用于蒸发光散射检测(ELSD)。

近年来,高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC -)已经开发了更好的定量mono -寡糖在乳制品(18]。此外,蒸发光散射检测器已广泛用于检测非易失性化合物,如碳水化合物,并提供良好的定量结果(11,19,20.]。此外HPLC-ELSD系统已经显示出优势的敏感性和电力的分辨率分析复杂混合物的微小的碳水化合物(20.- - - - - -22]。

本研究的目的是开发一个没有衍生化过程的同步分析乳制品。发达的方法可能是使用作为一个有价值的工具,用于乳制品的质量控制分析GlcNAc GalNAc。

2。实验

2.1。试剂、溶剂和标准

分析试剂级甲醇甲醇和乙腈(ACN)得到费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。水是购自j·t·贝克(美国新泽西州Phillipsburg)。GlcNAc(99%)和GalNAc(99%)标准,硫酸锌七水硫酸锌(99%),和三水合亚铁氰化钾(98.5 ~ 102.0%)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。样品制备

样本(婴儿配方奶粉、酸奶、UHT牛奶和鲜奶)立即冷冻和储存在−70°C。婴儿配方奶粉、酸奶、和UHT牛奶(南阳乳制品、Gongju、韩国)在当地的杂货店买大田市(韩国)。原料奶样本来自西南牛牧场在韩国Gongju城市。大约1 g的婴儿配方奶粉是加权,然后用10毫升水稀释。示例prewarmed在40°C水浴,由均质机均质(美国GA Omnimacro,型号17505)5分钟,每分钟3000转,结合10毫升ACN。解决方案是在室温下用近10分钟,然后在13000转离心10分钟在4°C (Kendro, Hanau,德国)。1毫升的上层清液被集中和N₂然后用1毫升的流动相溶解和注入色谱系统。大约2 g的酸奶样品是加权,然后用2毫升水稀释。解决方案是使用上面描述的方法治疗,婴儿配方奶粉,然后6毫升ACN是补充道。原料奶和UHT牛奶也用同样的方法治疗,但原料奶和UHT牛奶没有用水稀释。根据总固体乳制品的内容,有几个样品过程上的差异。粗脂肪和蛋白质沉淀使用Carrez解决方案我(2.7 g的亚铁氰化钾三水(II)在100毫升水)和二(5.5 g的硫酸锌七水硫酸锌100毫升水)和15分钟的样本在13000 rpm离心机在4°C,从而消除脂肪13]。粗脂肪和蛋白质含量测定的方法官方分析化学家协会(23]。

2.3。色谱条件

高效液相色谱法(美国安捷伦1100,帕洛阿尔托,CA)配备蒸发光散射检测器(美国鹿田Alltech 2000年,IL)被用来分离和检测GlcNAc和GalNAc。一列,盛行碳水化合物ES(250毫米×4.6毫米,5µ米列(美国戴维森发现科学,迪尔菲尔德,IL)被用来分离GlcNAc和GalNAc 30°C柱温箱。ACN的流动相组成、水和甲醇(60:20:20,v / v),泵的流量0.5 mL / min。权力平等主义的模式在运行30分钟。注射体积是10µl .蒸发光散射检测器条件如下:管温度为85°C和氮气流为2.0毫升/分钟。

2.4。方法验证

验证了根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC) 2002指导原则和协调国际会议(我)2005 (24,25]。

2.4.1。校准标准和Matrix-Matched校准标准

每个化合物的股票标准溶液制备:准确称取GlcNAc和GalNAc(20毫克和16毫克,职责。)放入100毫升容量瓶和长大卷ACN的混合物:水:甲醇(60:20:20,v / v)。GlcNAc的最终浓度为200µg / mL和GalNAc的最终浓度为160µ克/毫升。这些解决方案被储存在4°C。GlcNAc和GalNAc标准解决方案准备日常工作范围从25到200µg / mL和10 - 160µg / L,分别在流动相稀释。

Matrix-matched标准的解决方案准备使用原料奶,UHT牛奶,酸奶,和婴儿配方奶粉。10 - 200的范围µg标准GlcNAc和GalNAc加权,然后将其加入100毫升容量瓶包含测试材料。的最终浓度GlcNAc和GalNAc 200µ克/毫升和160年µ分别g / mL。矩阵股票的标准解决方案包含空白试验材料25 - 200的浓度范围µGlcNAc和10 - 160 g / mLµGalNAc g / mL。

使用校准曲线在确定精度、准确性、复苏和动态范围。标准曲线是由十个点。我们使用第三个多项式方程的形式定义曲线和使用校准曲线来评价每个组件的浓度。

2.4.2。选择性

评估方法的选择性,矩阵的样本原料奶,UHT牛奶,酸奶,和婴儿配方奶粉是根据方法(准备部分2。3上面描述的),然后使用HPLC-ELSD系统进行了分析。选择性研究通过比较获得的结果为标准溶液GlcNAc GalNAc相同的标准溶液飙升和四个不同的乳制品。我们试图使用蒸发光散射检测器来识别山峰从GlcNAc GalNAc四乳制品使用HPLC-ELSD系统分开。

2.4.3。精密度和准确度

精确确定interday所进行的研究和盘中再现性最高的地区。盘中进行测试使用四个决定在浓度水平对应于25 - 150µg / mL和10 - 100µ克/毫升GlcNAc GalNAc。精度是基于计算结果的相对标准偏差(RSD)为GlcNAc和GalNAc在每个浓度。Within-laboratory精密研究进行了一个实验室,与三个不同的运营商执行分析四种不同的天使用四个不同的奶制品矩阵食品。Within-laboratory精度评估使用单向方差分析(方差分析)以及使用SPSS 12.0版。方法的准确性是决定基于GlcNAc的回收率和GalNAc数量(10 - 150µg / mL)添加到样本。

2.4.4。检测极限(LOD)和量化的限制(定量限)

检测极限(LOD)被定义为中被测物能被定量测定的最低浓度,可以积极识别与背景。量化的极限(定量限)的最低浓度的分析物,可以准确地测量方法的操作条件下可接受的精度。LOD被定义为当浓度信号噪声比(信噪比)是3。定量限是分析物浓度的S / N比率等于10。

2.4.5。复苏

恢复测试是由强化婴儿配方奶粉、酸奶、UHT奶,鲜奶。的浓度GlcNAc 30、60和120µg / mL, GalNAc的浓度是12.5,25岁和50岁µ克/毫升。复苏决定通过比较观察到的峰面积的五个复制乳制品在每个浓度上升与预期值在这些浓度决定从标准的校准曲线。

2.4.6。稳定

确定稳定的标准解决方案样本存储在4日,20和40°C了10天。GlcNAc个股的解决方案和GalNAc准备在流动相的浓度25日GlcNAc 150 mg / L和100 mg / L GalNAc稀释了相同的溶剂组成。为了获得稳定的样品,婴儿配方奶粉、酸奶、UHT牛奶,和原料奶也储存在4日20和40°C了10天。样品进行了一式三份三温度水平来确定稳定。标准溶液和样品储存在4°C被保存在一个冰箱,和样品存储在20和40°C被存储在一个微生物孵化器(Tuttlingen,粘合剂GmbH,德国)。

3所示。结果和讨论

3.1。样品处理

GlcNAc和GalNAc从奶制品中提取,使用ACN或Carrez解决方案。最高分辨率被ACN通过使用提取。粗脂肪含量为2.0毫克/ 100毫升使用Carrez解决方案和12.7毫克/ 100毫升使用ACN的解决方案。粗蛋白含量为9.1毫克/ 100毫升使用Carrez解决方案和24.5毫克/ 100毫升使用ACN的解决方案。ACN提取解决方案是降低粗脂肪和蛋白质在乳制品(婴儿配方奶粉、酸奶、UHT牛奶,和原料奶)。的粗脂肪和蛋白质,Carrez方法显示,粗脂肪含量最低。然而,当通过Carrez样本提取方法,发现GalNAc仍分不开的,GlcNAc很低的灵敏度。与ACN提取的情况下,消除粗脂肪和粗蛋白的比例低于Carrez方法但山峰ACN的最明显的解决方法和显示GlcNAc和GalNAc高产的结果。在提取步骤获得的收益率Carrez解决方案和ACN 67.2 ~ 75.3%和95.1 ~ 105.9%,分别。此外,ACN方法很容易利用样品处理和精确的分析是可能的。 Therefore, ACN was selected as the extraction solvent.

3.2。方法验证

3.2.1之上。校准标准和Matrix-Matched校准标准

校准曲线GlcNAc GalNAc是评估使用十点校准四乳制品(婴儿配方奶粉、酸奶、UHT牛奶和鲜奶)。决定系数(为每个标准曲线)> 0.999。校准曲线通过使用移动阶段解决方案覆盖25 - 200 mg / L的浓度范围为GlcNAc GalNAc 10 - 160 mg / L。蒸发光散射检测器的响应函数是非线性(26]。蒸发光散射检测器的响应是最好的描述了三分之一多项式方程。第三次多项式方程的相关系数> 0.999。表1是显示了回归方程的参数GlcNAc GalNAc。整除的10µ每个标准溶液用于L HPLC-ELSD分析。标准溶液注射为每个浓度水平进行了一式三份。优秀第三多项式相关观察分析物的峰面积和浓度范围测试。这个方程是用来确定two-compound乳制品中的内容。


复合						范围(g / mL)

GlcNAc	−7.353e⁻⁴	4.489e⁻¹	12.327	79.609	0.9999	25 - 200
GalNAc	−1.922e⁻³	6.089e⁻¹	−4.936	252.349	0.9997	10 - 160

对于每个曲线方程,在那里峰面积和吗分析物的浓度(g / mL)。
是第三度常数。
是第二学位常数。
是第一个学位常数。
是拦截。
相关系数=。

表2比较结果对四个测试材料强化和三个不同层次的GlcNAc GalNAc确定使用矩阵得到的检定或校准标准溶解在流动相的解决方案。给出了详细的数据表2。在大多数情况下,获得的结果使用校准解决方案准备在同一溶剂作为流动相更类似于真实值比计算使用校准准备从matrix-matched标准。


矩阵	足球俱乐部	恢复(%)
		GlcNAc		GalNAc
		年代	米	年代	米

原料奶	25	101年	One hundred.	98年	101年
	50	101年	97年	97年	One hundred.
	One hundred.	102年	One hundred.	99年	102年

UHT牛奶	25	98年	One hundred.	One hundred.	One hundred.
	50	99年	102年	101年	101年
	One hundred.	102年	101年	99年	One hundred.

酸奶	25	103年	103年	98年	97年
	50	99年	99年	99年	98年
	One hundred.	99年	101年	One hundred.	99年

婴儿配方奶粉	25	99年	One hundred.	One hundred.	One hundred.
	50	103年	102年	101年	103年
	One hundred.	102年	102年	102年	102年

S =标准溶液标定。
M = matrix-matched校准。
FC =强化浓度(毫克/毫升)。

3.2.2。选择性

GlcNAc的混合物和GalNAc成功分离的最佳色谱条件(部分2。3)。图2显示了典型的色谱四乳制品的婴幼儿配方奶粉,酸奶,原料奶,UHT牛奶(数字2(一个)- - - - - -2 (d)、职责),获得与HPLC-ELSD系统优化HPLC-ELSD条件下碳水化合物列。ACN:水:甲醇比例为60:20:20 (v / v),流速为0.5毫升/分钟,列温度是30°C。不少于五个复制样本检查每个乳制品。色谱GlcNAc和GalNAc显示没有矩阵的干扰从原料奶,UHT牛奶,酸奶,或婴儿配方奶粉。稳定的保留时间和最佳分辨率是通过使用一个移动阶段由雨、水、和比例的甲醇60:20:20 (v / v)。这些结果识别的山峰从GlcNAc GalNAc HPLC-ELSD系统上显示令人满意的选择。

(一)

(b)

(c)

(d)

3.2.3。精密度和准确度

色谱系统的精度测试通过执行五个独立的内部和interday复制测量标准的解决方案包含GlcNAc GalNAc然后检查RSD的峰值区域。每天五个独立的复制进行连续五天。表3显示,盘中、interday RSD值峰值区域。盘中RSD值精度GlcNAc和GalNAc < 2.2%。盘中精度为96.4 -105.7%。Interday值,在大多数情况下,不到1.8%,独立的浓度水平。interday精度为99.3 -103.7%。在5%的显著性水平,单向方差分析测试表明,三大运营商之间没有明显差异。因此,可以得出结论,方法类似不管操作员或分析。详细数据表所示4。低内部interday RSD为和精度值表明健壮的验证方法。


复合	足球俱乐部	盘中			Interday
复合	足球俱乐部	MAC	标准偏差	交流	MAC	标准偏差	交流

GlcNAc	25	24.11	1.2	96.4	25.10	1.7	100.4
	75年	75.10	0.4	100.1	74.49	1.6	99.3
	120年	121.78	0.7	101.5	121.68	1.0	101.4
	150年	158.48	0.3	105.7	153.17	1.3	102.1

GalNAc	10	10.31	2。2	103.1	10.37	1.7	103.7
	25	24.55	2。0	98.2	24.91	1.8	99.6
	50	48.54	1.7	97.1	50.13	1.6	100.3
	One hundred.	104.07	0.7	104.1	101.95	1.1	101.9

FC =强化浓度(毫克/毫升)。
MAC =平均绝对浓度(毫克/毫升)。
RSD =相对标准偏差(%)。
AC = GlcNAc精度和GalNAc (%)。


恢复(%)
操作符	原料奶		UHT牛奶		酸奶		婴儿配方奶粉
操作符	复苏	标准偏差	复苏	标准偏差	复苏	标准偏差	复苏	标准偏差

GlcNAc
一个	101.7	0.5	101.7	0.7	102.1	0.8	97.7	1.1
B	101.8	1.0	101.6	0.1	98.6	1.2	100.9	0.5
C	102.4	0.6	103.8	0.5	100.0	1.0	102.0	1.0

GalNAc
一个	102.5	12	98.5	0.2	101.6	1.2	101.8	2。3
B	101.8	0.1	101.2	0.7	101.0	0.5	100.0	0.5
C	98.4	1.3	99.4	1.3	101.2	0.4	101.3	0.5

GlcNAc的测定分析三个不同的运营商使用四个不同矩阵样本在不同天。
GalNAc的测定分析三个不同的运营商使用四个不同矩阵样本在不同天。
相对标准偏差(%)。

3.2.4。检测极限(LOD)和量化的限制(定量限)

LOD和定量限当前色谱条件下测定的基础上,响应和每个回归方程的斜率在信号噪声比(S / N) 3和10个,分别。矩阵飙升方法用于LOD和定量限的计算。LOD和定量限从2.097到6.043不等µg GlcNAc和从3.247到9.125µ分别g GalNAc。

3.2.5。复苏

回收率接近100%在几乎所有的情况下。满意的复苏方法精度从95.12%到105.88%不等,分别。考虑回收试验的结果,该方法可以被认为是准确的。详细数据表所示5。


矩阵	GlcNAc				GalNAc
矩阵	电子商务	足球俱乐部	恢复(%)	标准偏差	电子商务	足球俱乐部	恢复(%)	标准偏差

原料奶	152.3±3.4	30.0	102.06	1.94	189.3±12.1	12.5	100.50	2.46
		60.0	101.41	1.18		25.0	99.92	1.37
		120.0	95.12	0.59		50.0	103.30	2.08

UHT牛奶	150.2±5.4	30.0	102.39	3.21	115.0±1.1	12.5	103.34	1.81
		60.0	97.02	0.42		25.0	105.88	0.84
		120.0	101.06	2.99		50.0	102.70	0.57

酸奶	151.2±11.1	30.0	101.20	0.66	157.0±5.5	12.5	99.39	0.91
		60.0	100.20	0.79		25.0	100.58	0.92
		120.0	100.81	1.03		50.0	99.79	0.62

婴儿配方奶粉	720.0±1.6	30.0	105.45	0.68	1118.4±12.3	12.5	100.56	1.38
		60.0	103.95	2.90		25.0	102.17	0.81
		120.0	103.26	1.25		50.0	99.51	1.10

电子商务=内生浓度(毫克/ L,毫克/公斤)。
FC =强化浓度(毫克/毫升)。
相对标准偏差RSD =。

内源性GlcNAc浓度和GalNAc乳制品是由构造一个五点校准曲线使用HPLC-ELSD条件相同的那些用于测试材料。分析物浓度计算根据以下: 在哪里分析物的浓度决定于标准的校准曲线,是提取解决方案的总体积,是样品的重量。

GlcNAc和GalNAc乳制品的内容如表所示5。在分析过程中,原料奶样本被发现含有152.3 mg / L GalNAc GlcNAc和189.3 mg / L。我们发现一个更大的比报道的GalNAc j . Belloque纸,但GlcNAc内容相似7]。

3.2.6。稳定

标准溶液的稳定性测试在4日20和40°C了10天。标准溶液的稳定性与精度是令人满意的范围从96.20到106.50%。我们得出这样的结论:标准的解决方案是稳定的,至少在三种不同温度下10天。详细数据表所示6。我们测试样品包含原料奶,UHT牛奶,酸奶,和婴儿配方奶粉4,20和40°C了10天。根据Belloque et al。7随着时间的推移,N-acetylglucosamine数量的增加。然而,储存稳定性的实验结果在10天内确定并表示(表一样安全6)。


复合	圣	足球俱乐部	稳定性(,意思是)(°C)
			第一天		第二天		第三天		第七天		第十天
			作为	标准偏差	作为	标准偏差	作为	标准偏差	作为	标准偏差	作为	标准偏差

GlcNAc	4	25	100.16	0.04	98.32	0.28	102.16	0.77	104.72	0.52	104.20	1.54
	4	150年	99.72	1.04	101.84	0.27	101.59	1.25	100.33	0.28	102.00	0.80
	20.	25	98.32	3.32	98.76	3.60	99.64	2.92	102.64	1.85	96.20	3.99
	20.	150年	99.72	1.11	99.69	0.83	101.79	0.79	101.49	1.29	102.21	0.75
	40	25	102.36	3.27	103.44	2.65	101.72	3.73	104.56	0.66	104.16	1.74
	40	150年	101.99	1.12	102.88	0.46	102.30	0.15	101.84	0.43	97.99	1.34

GalNAc	4	10	103.50	1.81	102.50	1.23	103.70	2.79	105.70	0.20	103.10	4.64
	4	One hundred.	98.58	1.11	98.54	0.42	105.04	0.38	104.86	0.53	101.25	0.49
	20.	10	98.00	1.75	103.40	3.95	105.08	3.54	102.50	1.27	105.70	3.63
	20.	One hundred.	102.36	1.05	103.53	1.08	103.05	0.78	104.24	1.14	98.68	0.37
	40	10	99.00	1.08	106.50	3.83	102.10	4.98	100.90	3.84	98.40	4.37
	40	One hundred.	101.58	0.21	100.77	2.16	101.66	3.34	100.24	2.96	100.46	0.17

圣=储存温度(°C)。
FC =强化浓度(毫克/升)。
作为GlcNAc =稳定性试验的准确性和GalNAc (%)。
RSD =相对标准偏差(%)。

4所示。结论

在本文中,我们报告一个简单、快速、敏感HPLC-ELSD方法同时量化GlcNAc GalNAc乳制品。使用的开发方法可以作为一种有价值的工具在常规分析GlcNAc GalNAc乳制品,同时确定的能力水平的这些组件在乳制品将在研究中发挥重要作用。

验证实验使用化验标准执行解决方案,样品,和飙升的样本评估数据的质量,确保方法的可靠性。方法线性、准确度、精度、稳定性和选择性进行了评估,是检测和量化的限制。同时这里描述的方法提供了一个方便乳制品的质量控制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

引用

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