验证的高效液相色谱/盛名的量化方法在人血浆Tocotrienols

文摘

量化的tocotrienols在人血浆是至关重要的注意力转向tocotrienols是产生其独特的属性。我们的目标是开发一个简单和实用的正相高效液相色谱方法量化的四个tocotrienol同系物在人血浆。使用内部和外部标准,tocotrienol同系物是量化通过正相高效液相色谱荧光检测器维持在295 nm的激发波长和发射波长325 nm。四个tocotrienol同系物是分离在30分钟内。观察对象之间的大量个人间变异tocotrienols取决于食物的吸收矩阵和肠道脂解作用。的精度和上下限的量化介于92%和109%之间盘中化验和interday化验的90%和112%。该方法已成功应用于量化的总量四tocotrienol同系物在人血浆。

1。介绍

天然维生素E,或化学称为tocochromanols,由八个分子有16个碳链chromanol戒指。其中,天然维生素e (TP)饱和碳侧链而tocotrienols (T3)包含三个反式双键碳的尾巴。同系物的TP和T3,即α- - - - - -,β- - - - - -,γ- - - - - -,δ同系物,基于分类的数量和位置在chromanol甲基环(1,2]。不饱和碳侧链在tocotrienols产生其独特的生物功能。除了他们的抗氧化性能,T3广泛调查的抗癌和神经保护以及降低胆固醇作用[3,4]。T3的独特的性质得到了太多的关注在研究社区近年来,导致出现大量的人体临床试验。是一个关键需要验证和优化方法准确的量化T3在生物体液,特别是人类的等离子体。

1997年,美国石油化学家的社会(家)发布一个正式的方法量化的维生素E使用高效液相色谱法(HPLC),适合检测植物油和脂肪。然而,生物样品的直接应用该方法是有限的,由于干扰血液蛋白质和敏感性检测少量的缺乏。家的方法,αtp被用作参考T3标准目前还不清楚。Ng et al。5报道称,当校准使用αtp作为标准,维生素E浓度同系物似乎高估了。使用个人T3同系物标准校准方法,强烈建议T3浓度的精确测量。此外,荧光检测器提供了更高的灵敏度比紫外检测器报道家的方法,使精确测量少量的血样。

多年来,开发了几种方法对维生素E的量化使用高效液相色谱法。大多数这些方法旨在确定TP和T3在食品样品的浓度,包括榛子(6,橄榄油7],[棕榈油8),和谷物9]。一种方法使用反向phase-HPLC Yap等报道。10),检测3 T3同系物以及αtp在人类血液样本。李等人。11已经开发出一种方法,是能够量化维生素a和E和各种diet-derived类胡萝卜素在人血浆。然而,该方法涉及两个不同的分析列和探测器。另一方面,Abuasal和他的同事报道一个特定的γt3分析可以应用在人类和大鼠血浆(12]。在这项研究中,我们开发和验证一个截然分开色谱normal-phase-HPLC系统能够检测到少量的T3在人类血液样本。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

混合tocotrienols-tocopherols复杂石油悬挂含有11.51% 50%α生育酚,12.99%α-tocotrienol, 2.55%β-tocotrienol, 19.48%γ-tocotrienol, 7.28%δ-tocotrienol作为外部标准。内部标准2,2、5、7,8-pentamethyl-6-chromanol (PMC)和氯化钠买来Sigma-Aldrich Sdn(马来西亚)。有限公司正己烷、1,4 -二恶烷、丙胺和乙醇(LiChrosolv从默克Sdn年级)购买。有限公司(马来西亚)。空白的人血浆从输血医学,马来西亚马来亚大学医学中心。

2.2。仪表

TP和T3同系物进行分析使用安捷伦1100系列高效液相色谱系统配备四元泵(G1311A序列号DE91609486)、荧光检测器(G1321A序列号DE92002049),脱气器(G1322A序列号JP73021896) autosampler (G1313A序列号DE91611414)ChemStation软件。色谱分离进行了使用Luna 5 u 100硅ODS(250×4.60毫米·d, 5μ海波西尔列(粒径)Phenomenex美国)。列是维护的压力酒吧和温度26°C。100年样本注入的体积μL流量的1毫升/分钟和30分钟的总运行时间。流动相是准备使用正己烷、1,4 -二恶烷、丙胺为97.5:2.0:0.5% v / v / v,脱气前由声波降解法使用。使用荧光探测器发现了维生素E同系物激发波长295 nm和发射波长325 nm (PMT-Gain 10)。

2.3。制备的标准解决方案

Tocotrienols-tocopherols复杂的50%的石油悬挂标准准备股票在1000 ppm解决方案的乙醇。工作标准溶液100 ppm是由股票稀释标准溶液在人血浆。六个稀释从100、75、50岁,10,5比1 ppm准备在人血浆。PMC作为内部标准(是)为流动相在2000 ppm作为股票的解决方案。工作标准的解决方案(10 ppm)是由串行在流动相稀释。

2.4。人血浆样品的制备

人血浆样本准备根据Nesaretnam方法之前报道等。13)与轻微的修改。体积为0.5毫升的人血浆之前添加到12毫升玻璃试管和0.05毫升10 ppm是飙升。混合涡10秒钟,离心机在2500转2分钟4°C。一毫升的0.9%氯化钠(氯化钠)添加和涡大力,紧随其后的是一个添加1毫升乙醇。涡旋混合。然后,5毫升的正己烷混合添加,动摇了一小时在1400 rpm通过使用一个小瓶(IKA-VIBRAX-VXR, IKA,德国)。混合物是离心机在2500 rpm 15分钟4°C的温度,之后上有机层提取和蒸发干燥氮气。干样本重组前0.5毫升的流动相分析。样品进行分析,-平均血浆水平-同系物从3志愿者确定。

2.5。探测范围

校准曲线建立了使用六个标准浓度的总tocotrienols从1到100 ppm。最高的地区α-tocotrienol,γ-tocotrienol,δ-tocotrienol,策划反对他们的名义浓度和校准曲线建立了基于线性方程,在那里代表了峰面积,代表了标称浓度,代表斜率,代表了截距值。线性回归是评估使用相关系数()。选择性和特异性测定与分析空白血浆。检测极限(LOD)确定使用最低浓度与峰面积的信噪比(S / N)的比率≥3。量化(定量限)被称为极限最低浓度校准曲线的定量结果可以与高度的信心,报道了峰值信噪比≥10。

2.6。精密度和准确度

方法的精密度和准确度进行评估通过分析量化(LLOQ)的下限和上限的量化(ULOQ)。三个复制LLOQ和ULOQ盘中分析在同一天(天)的精度。Interday(天)精度是通过分析三个连续复制LLOQ和ULOQ天。内部——interday精度表示为相对标准偏差的百分比(%相对标准偏差)。偏离真实价值决定通过比较获得的浓度与标称浓度盘中和interday准确性和表达为%的准确性。

2.7。补充的Tocotrienols

与代谢综合征的受试者招募从马来西亚人口类别从25岁到56岁。道德伦理委员会的批准获得大学Putra马来西亚和注册https://clinicaltrials.gov/(NCT01631838)。受试者补充tocotrienol (Tocovid Suprabio) 200毫克每日两次为14天。血液样本被收集到K3EDTA真空采血管4小时后食用胶囊在14天。血浆样本收集使用离心3000 rpm 14分钟4°C。所有人血浆样品在液氮并存储在−snap-frozen 80°C到分析。这项研究是根据进行良好的临床实践和2008年赫尔辛基宣言》指导方针。

3所示。结果与讨论

3.1。选择性和特异性

图1说明了空白的等离子体,等离子体中掺入的色谱-混合生育酚/ -标准。色谱图的空白血浆,选择性验证是没有观察到除了内源性干扰峰αtp和未知峰,这是检测分别为7.9和12.5分钟,。的消除半衰期长αtp,报道大约20 h的价值,存在的主要原因αtp在空白血浆峰值14,15]。这类似于一些临床研究报告的结果(10,16,17]。因此,当前的方法不理想的量化αtp在等离子体。未来努力校准使用合成等离子体(18]或等离子体脱下内源性化合物是必要的。特异性和T3同系物是确定数据1 (b)和1 (c)。是观察到的保留时间9.8分钟,在缺乏内源性干扰。T3同系物的洗脱后的顺序αt3,βt3,γt3,δt3为8.8,13.1,14.6,和21.6分钟。尽管所有的山峰一般都分开,保留时间βt3和未知的峰值在等离子体相对较近。识别未知的峰值在未来的研究是必要的。峰的分辨率αtp可以提高跟踪效果观察。根据Ng和袁(19),生育酚的衍生物,tocomonoenol筛选了αtp和αt3。tocomonoenol高峰可能会通过轻微修改来解决当前的色谱分离方法来避免高估αtp。然而,有限的可用性tocomonoenol标准可能会阻碍识别过程。

3.2。探测范围

校准曲线建立了使用六个标准浓度为总tocotrienols从1到100 ppm。对个人tocotrienol同系物,探测距离(0.02 ppm 20 ppm)是总结表1。峰面积的变化是相对较小(陆范围在5 - 8)天,天。因此,校准曲线建立了基于峰面积对名义T3的浓度。然而,它是合理的构造校正曲线使用T3同系物的峰面积比值与将来工作为了消除峰面积的变化。在这种方法中,相关系数(所有T3同系物)均高于0.999,都足够高来表示峰面积和T3浓度之间的线性相关。另一方面,每个T3同系物的斜率和多样截距值(表1)。我们的研究结果与建议,Ng和袁(19),量化的维生素E同系物应该与自己的标准,以避免高估或低估。LLOQ和ULOQ tocotrienols总量的测定总tocotrienols 1 ppm和100 ppm,分别。对个人同系物,LLOQ ULOQ与校准范围总结表1。表2总结了LOD和人血浆T3同系物的定量限。色谱定量限的LOD /在补充数据(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/357609)。所有T3同系物似乎也有类似的LOD和定量限如下稀释定量限不屈服的S / N比≥3。定量限LOD和观察到的范围从0.0255 ppmβt3 0.1948 ppmγt3,值高于Yap等报道。10),李et al。11],Abuasal et al。12]。然而,S / N的比例βT3相比相对较低的其他T3同系物由于其低浓度tocotrienols-tocopherols复杂50%标准。使用纯个人T3同系物标准将大大改善未来的工作的T3量化的准确性。

3.3。精密度和准确度

方法的精度取决于量化% RSD为LLOQ和ULOQ内部和interday分析(表3)。% RSD为发现小于5% LLOQ和ULUQ内部和interday分析。变化是略高于2%,FDA指南推荐的行业分析方法验证的生物等效性。注入体积和探测器的不一致性可能会产生变异,尤其是对低浓度LLOQ。该方法的精度可以提高校准使用内标峰面积比分析物的峰。面积比校准更可再生的和消除了仪表不一致20.]。LLOQ精度和ULOQ介于109%至92之间,盘中化验和90年为112%,interday化验。国际会议统一技术要求注册药品对人类使用(我)指南建议在80 - 120% %精度可靠估计的真正的价值。

3.4。Tocotrienols在人血浆样品的浓度

图2说明了人血浆的色谱三男性志愿者后混合tocotrienols消耗200毫克。在补充后4小时,T3在等离子体中发现的总量范围从0.93 ppm到6.13 ppm。根据Yap et al。10)和Fairus et al。21),血浆浓度最高的T3 ()是达到4 - 5小时,依赖于不同的同系物。观察对象之间的大型个人间变异。这种现象以前报道恒et al。22),tocotrienols通过脂蛋白途径被吸收,这是依赖食品矩阵和肠道脂解作用[23]。表4总结了不同T3同系物的水平检测。Alpha-T3和γt3似乎是最丰富的,与高量关联Tocovid Suprabio胶囊(61.52毫克αt3, 112.80毫克γt3和25.68毫克δt3)。的恢复是计算为100%,119%,和128%,分别为主题A, B, c三个身份不明的山峰被发现在大约10.8,11.9和17.6分钟。他们被假定为β- - - - - -,γ- - - - - -,δ生育酚虽然需要进一步的识别与各自的标准。

4所示。结论

一个简单的、具体的和可再生的开发和验证高效液相色谱法(HPLC)检测人血浆tocotrienols。该方法选择性和具体的检测α- - - - - -,β- - - - - -,γ- - - - - -,δ在人血浆t3。验证方法显示出足够的精密度和准确度的浓度从0.02到20 ppm。稳定性测试在冻融循环和环境温度的验证分析和样本的条件下储存。目前的方法已申请量化tocotrienol水平在人类志愿者食用混合tocotrienols的等离子体。这种方法将用于临床研究精确的量化tocotrienols在生物体液,特别是人类的等离子体。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目是由马来西亚棕榈油局(MPOB)。作者感谢MPOB总干事许可发布。Hui-Ling格瓦拉,Doryn Meam-Yee Tan, Yee-Lin Gan资助下MPOB研究生助教奖学金计划的研究生学习。

补充材料

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