胶束增强Spectrofluorimetric方法测定人血浆和尿液中Ponatinib通过Cremophor RH 40为传感的代理

文摘

一个令人印象深刻的简单和精确spectrofluorimetric过程建立和验证了ponatinib (PTB)定量在人类血浆和尿液等生物液体。这种方法取决于研究胶束体系的荧光特征的肺结核Cremophor RH 40 (Cr RH 40)。Cr RH 40的固有荧光增强PTB明显水的水。荧光光谱的肺结核被记录在457 nm激发后在305海里。最大荧光强度达到了增加0.7毫升的Cr RH 40毫升之一磷酸盐缓冲剂肺结核整除,然后用蒸馏水稀释。有荧光强度之间的线性关系的肺结核和它的浓度范围5 - 120 ngmL⁻¹检测极限和量化等于0.905 ngmL的极限⁻¹和2.742 ngmL⁻¹,分别。该方法的准确性和精度检查和给了足够的结果。采用的方法是与一个巨大的成功申请PTB定量不同生物矩阵(尖刺人血浆和尿液)给予高恢复值。

1。介绍

Ponatinib (PTB;图1)是一种口服生物利用率药物建立了管理慢性费城染色体阳性(Ph值+)急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨髓性白血病(CML) [1]。

bcr - ABL致癌基因,是费城染色体的结果(Ph) 22 q,编码嵌合bcr - ABL蛋白负责ABL酪氨酸激酶的活性。这反过来的基本原因是慢性粒细胞白血病(CML) [2]。ABL是“阿贝尔森”9号染色体上的基因虽然BCR 22号染色体基因“断点集群地区”。在过去的几年里,不同的试验进行了开发与CML治疗病例已成为对不同TKIs可用药物,如伊马替尼,达沙替尼。Ponatinib尤为比其他TKIs更有效,因为它能治疗的患者表现出T315I突变(3]。

美国食品和药物管理局(FDA), 2012年12月,批准PTB平板电脑(Iclusig平板电脑,阿瑞雅德生产的药品,Inc .)管理的成年患者遭受加快,慢性或blast-phases慢性粒细胞白血病(CML)或费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph值+)由前面的酪氨酸激酶抑制剂(不受影响4,5]。2013年10月,美国食品及药物管理局和阿瑞雅德制药,Inc .)决定挂断电话营销的肺结核。这是基于显著增加的情况下严重动脉血栓形成的场合被连续监测药物的USFDA [5,6]。2014年1月,制造商重新开始营销PTB警告清楚地写在盒子上传播谨慎从血管闭塞和肝毒性发生在接受肺结核的病人中5,7]。

通常是一个彻底的理解水平与药物的关系活动是至关重要的常规使用药物。治疗药物监测是基于准确和精确测量的生物样品中的药物,例如,血液和尿液,在几次治疗。

对于病人,临床评估和额外的治疗应采取替代的精确分析方法进行验证。以相似的方式,在确定毒性水平,功效,或新颖的治疗药物的药物动力学和/或新的药物组合,高效和可靠的分析技术是必要的。因此,全面具体、准确、精确的方法来确定肺结核在生物体液是至关重要的。另一方面,荧光光谱已经知道承受足够有效的和可靠的方法来确定许多药物散装形式或在不同的矩阵(8,9]。应用micelle-enhanced spectrofluorimetry也被证明增加的敏感性定量的几个小分子(10- - - - - -12]。这是完全基于形成胶束的能力进而提高强度弱荧光化合物的。此外,micelle-enhanced spectrofluorimetric方法提出了高效和绿色化学的方法,由于没有任何有机溶剂。这些方法都依赖于表面活性剂如渐变(13,14),钠十二烷基硫酸盐(SDS) [15,16),和环糊精17,18]。然而,最近我们组是第一个报告的使用非离子表面活性剂”Cremophor RH 40;Cr RH 40”增强胶束spectrofluorimetry [19,20.]。生产Cr RH 40包括四十摩尔的环氧乙烷的反应和氢化蓖麻油。Cremophor RH 40是主要由triricinoleate酯组成的乙氧基甘油和小数量的蓖麻酸聚乙二醇,相当于免费乙二醇(21]。在文献综述时,没有发表在生物样品分析方法量化肺结核。

因此,当前的研究是为了建立敏感和验证spectrofluorimetric方法定量的肺结核在人血浆和尿液。该过程的特点是简单、灵敏度和重现性。

2。实验

2.1。仪器

Jasco fp - 8200荧光光谱仪(Jasco公司(日本)配备了150 W氙灯和1厘米石英电池是利用荧光测量。激发和发射单色器的狭缝宽度调整为5.0 nm。仪器的校正和线性定期评估标准溶液为0.01µgmL⁻¹硫酸奎宁。校准的波长校准是通过测量在275纳米在430海里;没有检测到波长变化。SpectraManager软件是用于记录光谱的格式更改为ASCII。pH值调整,汉娜酸碱计(罗马尼亚)是利用。

2.2。试剂和材料

利用溶剂的液相色谱品位和所有化学试剂均为分析试剂级。Ponatinib参考粉与LC声称纯度99.6%的采购实验室(美国马沃本)。Cr RH40和Cr EL采购从巴斯夫(德国路德维希港),利用v / v 1%解决方案Cremophor RH40和1% v / v Cremophor厄尔在水中。SDS(十二烷基硫酸盐钠;95%)是获得Winlab(庞特法、伦敦、英国)和准备1% w / v在水里。Β-CD (β环糊精)和CMC(羧甲基纤维素)都从默克公司购买(达姆施塔特,德国)和溶解在水中1% w / v。渐变20,80年和85年从电子采购Pharmchem哈里亚纳邦公司(印度新德里)和利用在水中1% v / v。乙醇和甲醇来自VWR Prolabo (Fontenay真空木香、法国)和ACN(乙腈)从Sigma-Aldrich化学GmbH (Schnelldorf,德国)。磷酸盐缓冲剂和0.1米和0.1米硼酸缓冲,包括pH值范围2 - 7和8 - 10,分别是刚做好的,所有的试剂,即氢氧化钠、硼酸、氯化钾、磷酸、磷酸氢二钠,磷酸二氢钾,光谱的品位。超纯水是通过微孔Milli-Q超滤+净水器(马、美国)。血浆样本来自哈立德国王大学医院(已经利雅得,沙特阿拉伯)。所有病人提供书面知情同意,然后空腹血标本收集紧随其后的是等离子体分离和储存在−70°C。

2.3。标准的解决方案

股票的解决方案的肺结核(1 mgmL⁻¹)是由溶解25毫克的肺结核参考标准粉到25毫升乙腈在25毫升量瓶,稀释到适当的标记。股票的解决方案是然后用甲醇稀释2倍标准溶液(1)准备工作μgmL⁻¹。这些标准的稳定性方案时检查至少14天在冰箱里举行。

2.4。校准图施工

不同样本由转让部分的标准解决方案的肺结核的一组五毫升烧瓶其次是0.7毫升的Cr RH 40毫升的磷酸盐缓冲剂。然后成交完成使用蒸馏水获取最终5 - 120 ngmL浓度⁻¹。烧瓶内的内容是混合好,荧光强度被记录在457 nm(激发后305海里)。建设校准图表,FI的准备样品在ngmL绘制againstcorresponding PTB浓度⁻¹。最终,校准曲线的线性回归方程计算。

2.5。人血浆样品的分析

20毫升的肺结核标准解决方案(代表变量肺结核浓度)飙升每个成1毫升整除的人血浆和混合60秒达到50 ngmL最终浓度的肺结核⁻¹,60 ngmL⁻¹70 ngmL⁻¹,75 ngmL⁻¹。随后,一毫升氢氧化钠量100毫米/甘氨酸缓冲pH ~ 11添加和管涡10年代。液液萃取是通过使用明确的体积的乙醚(5毫升)和解决方案是涡为15分钟30秒之后,离心分离10000 rpm,确保完成阶段。4毫升的有机相汇聚成玻璃小瓶和允许干燥通过温柔的氮。最后,干残渣在ACN重组,其次是实施校准中提到的一般步骤图施工。治疗一个空白样品在相似的条件下发生。FI被记录在457 nm(激发后305海里),应用线性回归方程计算的肺结核浓度。

2.6。人类尿液样本的分析

飙升的一毫升的人类药物免费尿发生20µL不同肺结核的标准解决方案和混合1分钟。一毫升氢氧化钠量100毫米/甘氨酸缓冲pH ~ 11添加混合10年代紧随其后。液液萃取是通过使用明确的体积的乙醚(5毫升)和解决方案是涡为15分钟30秒之后,离心分离10000 rpm,确保完成阶段。此时4毫升的有机相汇聚成玻璃小瓶和允许干燥通过温柔的氮。最后,残留在ACN重组,进行适当的稀释到收益率最终肺结核10 ngmL的浓度⁻¹,20 ngmL⁻¹,60 ngmL⁻¹,120 ngmL⁻¹。最后,程序称为下校准图施工完成。治疗一个空白尿液样本发生在类似的方式。FI被记录在457 nm(激发后305海里),应用线性回归方程计算的肺结核浓度。

3所示。结果与讨论

有必要发展敏感和可靠的PTB定量生物样本的方法,例如,人类血浆和尿液。Spectrofluorimetry特点是灵敏度高,提高选择性,广泛的可用性在质量控制实验室和简单。这些优势是采用这种技术的动机我们的工作。实验参数,可能会影响荧光强度的肺结核测试和调整准确,一次改变一个参数,而其他参数保持不变。

3.1。荧光光谱和特点的肺结核

代的荧光光谱是基于电磁辐射的吸收。肺结核显示一个激发波长为305 nm。PTB的荧光化合物,发射光谱被记录(使用1µg / mL)激发单色仪设定在305 nm的发射单色仪和扫描范围320 - 580 nm。加强与最大发射峰457 nm发生在光谱,证明PTB荧光行为。荧光光谱的肺结核在水介质和Cr RH 40(图2)。

存在的Cr RH 40了增强的肺结核荧光强度了近8倍相比,其内在一个在水里。这种改进可能归因于肺结核周围的微环境的差异在胶束介质与水相比,这可能是由于限制支持的无限制的旋转与排放[竞争12]。

3.2。实验条件的优化

3.2.1之上。组织了媒体的影响

各种组织媒体进行测试调查影响FI的肺结核的0.5毫升的个人有关肺结核水解决方案的解决方案。各种表面活性剂包括渐变20、80年和85年,Cremophor El, Cr RH 40(非离子表面活性剂)十二烷基硫酸钠(SDS)(阴离子表面活性剂)、羧甲基纤维素(CMC)和大分子如β环糊精是尝试。最伟大的FI收购利用Cr RH 40和渐变20作为显示在图3。通常,非离子表面活性剂具有优良的疏水药物的增溶能力非离子表面活性剂。相对来说,这可能是由于他们的低临界胶束浓度(cmc)值22]。然而Cr RH 40是用于我们的研究由于其低荧光强度分析波长相比与其他表面活性剂如渐变20。

3.2.2。Cr RH 40体积的影响

Cr RH 40对荧光强度的影响了使用各种量的1% w / 40 v Cr RH。很明显从图4增加卷的Cr RH 40溶液导致肺结核荧光强度相应增加0.6毫升1% (w / v)。本卷后,没有发现在荧光强度增加。因此0.7毫升1% w / 40 v Cr RH解决方案被选为最佳体积PTB决心(图4)。

3.2.3。pH值的影响

pH值影响FI的肺结核测试利用各种缓冲区覆盖2 - 10的pH值范围,例如,pH值范围2 - 7日是使用0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值范围覆盖8 - 10是使用0.1硼酸缓冲。数据显示的初始增加FI的酸度增加和FI最高达到7.0±0.2(图5)。这种行为可能推断出的不稳定(水解)Cr RH 40 triricinoleate酯在酸性和碱性介质。

3.2.4。稀释溶剂的影响

调查不同稀释溶剂的影响,水,甲醇,乙醇,乙腈。水显示最大FI比别人,可由于介质的极性的变化,可能会导致物理之间的相互作用研究了溶剂和肺结核激发单重态(图6)。因此,在研究了用水稀释。减少FI的肺结核在Cr RH 40的甲醇、乙腈、乙醇,可以归因于的变性胶束。短链醇,甲醇或乙醇主要是溶解在水相,改变溶剂的性质,影响胶束的形成。此外甲醇或乙醇可能减少胶束大小和分解表面活性剂在高浓度聚合(23]。

3.2.5。影响的时间

时间影响稳定性的PTB FI Cr RH 40测试。肺结核FI立即产生,至少持续一个小时。

从上面的实验程序,很明显,最大响应通过添加0.7毫升的Cr RH 40毫升之一磷酸盐缓冲剂肺结核整除,使用水作为稀释溶剂然后记录RFI在457 nm(激发后305海里)。

4所示。方法验证

不同的验证参数如线性、灵敏度、准确性、特异性、可重复性和再现性计算根据EMA生物分析方法验证指南(24]。

4.1。线性范围和校准

校准情节的肺结核定量是由绘图FI和肺结核标称浓度。这个图是线性表中列出的浓度范围1。产生的数据统计分析(25)也预期在表1显示高确定系数值()和低残差的标准差值()、斜率()和拦截()以及低%相对标准偏差和%的错误。肺结核的线性校准情节也验证了这些值。

4.2。定量限度(定量限)和检测极限(LOD)

定量限度(定量限)和检测极限(LOD)计算使用我Q2 (R1)指南24]。定量限的计算是基于发现下面的可测量的浓度最低的肺结核的校准情节偏离线性而LOD计算是基于估计最小容易检测肺结核浓度。表的数据是删节1。定量限和LOD值按以下公式计算: 在哪里和代表SD的拦截和回归线的斜率,分别。文献发表的数据26)(最大血浆浓度(约50名ngmL)的肺结核⁻¹显示我们的(2.742 ngmL定量限⁻¹)显著低于肺结核有关肺结核,因此,可以很容易地确定等离子体。

4.3。准确性和精度

表2和3显示内部和interday建议方法的精度和准确性。三个复制样品4分析了不同浓度的肺结核在同一天和连续三天来计算内部interday精度,分别。的计算精度(%偏见)以下方程后: %的范围偏见−3.6至2.16%,说明该方法的准确性。内部和interday精度被描述为%复苏。意味着复苏(约100%)和低价值的RSD为依据的国际米兰,盘中精度采用程序(表3)。这些结果表明,采用spectrofluorimetric方法的准确度和精密度。

4.4。鲁棒性

鲁棒性研究方法的评估决定的敏感性小的修改分析条件。很明显从表4深思熟虑的变化可能发生在没有改变PTB FI的实验条件。

4.5。选择性

选择性的方法证明了分析的肺结核在不同血浆和尿液等生物矩阵。很明显从表6该方法选择性够PTB决心这些矩阵(小的值表示的SD PTB分析血浆和尿液),和没有干扰从尿或血浆内源性组件。

4.6。稳定和稀释的完整性

PTB稳定尿液和血浆样本评估通过分析三个复制两个不同浓度的样品进行各种处理和存储条件。三份的个体样本用于评估桌上型稳定(短期稳定),冻融稳定性和长期稳定性。桌上型稳定性评估暴露后的血浆和尿液样品室温至少6小时。冻融稳定性评估三冻结后(在−80°C)解冻(室温)周期。长期稳定评估存储后血浆和尿液样品在80°C−14天左右。肺结核的稳定工作和股票的解决方案是在室温下进行24 h, 2 - 8°C为14天。稳定性的研究都是针对刚上升的校准标准。在血浆和尿液样品被认为是稳定的平均偏差计算浓度稳定质量控制样品在±15%。稀释完整性锻炼也执行,确保完整性的肺结核在样品中上述校准范围的上限,需要被稀释。一个新的股票PTB解决方案准备和飙升血浆和尿液浓缩的。 level of 1.8 times of the highest concentration in the calibration range; it was then diluted 2 and 4 times. Three aliquots of both dilutions were analyzed and the integrity of the samples was considered to be maintained if % nominal is within ±15% of nominal values and % CVs ≤ 15% at both diluted levels. All the stability studies results were summarized in Table5。很明显,股票和解决方案的肺结核在室温下稳定工作了24小时,2 - 8°C至少14天。肺结核是稳定在人血浆和尿液在室温和−80°C。意味着复苏%和CV %为1/2和1/4稀释样本在95 - 105%,< 1.4%。

5。应用程序

5.1。分析在人血浆的肺结核

采用高灵敏度的分析方法证明了人类血浆PTB很容易量化。肺结核是一种口服药物及其达到政府由5 - 6小时后(27]。的的肺结核从50到77 ngmL不等⁻¹(26,28]。因此,肺结核在等离子体水平的线性范围采用过程(表1)。表6显示,平均绝对复苏和%相对标准偏差的肺结核血浆样品中分别为0.74%和85.01%,分别。穷人复苏的肺结核(低于90%)可能是由于其高血浆蛋白结合在人类(> 99%)。

5.2。尿液分析的肺结核

近1%的肺结核每日推荐剂量(约45毫克)是[随着尿液排出28]。因此,尿液中药物水平(0.45µgmL⁻¹)高于工作范围采用方法的100倍。结果在表5透露,平均绝对复苏和%相对标准偏差的肺结核在尿液样本分别为2.16%和98.77%,分别。这些优秀的结果(平均绝对恢复100%左右)可以显示大稀释(100倍)的行动是必要的,以达到我们的工作范围(5 - 120 ngmL⁻¹)。这一庞大的稀释导致减少干扰,从内源性氨基酸。

5.3。假定的Cr RH 40增强机制

改进的PTB荧光可能是由于提高量子产率和/或一个增强吸收的激发波长。摩尔吸光系数计算的肺结核在Cr RH 40发生在305海里。的比几乎是等于1这意味着PTB荧光增强并不是因为增加的肺结核在胶束体系。PTB量子产量0.879在乙腈和0.946 Cr RH 40的存在。PTB量子产率的增加导致胶束溶液可以保护单重态的最低激发态在Cr RH 40不辐射的过程。计算量子产率是由应用下列方程(11]: 在哪里是肺结核的荧光量子产率,而奎宁是荧光量子产率。和的积分FIs PTB和奎宁分别;和是肺结核和奎宁在激发波长的吸光度值,分别。减少内部错误,影响肺结核浓度被选为生产吸光度低于0.05 (29日]。

6。结论

这项研究是第一个为肺结核量化分析方法定量限和LOD值0.905和2.742 ngmL⁻¹,分别。这些值确保采用方法的灵敏度就越高。这个方法可以被认为是在绿色的分析方法,由于缺乏有机溶剂的过程。采用的方法是有效、快速和简单而传统的色谱技术,如高效液相色谱法。常规分析的方法可以应用在人类血浆的肺结核以及人类尿液由于实用的简单性和敏感性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者想扩展他们的真诚感谢院长以来沙特国王大学的科研资助这项工作通过研究小组项目。以序列- vpp - 322。

引用

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