应用CZE在常规分析方法测定复合维生素b族维生素在制药和兽医的准备

文摘

竞争CZE维生素制剂质量控制方法分析和兽医产品包含用于b族维生素。感兴趣的维生素是盐酸硫胺素(B₁一磷酸),硫胺素氯(B₁)、核黄素(B₂),riboflavine-5′一磷酸(B₂)、烟酰胺(B₃),d-pantothenic酸钙盐(B₅)、盐酸吡哆醇(B₆)、叶酸(B₉)和4-aminobenzoic酸(B₁₀)。这些分析物被分开在20毫米四硼酸盐缓冲优化实验条件(背景电解质)知母,贝克曼P / ACE系统最小检测量仪器,使用裸熔融石英毛细管。有效的毛细管长度是49.5厘米,μ米,应用电压20 kV和温度25^∘c .检测是由二极管阵列检测器在214 nm为所有维生素B除外₅(190海里)和B₂(260海里)。分离的时间大约是9分钟。实验条件优化后,该方法被验证。迁移时间和峰面积校正精度、线性范围、LOD和定量限、准确度(复苏),健壮性和强度进行了评估每个分析物展示良好的可靠性的方法。制药实际样品分析的进行,证实了该方法的通用性。

1。介绍

质量控制(QC)在制药行业中扮演着重要的角色。事实上许多分析方法,采用了不同的技术,正在开发制剂的评价。维生素B组,rp -分离。一个方法同时测定牛磺酸和10的水溶性维生素包括维生素B₁(硫胺素),B₂(核黄素),B₅(泛酸),B₆(吡哆醇、吡哆醛),B₈(生物素),B₉(叶酸),C(抗坏血酸),B₃(烟酰胺和烟酸)在维生素片的开发和验证。电喷雾质谱检测组件是(1]。一些我们感兴趣的水溶性维生素(抗坏血酸、盐酸硫胺素、riboflavine-5′磷酸钠、盐酸吡哆醇,烟酰胺,和(+)泛醇)和两个防腐剂(methylparaben和苯甲酸钠)在维生素糖浆被布置得井然有序Zorbax SB-Aq (C18)列2]。HPLC-UV方法建立了同时测定8维生素,包括B₁B₂B₃B₆B₉维生素b12,抗坏血酸在婴儿奶粉3]。验证HPLC-UV方法7复合维生素B族维生素(B的决心₁B₂B₃B₆B₉和维生素b12)在制药和生物液体后进行固相萃取(4]。同时测定水和脂溶性维生素制剂的高效液相色谱法进行了在一个单一的运行使用权力平等主义的结合和线性梯度洗脱和流动相组成的三氟乙酸和甲醇。方法应用于实际样品。结果是在良好的协议与声明的值。维生素B分析是₁B₂B₅B₆B₉B₃,B₁₂(维生素b12) [5]。

RP离子对应用高效液相色谱法(HPLC)测定的一些维生素维生素与矿物质从不同的作者很感兴趣。烟酰胺、盐酸吡哆醇硝酸硫胺和核黄素高效液相色谱方法验证使用甲醇0.5%醋酸作为流动相(6]。

一个敏感的rp方法的开发和验证B的同时测定₁B₃B₆,B₉在Pentovit涂布平板电脑。上的程序进行了Supelcosil ABZ列与甲醇,heptanesulfonic酸钠盐,和三乙胺作为流动相7]。测定的硫胺素和核黄素Duoweiyuansu平板HPLC-UV方法成立。离子对试剂的流动相组成(包含1-hexanesulfonate、冰醋酸和三乙胺)/甲醇(80:20)。该方法可用于质量控制的硫胺素和核黄素Duoweiyuansu平板电脑(8]。有许多论文对维生素B群分析了毛细管电泳(CE)及其修改。一些作者研究了测定食品中的维生素基于超临界流体萃取在胶束电动毛细管色谱(MEKC)分析的各个组件。该方法优化使用胆盐钠作为胶束相分离的11维生素b,抗坏血酸和4杂质在大约25分钟9]。其他作者研究了毛细管区带电泳(CZE)分析的影响较低的有机醇通过(甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙二醇、正丁醇、异戊酒精度)和正己烷作为有机修饰符在磷酸缓冲不同SDS浓度使用一组维生素和羟基苯甲酸作为测试混合物。最佳分离了特别是在高浓度的表面活性剂(10]。CZE分析三种维生素(B₁B₂,B₆在平板电脑市场取得使用phosphate-borate缓冲pH值9.0短时间的分析(5分钟)11]。一年后同样的作者研究的另一个具体,精确、灵敏、准确的分离方法相同的维生素获得分离效率高、分析时间短(3分钟)12]。四个维生素B, B₁B₂,吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺(B₆)在制药产品使用CZE同时测定。HCl soln.是用于提取的维生素multivitamin-multimineral平板电脑。知母采用钠磷酸盐缓冲剂(pH值9.0)(13]。

四:水溶性维生素的混合物进行分析通过CZE和MECK。不同药物配方的定量分析比较与美国药典的LC方法获得一个好的相关性(14]。

快速的方法开发的同时分离五维生素:B₁B₂B₆、烟酰胺、烟碱和抗坏血酸。他们测试了实际样品15日获得良好的分辨率(CZE)和(作为)。CZE执行0.02硼酸缓冲,而硼酸作为在0.02 /乙腈含有磷酸盐缓冲剂为4%。0.1十二烷基硫酸钠(15]。

一些作者研究的方法分析六水溶性维生素(硫胺素、烟酰胺、核黄素、维生素b6遍多,和抗坏血酸)在制药配方,CZE。良好的折衷方案,分析时间,分析物稳定性是通过使用一个50毫米硼砂缓冲的pH值8.5。这CZE分离的方法是非常有用的更复杂的样品,但不能脱离烟酰胺维生素b12 CZE系统。事实上2化合物在无电荷的形式所使用的pH值。相反,他们被作为解决使用SDS。好的结果对线性、精度和准确性得到的浓度范围研究6维生素(16]。

有一些研究复合维生素b的光谱光度测量的方法。

光度法测定三元混合物的硫胺素,核黄素,人类血浆和吡哆醛在医药和最小二乘支持向量机进行。偏最小二乘(PLS)的建模和最小二乘支持向量机用于多元校正光谱光度测量的数据(17]。同样的程序已经成功地应用B的决心₁B₂B₃,B₆药品的其他作者(18]。

十四岁的同时测定水溶性维生素用于b和维生素C(13)在选择食品矩阵由LC / MS / MS技术是最近的一篇论文中描述(19]。分析物分离在不到10分钟,复苏在30%和70%之间。

制药行业的质量控制过程需要能够确定的方法,在一个单一的运行,大部分的组件。在许多情况下,确定所有组件的复合维生素药物制剂,需要执行不同的分析应用不同的技术。

毛细管电泳(CE)是一种强有力的分析技术,广泛应用于研究和药品质量控制。作为研究文献数据证明,(MEKC是唯一的方法9能够独立11用于b族维生素。其他CE方法提供单独的可能性只有少数(max 5)这类的分子。没有出版物的同时测定9个CZE用于b族维生素,最简单的在这个系统中,它提供了几个优势高效液相色谱快速分析等降低溶剂消耗,降低成本和较小的环境影响,和更高的效率。

为此,这项工作的目的是开发一个验证CZE方法测定多组分药物和兽医配方的常规分析。

2。实验

2.1。装置

分析P / ACE系统上进行了从贝克曼仪器富勒顿,CA(美国),UV-DAD探测器。强度评价,电泳分离进行了1000年SpectraPhoresis仪器从Thermo-Quest公司CA(美国)。

裸熔融石英毛细管ID = 50μ米,总长度59.5厘米和49.5厘米的有效长度是由上海黄金交易所的(澳大利亚墨尔本)。检测波长被设定为214海里。样品注射进行水动力模式(5 s在0.5 psi)。

2.2。化学品和材料

所有试剂均为分析纯的纯度。

硼砂,二水磷酸氢二钠,磷酸二氢钠一水合物,氯化钾,CTAB(溴化十六烷trimethylammonium)与丙烯酰胺(书、瑞士)。磷酸、氢氧化钠、氯酸和乙腈由卡洛Erba(意大利米兰)。Trizma基地(三(羟甲基)氨基甲烷),EDTA(乙二胺四乙酸)。碳酸氢钠,柠檬酸、草酸、酒石酸氢盐钠一水来自Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。

真正的样本商用医药产品:Berocca +(拜耳公司),Gabbrovital B的强项(精益VETEM SpA), Trinidex (LDB LAB.DIACO BIOMEDICALI SpA),和Biochetasi (Sigma-Tau SpA)。0.45解决方案注射器过滤器过滤μ米(Millex高压,微孔,妈,美国)。

2.2.1。维生素的标准

盐酸硫胺素(B₁)、氯化硫胺素焦磷酸(B₁)、核黄素(B₂),riboflavine-5′一磷酸(B₂)、烟酰胺(B₃),d-pantothenic酸钙盐(B₅)、盐酸吡哆醇(B₆),生物素(B₈)、叶酸(B₉B),₁₀(4-aminobenzoic酸)、维生素b12 (B₁₂)、羟钴胺素(B_12个一个),2 - 3 dihydroxybenzoic酸丙烯酰胺买来(书、瑞士)。

2.3。标准、缓冲和真正的样品制备

标准股票的解决方案的研究分析物(1毫克/毫升浓度)准备在蒸馏水、核黄素和叶酸在盐酸溶解,分别为3米和2米。

校准的解决方案是通过与蒸馏水稀释股票的解决方案给所需的分析物的浓度。真正的样品制备是不同的每个产品。

Berocca +准备,二十个平板电脑是加权和基于迫击炮。粉的数量相当于在一个平板电脑是加权,溶解在50毫升容量瓶蒸馏水。在超声波浴声波降解法10分钟后,上层清液的解决方案是离心5分钟,然后透过0.45μm注射器过滤器。最后的解决方案是用蒸馏水稀释浓度校准范围内。

对于Trinidex示例,静脉注射的解决方案是透过0.45μm注射器过滤器没有稀释和注射。

Gabbrovital准备,兽医肌内注射溶液被稀释1:1000由于其高度集中,然后过滤和分析。

Biochetasi样本,粉瓶中包含的肌内注射,是用蒸馏水稀释到所需的浓度,然后透过0.45μm注射器过滤器。

3所示。结果与讨论

3.1。方法开发和优化

为了提出一个合适的常规分析方法,它是必要的,以评估的实验条件研究分析物的最佳分辨率。

首先,因为不同的溶解度和稳定性对于每个维生素,许多他们的解散条件测试。CZE分析的几个参数,如成分知母和浓度、pH值、注入条件下,波长,外加电压和温度进行了探讨。

3.1.1。的影响成分知母、浓度和pH值

知母缓冲组合是毛细管电泳中最重要的参数之一。

为了获得最大的精度水平,有必要仔细选择缓冲。

大多数的维生素是氮含量,protonable分子,所以这项工作的起点是探索低pH值范围的分离。

初步步骤的研究,bg测试pH值介于1.5 - -4.2,浓度介于20毫米到50毫米,盐酸/氯化钾、磷酸、phosphate-oxalate,磷酸与乙腈5%,磷酸与CTAB phosphate-tartrate和酒石酸。

仅在20毫米磷酸盐缓冲剂在pH = 2.3好11个分析物的分离意识到23分钟。在图1分析物从1到7是阳离子,阴离子形式其他人(8 - 10)。在这些操作条件,核黄素(B₂)和维生素b12 (B₁₂)覆盖。因为这些化合物通常是包含在相同的药物制剂,它是不可能确定的。分析时间长、高强度电流和可重复性低迁移时间(RSD % ~ 10%)不允许提出这对常规分析程序。

因此研究在碱性缓冲维生素分离的可能性进行评估。

知母缓冲区在pH值在8.5和9.3之间的浓度范围20毫米到80毫米探索:三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液碳酸氢盐/碳酸,三/硼酸,硼酸,硼酸与EDTA与CTAB和硼酸。

最好9维生素分离实现了在20毫米硼酸缓冲在9分钟(图9.2 pH值2)。

山峰是对称和基线解决个人维生素B的异常d-pantothenic酸钙盐(B₅一磷酸)和riboflavine-5′(B₂coeluted)。自对称峰值间的较好的折中,决议,和分析时间导致20毫米硼酸缓冲在pH = 9.2,这些实验条件被选为最佳。

3.1.2。波长的影响

主要有必要选择最合适波长的同时检测维生素,因为每一个不同的谱特征。紫外光谱得到UV-DAD显示三个合适的波长定量分析。214海里所有的维生素,在异常d-pantothenic酸钙盐(B₅一磷酸)和riboflavine-5′(B₂),覆盖。那么这两个分析物的定量分析实现波长的190和260海里,因为考虑化合物不影响自己。事实上,维生素B₅只有最大吸光度在190纳米,而维生素B吗₂提出了两个最大值在214和260海里。

3.1.3。外加电压的影响

分离电压的优化分析等应用10至30千伏的电压。在低电压的所有分析物的分离了,但分析时间增加到20分钟的扩大峰值。增加电压(max 30 kV)最优值结果20 kV生产25 uA的电流强度和良好的重复性。30 kV分析物的分离是不完整的。

3.1.4。温度的影响

温度的增加(30°C)产生的缩短分析时间(减少)知母的粘度。它应该是有利的设置高温盒,但复合维生素b是热不稳定的。所以这些化合物的温度适合分析导致25°C。

3.2。方法验证

我之后的方法验证指导(20.]。

3.2.1之上。精度

精度评估的RSD为%的迁移时间()和纠正峰面积(盘中)和interday分析。盘中精度评价标准的解决方案在三个浓度水平(低,中间,和高)在同一天注射。估计interday精度标准的解决方案进行分析连续五天连续执行每天注射。计算RSD %值报告在表1。

3.2.2。校准范围

探测器响应的线性测试在不同的报道在表范围2。内标法定量分析的应用。的财产,是选择内标3、4 dihydroxy-benzoic酸。

六个标准解决方案,包含九个感兴趣的分析物和内标,都注入了一式三份。校准线得到策划R(纠正地区比)与标准浓度的解决方案使用Microsoft EXCEL。

3.2.3。LOD和定量限

LOD,分析物的最低浓度,可以区别于噪声,定义为信号噪声比S / N(3: 1是介于0.9μ9.0 g / mLμ克/毫升。

定量限,可以量化的分析物的最低浓度具有良好的精度,定义为信号噪声比S / N(10: 1是介于3.0μ30.0 g / mLμ克/毫升。

3.2.4。实际样品分析

分析了四个制药配方含有维生素b6。实验结果给出了表3。没有观察到干涉制药的解决方案。RSD %的迁移时间和校正峰面积值较低,分别为0.5%和3.0%。商业的典型electropherogram医药制剂(Berocca +)如图3。

3.2.5。精度

准确性是评价复苏化验的商业产品。强化后,真正的样本进行分析,导致浓度而获得的数据没有设防。结果恢复数据从97.0到101.4%。

3.2.6。强度

为此,1000年SpectraPhoresis测量装置在最优的实验条件进行。在这个仪器盒形式是不同毛细管总长度是44厘米,有效长度36厘米(短于最优长度的毛细管利用贝克曼仪器)。因此,在这个仪器,有必要应用低电压(10 kV)。electropherogram,获得设备,注射1秒的标准混合物在水动力模式,如图4。重复性的迁移时间从0.32%到0.52%不等。

4所示。结论

同时测定的方法开发了9个水溶性维生素(B₁B₁B₂B₂B₃B₅B₆B₉,B₁₀CZE)维生素药物配方。最好的分辨率得到了大约9分钟使用一个简单的四硼酸盐缓冲20毫米,pH = 9.2 25°C,恒压20 kV裸熔融石英毛细管。该方法适用于维生素B分析验证证实:它是精确的,准确的,崎岖的。实际样品的分析证明了其适用性。因为没有昂贵的试剂和不需要预处理的样品在这个过程中,它提供了一个有效的替代在制药行业质量控制分析。

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