活细胞动态实验室:时间流逝喇曼谱显微镜的纳米粒子IgE瞄准和pH-Sensing功能

文摘

综述了利用活细胞动态microlaboratories通过标记的实现纳米颗粒(纳米传感器)都感应和目标函数。2、4 -ε作为一个Fc -dinitrophenol-L-lysine (DNP)ε国际扶轮的目标配体和4-mercaptopyridine (4-MPy)作为pH-sensing配体使空间和时间监控FcεRI受体和pH值环境内的内吞作用的途径。为了确保可靠性,传感器校准在活的有机体内使用离子载体nigericin和标准缓冲平衡外部解决方案浓度与细胞的隔间。本文强调了纳米传感器,流量和响应能力的pH值receptor-bound纳米传感器(1)生理温度与室温(2)与bafilomycin药物治疗后,一个腺苷三磷酸酶泵抑制剂、阿米洛利的抑制剂/交换,和(3)的反应温度和药物治疗。全细胞,时间流逝图像显示演示了活细胞转换成动态实验室监测能力时空endosomal博士这些探测器的多功能性显示承诺未来的应用程序相关的细胞内走私和智能药物设计。

1。介绍

腔内的化学物质的浓度,细胞细胞器,如核内体、溶酶体、线粒体、高尔基体、内质网,往往不同于细胞质中。这些细胞的位置和化学差异单独隔间正在审问一个不断扩大的套件的技术。绝大多数的这些试剂应考虑荧光标签作为其光谱响应集成提供在共焦图像对比1,2]。然而,经常需要有一个传感器,而不是一个标签,为了测量代谢物的浓度,包括Ca^{2 +},不,Na⁺,pH值(3]。一般来说,传感器必须使用在光谱域特性的光谱响应变化的分析物浓度的变化,化学或氧化状态。

还可以执行使用拉曼散射实验对比机制在细胞成像。拉曼光谱和成像提供了化学物种的特定信息基于独特的振动特征。因此,记录细胞的光谱可以给在场的化学物种的详细信息。不幸的是,喇曼效应弱,分子的横截面来厘米²范围,明显低于那些良好的荧光标签的厘米²范围(4]。拉曼在荧光显微镜的一个固有的好处是,它记录了自然丰富的化学物质,因此,是一种label-free技术。然而,如果一个是愿意放弃这种优势,就可以利用表面增强拉曼散射(ser)的纳米颗粒作为标签或传感代理(5- - - - - -13]。ser喇曼散射信号提供了一个增加许多数量级(9,14- - - - - -16]。此增强功能可以访问固有的化学特异性较低的拉曼光谱检测限制和/或收购的速度快。此外,它使几乎无限的灵活性设计实验基于纳米颗粒表面的配体选择。一般来说,有多种配体,包括配体,导致细胞给特定的地点或纳米粒子系统和配体时记录特定代谢产物的浓度。建立一个有针对性的纳米传感器,一个既有功能,创造了一个新的工具将细胞变成动态的实验室。此外,最重要的优势最终可能是整个生活的能力记录延时光谱显微细胞对大幅刺激作出回应时更长时间的荧光显微镜,往往受到光漂白。

纳米传感器创建基于胶体粒子的选择平台,分子靶向配体和记者。纳米平台一般包括贵金属、尤其是Ag) (17),而非盟(18,19),以及各种几何图形包括空心壳体(20.和核/壳21,22粒子。对于靶向配体,一般研究人员使用本地化肽(23]或抗体(免疫球蛋白)提供特定位置或亚细胞系统的纳米粒子24- - - - - -26]。记者配体,大多数研究表明分析物的浓度与爵士的纳米传感器是博士粗略地说,纳米传感器的灵敏度将会在几个数量级的离解常数,,使用的报道分子。配体的选择是基于能力的外套金属表面和具有独特的拉曼振动签名以及感兴趣的分析物的敏感性和特异性。pH值,不同的研究人员演示了基本的(27],中性[17,20.],acidic-range [10- - - - - -12,28,29日根据不同的配体)传感器。特别是,酸性浓度的测量(3 < pH < 7),它已经表明,使用4-mercaptopyridine (4-MPy)是一种有效的策略7,21]。这项工作的重点是在细胞内的酸性pH值的动态监管endosome-lysosome系统,这是为了支持降解酶以及受体和配体的正确排序后内吞作用[30.- - - - - -32]。Endosomal封存的弱碱性化合物,如正定霉素可能通过pH-partitioning机制,可能是一个因素在耐药性33]。endosomal-lysosomal系统中的低pH值也可以在疾病的发展中发挥作用34- - - - - -37]。

能够采用活细胞动态microlaboratories,重要的是,整个地图高光谱被记录下来。然而,点光谱喇曼映射通常是太慢了有关对大多数生物系统。这一目标的一个方法是使用所谓的“拿扫帚”拉曼显微镜(38),激发光圆柱,而不是球,集中在样品线图像,以及由此产生的拉曼线图像将被分散到CCD相机。圆柱形集中线图像允许收集数以百计的光谱,在一个空间,同时被记录下来。然后跨过这条线样本建立另一个空间轴,导致整个高光谱3 d地图在几分钟,这取决于信号强度。光谱图包含两个空间维度(),定义感兴趣的领域,光谱维度()用于识别材料的化学成分在每个像素的图像。地图然后再获得的顺序建立动态光谱的电影()。这些时间流逝光谱电影允许细胞的识别统计学的以及他们应对外界刺激的记录。监控管腔内的pH值变化的能力,在货物穿过endosomal-lysosomal系统或因果开/关外部的刺激,可能会导致小说策略对药物开发和理解病原体生存和其他疾病39- - - - - -43]。

最近,它已被证明,有针对性的纳米传感器IgE-targeting和ser pH-sensing功能能够测量细胞内的pH值隔间窝藏内化IgE受体,利用RBL-2H3肥大细胞系作为一个模型系统。这个传感器是基于Au@Ag核心壳粒子与MPy报道分子和2,4-dinitrophenol-L-lysine (DNP)作为目标分子IgE IgE绑定到高亲和力受体FcRI (10,12]。随后,该纳米传感器测量的应用endosomal隔间的pH值sensor-bound受体通过endosome-lysosome系统运输量而细胞暴露于动态外部刺激据报道(11]。这是证明了纳米传感器弹性温度变化,通过降低温度培养细胞的生理相关的温度37°C到25°C;这个过程也减缓了内源性受体的运输。更重要的是,它也证明了有针对性的纳米传感器报告腔的pH值变化治疗后细胞的H⁺通量抑制药物、阿米洛利和bafilomycin。重要的是,足球俱乐部RI-targeted pH ser的纳米传感器使囊泡的直接定位轴承Fc国际扶轮受体也报告endosomal泡pH值的动态变化应对这些药物。隔间恢复正常pH值从媒体对这些药物的去除后10分钟的时间尺度。这种技术有潜力创造有用的新技术领域的医学,药理学,生物技术。

2。实验部分

2.1。化学品和材料

非盟胶体在60 nm直径从Ted斗篷,购买公司。雷丁(p / n 15708 - 6日,CA)为2.6×10¹⁰粒子每毫升。非盟胶体与Ag)是增强涂层的李从Nanoprobes银增强和引发剂代理,Inc .(美国纽约2013年p / n, Yaphank)。银增强了在1:1的比例引发剂和增强剂。增强的解决方案是添加到胶体两分钟,在13000转离心5分钟,然后洗去离子的H₂o . MPy (p / n 148202,西格玛奥德里奇的化学物质,圣路易斯,密苏里州)和DNP (MP生物医学,梭伦,哦,美国)使用前未经纯化和水的解决方案准备在1毫米。BSA-DNP和IgE抗体通过收购一个慷慨的礼物从Oliver-Wilson在新墨西哥大学的实验室。Nigericin,氯化钾,MgCl₂,CaCl₂和葡萄糖从西格玛奥德里奇购买化学品(圣路易斯,密苏里州,美国),使用前未经纯化。Bafilomycin(σ)溶解在EtOH和使用浓度200海里44]。阿米洛利(MP生物医学,公司。溶解在dH)₂O和使用1毫米的浓度(45]。

2.2。细胞培养

细胞实验,RBL-2H3细胞培养在MEM媒体补充10%的胎儿克隆III (p / n SH3010902,热科学Hyclone,洛根,UT), 90国际单位/毫升的青霉素(写明ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和90年g / mL链霉素(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),和一个额外的2谷酰胺的M(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。RBL-2H3细胞粘附细胞行出产的5%供应有限公司₂孵化器在37°C到80% confluency然后通道。细胞被影射anti-DNP-specific IgE (1g / mL) 18 - 24小时和保持在37°C和5%的公司₂之前使用。成像实验的有针对性的纳米传感器采用声波降解法胶体五分钟通过0.2和过滤m过滤和添加到细胞在10 - 100 x粒子/手机号。五分钟后,细胞然后洗2 x与磷酸盐溶液,消除大部分的残余纳米粒子离开细胞外部,然后新鲜温暖汉克斯缓冲区。缓冲由汉克斯,玫瑰,BSA,葡萄糖,MgSO₄,NaHCO₃。封面滑贴壁细胞然后添加到环境室容器(Thornwood卡尔蔡司公司,纽约,美国)平衡在25°C或37°C和5%的公司₂成像。

2.3。脱粒试验

演示IgE受体介导的内吞作用的生物活性纳米传感器,进行脱粒试验。在这个试验,己糖胺酶被用来hydrolytically裂开衬底p-nitrophenyl-N-acetyl --D-glucosaminide (N9376σ),导致颜色的变化可以被探测到。试验是表现在24好文化板块。积极控制整个试验是通过溶解细胞特里同为1%。

2.4。布局和显微镜成像

microscope-imaging系统是基于卡尔蔡司Axiovert 135电视倒置显微镜Epiplan 10 x附加说明(0.20),LD Plan-achroplan 40 x(附加0.60和63 C-apochromat附加说明(1.2)水浸的目标。这是最后一个目的主要用于ser实验。氙弧灯(Thornwood XBO 75年,卡尔蔡司,纽约,美国)被用来照亮明视场可视化的样本在传输模式下,通过摄像机,使用三目中传输光学头。(Optem 70 xl, Labtek,坎贝尔,CA)的总转移光学放大因子为0.5 x除了客观的使用。无限2 - 2单色(Lumenera Corp .,渥太华,美国)相机是用来获得可见的图像使用收购率约为200 ms /帧检测器增益。可见图像分辨率为1616×1216像素。相机被连接到个人电脑通过USB 2.0连接,并获取该图像时使用了无穷捕获软件和保存为。tiff文件格式。拉曼实验使用514.5纳米光光谱物理执行177 - g01气冷式氩离子激光器。激发光与其他基于“增大化现实”技术⁺激光线使用300 ln / mm色散光栅和~ 1毫米空间滤波器几英尺远的地方。激光是扩大,平行使用1:2开普勒望远镜。这是耦合的显微镜物镜的antireflection-coated平凸的BK-7 150毫米焦距柱面透镜(CKX150AR。14日,纽波特公司欧文、钙、美国),一个拉曼二向色性(z514rdc没有边缘。美国105366年,色度技术,为Rockingham市增加,VT)和一个50.8毫米直径,150 mm焦距两面凸的球形anti-reflection涂布双重管透镜(PAC086AR。14日,纽波特公司,欧文,CA)。激光聚焦到大约0.5线50米宽,米高和总功率实验样本10兆瓦的详细摘要。拉曼信号捕获相同的目标和管镜头和通过二向色性。信号传输使用两个额外的150毫米球面透镜和重新塑造到100米宽的狭缝0.25 f / 2.2成像光谱仪(Holospec 2.2, Kaiser光学系统,公司,安阿伯市,美国)。由体积全息光栅信号分散(hsg - 514.4 -低频,Kaiser)和LN成像₂冷却CCD阵列探测器(LN / CCD - 1024 e,普林斯顿仪器,特伦顿,新泽西州,美国)。每个图像CCD记录的光谱和““空间信息的样本。CCD的光谱校准使用不执行标准灯(新港氖6032年,欧文、钙、美国)和确认标准Hg灯(新港)。光谱仪的光谱分辨率大约是2厘米⁻¹。空间轴校准使用分辨率测试目标,美国空军使用线6组- 1951。空间轴为球面畸变纠正另外使用Hg标准灯和虚拟仪器代码(美国国家仪器、奥斯汀、TX)。此外,建立一个平场校正进行了去除约了高斯功率依赖沿着激光线集中使用NIST相对强度校正标准2243 (NIST)。个人光谱获得集成沿垂直轴,和背景光谱是在相同条件下使用显微镜盖玻片。数据是使用自定义虚拟仪器代码和存储ASCII格式的个人电脑。为了获得光谱图像数据集,频率和““空间轴获得并保存,样本被踏在激励源移动计算机控制显微镜阶段(ms - 2000,应用科学仪器,尤金,或者,美国),依次建立““空间的多维数据集的访问。同步CCD相机和阶段进行了使用相同的虚拟仪器代码。所有细胞实验进行独立控制的环境室(Thornwood卡尔蔡司公司,纽约,美国)安装在舞台。

2.5。电子显微镜

扫描电子显微图是使用范广达200 feg操作在一个加速30千伏的电压。所有执行成像室的压力~ 100 Pa的水蒸气,以避免充电和减少样品脱水。影像被用来研究在开发过程中纳米粒子的大小和形态。样品安装在玻璃幻灯片。透射电子显微镜(TEM),细胞被固定为2%戊二醛在甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4),与四氧化锇后缀,在提升醇脱水,嵌入在环氧树脂。由于Au@Ag的大小的纳米传感器,样本与徕卡上的100 - 300 nm厚Ultracut节点。样本染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和日立7500电子显微镜观察。

2.6。表面增强拉曼散射的pH值校准

在活的有机体内标定实验使用的10m nigericin MgCl 140毫米氯化钾,1毫米₂2毫米CaCl₂、5毫米葡萄糖和20毫米phosphate-citrate不同pH值的缓冲区(4 - 8)。校准的解决方案是添加后,细胞回到十分钟的孵化器。pH值平衡后,纳米传感器被添加到目标细胞,整个图像被发现的所有粒子进入细胞内的十分钟后。细胞图像代表约100 0.5米×0.5m-sized像素与纳米传感器。这些图像处理获得个人光谱表明在数据分析部分。一旦每个pH值收集个人数据点,这些数据是适合一个s形曲线。

2.7。数据分析程序

数据分析过程进行了使用自定义虚拟仪器代码写的。高光谱图像的所有像素立方体受到相同的校正程序包括波长校准、平场校正,背景减法,CCD偏压减法,除球面像差。图像阈值是通过消除任何光谱像素信息的信号噪声比小于2.5。通过计算信噪比最高的强度从集成的峰数为1572厘米⁻¹到1599厘米⁻¹减去从基线值,除以噪声的最高强度计数为1800厘米⁻¹到1827厘米⁻¹减去从基线值。任何与信噪比低于2.5像素被认为没有任何有用的信息,并从图像中删除。感兴趣的两个谱峰被集成从1572厘米⁻¹到1599厘米⁻¹nonprotonated峰和1599厘米⁻¹到1626厘米⁻¹质子化了的高峰。由于拉曼光谱通常发生在弱荧光背景,综合限制进行评估在线性斜坡背景下的光谱强度定义为1000厘米⁻¹和2000厘米⁻¹。因为感兴趣的山峰是如此接近幽灵似地,不定地倾斜的基线可能出现的从细胞自体荧光可以有效地去除不改变的内在比峰值。

3所示。结果与讨论

纳米颗粒的扫描电子显微图如图所示1之前(a)和(b)开发后银。这些核壳粒子Au@Ag表示为基于其他地方类似几何图形报告(21]。开发完成之后,粒子的大小不等,从大约70 nm - 150 nm。任何可能的大骨料被通过使用200纳米注射器过滤器过滤。银发展战略被证明是一种快速、有效的方法来生成大量的银基粒子在100纳米的范围内。图1 (c)是一个示意图说明纳米传感器的设计。不是按比例尺绘图,但展示了非盟的核心与Ag)表面涂层以及添加多个4-MPy配体和多个DNP Ag)表面的配体。它可能感兴趣的外部边界的数字在纳米颗粒的表面配体。4-MPy的宽度(元之间的氢)是0.42海里,而DNP宽度(硝基一半和H para)是0.60海里。假设一个统一的球形纳米粒子的直径100纳米收益率的有效表面积31415海里²。同等数量的两表面配体,空间填充,他们是刚性配体的最大数量大约是30800配体分子/纳米颗粒。有许多在这个理想化的假设情况下,最有可能的是,这种计算代表最大的情况下,和实际数量可能是小于。创建有针对性的纳米传感器与目标和感应能力,重要的是要确定的程度的配体干扰对方的功能。

3.1。测试纳米靶向配体

第一次测试的效果上的4-MPy DNP粒子的能力是针对细胞系的endosomal通路,一个荧光技术脱粒试验。细胞刺激IgE Fc脱粒RI-mediated通路将导致细胞分泌的成分包括颗粒酶己糖胺酶(46]。释放己糖胺酶是本试验中使用hydrolytically打通外部添加底物分子,p-nitrophenyl-N-acetyl - (3-D-glucosamine),导致检测的颜色变化。试验是用来比较Au@Ag-DNP此前测量粒子与牛血清白蛋白(BSA) dnp粒子。

分析数据报告之前(10]。自发释放造成IgE-sensitized细胞,没有添加BSA-DNP,显示了一个反应在5%,这是作为消极的控制。5%的释放与自发释放与Au@Ag-4MPy纳米粒子的使用证明,缺乏针对DNP组件。BSA-DNP显示相应浓度的减少比例下降释放通常作为一个积极的控制和同意这个细胞株(文献值47,48]。粒子Au@Ag-DNP 55%颗粒释放整个细胞,这是与与10克BSA-based DNP粒子。当DNP: 4-MPy混合物(1):1、3:1和1:3用于外套Au@Ag纳米颗粒表面,脱粒百分比在30%,37%,和27%,分别相当于10 ng BSA-DNP。这效率下降可以归因于DNP的浓度减少粒子表面由于4-MPy的存在。1:1的比例(DNP / 4-MPy)纳米粒子为这些实验选择,作为一个合理平衡的能力目标DNP endosomal通路的纳米传感器,从4-MPy水平足够高的ser信号,使合理快速的图像采集。图2使用TEM图像展示了纳米传感器的内化。图2(一个)显示了一个高分辨率图像的RBL-2H3 5分钟后细胞暴露于纳米传感器。箭头指向单个纳米传感器的位置,被视为一个黑(电子致密)点绑定到细胞表面,由于纳米传感器的特定绑定的DNP部分至少一个IgE-bound受体。图2 (b)演示了一个类似的细胞暴露于纳米传感器的脉冲,五分钟之后sixty-minute追逐允许内化sensor-bound受体前固定为TEM和处理。在这张照片中,箭头指向三个内化的纳米传感器在一个内吞作用的舱在膜表面。

3.2。测试纳米传感报道分子

补充之前的研究对于4-MPy配体干扰目标,接下来的研究证明了最小干扰DNP的纳米传感器博士图感觉的能力3显示代表在体外ser光谱有针对性的纳米传感器在不同的发展阶段。图3(一个)显示了一系列的修改的Au@Ag纳米颗粒没有明显的拉曼信号。图3(B)显示了Au@Ag-4MPy的光谱显示各种山峰,包括附近的山峰1600厘米⁻¹基本利益和普遍赞同报道的其他地方(7,21]。图3(C)代表了ser Au@Ag-DNP这表明弱拉曼峰的光谱;然而,这些峰值强度下降很可能因为DNP赖氨酸结合,并进一步在纳米颗粒表面的距离。DNP的距离从粒子可能导致削弱DNP拉曼信号(49]。图3(D)代表一个ser Au@Ag-4MPy-DNP光谱显示与图通用协议3从DNP (B)与温和的贡献。

许多乐队与4-MPy似乎显示一定程度的pH敏感性[7]。特别是,振动模式的频率1580厘米⁻¹和1612厘米⁻¹显示比例比率计效果依赖于博士的振动模式pH-sensitive 4-MPy物种是基于质子化作用和去质子化4-MPy环N原子的分子(7]。分子的质子化作用被分配到振动模式1612厘米⁻¹虽然unprotonated形式已经分配给1580厘米⁻¹。山峰似乎并不可怕地转变与pH值变化范围。计算两种频率模式演示了一个价值之间的比例,可以相关分子的pH值的环境。因为限量供应的两座山峰是可怕地关闭,完全依赖于相同的元素(氮)和是否绑定或取消绑定氢,这种传感器可以准确地报告pH值不受分子存在的数量或其他分子键取向。作为显示在图4(一),1612厘米的强度⁻¹峰是最大的在低酸度和减少而增加。峰值为1580厘米⁻¹是最大的在高pH值和降低与减少博士光谱的代表吗在体外Au@Ag纳米颗粒表面涂上4-MPy。

3.3。在体外和在活的有机体内校准

的在体外校准曲线如图4 (b)封闭的圈子。有潜力的pKa值4-MPy纳米传感器将不同,没有DNP添加和细胞内。它指出,以前的工作测量的点有相同贡献的质子化了的和unprotonated物种在体外纳米传感器是3.9 (50)和4.0 (7]。众所周知,在体外代的生物测量校准曲线(信号与浓度)的有限使用,因为可能的探针与活细胞内的自然物种相互作用[40]。测量的离解常数,例如,显示,Ca^{2 +}绑定的染料在活的有机体内可以5 x比在体外(51]。幸运的是,一代的在活的有机体内荧光显微法校准曲线是例行公事,这个应用程序是相同的。简单,多个测量与不同程度的外部执行代谢物的浓度对大部分媒体的兴趣。的离子载体nigericin用来平衡外部(H⁺)浓度与细胞(52]。获得在活的有机体内校准数据,许多测量类似如图4(一)用于生成校准曲线如图4 (b)随着开放的圈子。频率的误差比率代表重复测量的标准偏差,通常是更精确的pH值更高。注意的戏剧性转变明显isosbestic点两条曲线。另外,乐队的比例没有出现在高酸度的零压平。这可能是因DNP如图的背景信号3(D)。然而,所有执行校准的DNP来考虑这种影响。囊泡形成的内吞作用的通路已经被证明显示pH值浓度从4.5到7.5。这个范围内同意与我们的校准曲线很好显示相关的酸度范围从4.0到8.0单位。这些数据都适合一个s形曲线所示的值(1)。这个方程被用来转换ser光谱pH值地图在随后的实验如下:

延时、高光谱ser图像显示纳米传感器交付到目标细胞的进化在25°C如图5。显微镜的一个缺点是,它才有能力收购brightfield图像图像延时周期的开始。此外,brightfield图像传输,整个细胞的观点比pseudoconfocal低分辨率,epi-acquired ser形象。因此,brightfield图片只作为一个粗略的向导细胞结构和位置前初始拉曼形象。图5(一个)显示的有针对性的纳米传感器28分钟后的粒子被添加到细胞。彩色像素代表的pH值计算频谱使用校准曲线如图4 (b)。颜色对应比例尺,红色和橙色表示中立,pH值接近中度蓝色和紫色代表酸性最强的位置。在28分钟的时间点,大部分的细胞膜的边缘附近的粒子。有轻微brightfield图像和ser图像之间的配准误差,因为活细胞,尽管附着,不固定。布朗运动的1 - 2米可以发生在给定实验的时间进程。然而,指出,这些纳米粒子已经或即将被内化,因为自由浮动粒子运动过快时提供重要的信号的集成采集时间的实验。图5 (b)显示了同一场景在45分钟后半。在这个时间点,有更多的粒子内化,尽管大量有针对性的纳米传感器附近的边缘细胞。在图5 (c)在59分钟半,更多的粒子已被传递到细胞,并有一个增加细胞的中心附近的粒子。有人指出这些细胞大核可能代表“死亡空间”这些地区有针对性的纳米传感器,在核内体,不会被发现。细胞的细胞核是略低于中心在上面的灰度图像,但是这可能是审讯的面积,这样更均匀分布的颗粒对细胞的表面。ser形象在八十半分钟,图5 (d)显示,大多数粒子远离表面的细胞。这些类型的细胞内分布的粒子也出现在光散射实验。

像素的数量有显著的ser信号绘制在图6(一),代表次要的轴。很可能没有内化像素测量和粒子之间的一一对应。每个像素的测量尺寸是0.5米×0.5米也差不多大小的核内体这细胞类型53]。有针对性的纳米传感器低于0.2m大小。因此,有针对性的纳米传感器包含平均单个像素。然而,它是不确定的,如果存在多个纳米传感器在一个单独的像素。在十五分钟,大约400像素ser高于阈值的信号。在过去的一个小时,和ser信号像素的数量膨胀峰值约1200。在随后的三十分钟,像素的数量减少到少于400来衡量。的像素在纳米颗粒后的第一个小时交付预计解释为较慢的细胞过程发生在25°C相比,正常的细胞生长温度37°C。交付的纳米传感器表明清洗步骤没有完全消除自由纳米传感器。总像素的下降之后一个小时可能源于脱粒过程中,随着时间的推移,纳米传感器细胞排出体外。此外,它是可能的,一些正在被审问的纳米传感器的激光或化学改性的核内体的恶劣的环境。 The possibility also exists that the nanosensors are aggregating, causing a decrease in pixel number without a loss of nanosensors. The total intensity of SERS signal per pixel and how this measurement corresponds to the numbers of nanosensors present was performed. The total signal intensity of the two pH sensitive 4-MPy peaks from 1500 cm⁻¹到1626厘米⁻¹900厘米的基线减法⁻¹到2200厘米⁻¹在每个像素生成。所有像素有关ser频谱分析中使用了。主轴代表总数的ser强度计数为每个图像各自的时间点。每个像素的平均强度也绘制在图6(一)并与次要的轴的像素数量。ser强度和像素数量的趋势似乎非常相似。平均每像素强度图描绘了一个近线性1:1的比例ser信号像素数量。这个数据借给消除细胞而不是聚合纳米传感器。自比不是1:1,可能会有微小的纳米传感器聚合纳米传感器或略有差异的贡献大小导致小信号增强。

比较综合强度的纳米传感器在时间和空间表示,大部分的像素降低来自消除。进一步,这将是理想的能够更具体量化nanosenors的数量在每个核内体舱endosome-specific信息可以认为,或单一的内体隔间可以从空间和时间。在图6 (b)的pH值依赖集成ser 1612厘米⁻¹信号绘制和归一化总吡啶信号和平均。pH值依赖一个近似线性的趋势表明,集成ser信号随酸度增加大约23%,从7.0 - -7.5范围4.5 - -5.0的范围内。粒子的百分比在pH值类别,对应于假想的州内体成熟通路记录随时间(54]。这些数据见图6 (c)。使用媒体的pH值大约为7.4。假设,内化后,核内体周围介质的pH值一样。细胞在审讯,立即有大约10%的像素在pH = 7.0 - -7.5类别和23%的像素在pH = 6.5 -7.0类别。在这两个类别,粒子在这些类别的百分比下降80分钟至6%和11%,分别。这一趋势可以归因于内化内体成熟降低pH值和回收受体减少粒子用于新的内化过程。代表一类的粒子pH = 6.0 - -6.5,对于早期内体,开始实验的23%人口和保持不变的粒子进入和离开这个pH值范围内几乎是平衡的。pH = 5.5 - -6.0的范畴,代表可能排序内体/早期内体,是人口最多的类别,始于二十多岁和三十多分钟增加至30%,仍在整个实验过程中增加。pH = 5.0 - -5.5的类别和pH = 4.5 - -5.0,代表晚期内体/溶酶体阶段,开始实验分别为17%和6%,。随着时间的推移,两个类别增加相对丰富的结局在23%和10%,分别。 This increase in abundance suggests that the bulk of the particles have been processed to the late endosome/lysosomal stage.

3.4。温度

SERS-targeted纳米传感器被添加到细胞举行37°C或25°C。图7(一)描述brightfield细胞图像覆盖与color-calibrated ser图像在两个温度和细胞培养。brightfield图像都记录在初始时间点相对应的第一ser形象;覆盖小对齐问题正确的贴壁细胞的适度运动。在生理温度37°C, Fc国际扶轮交联导致显著的内吞作用的受体2-12-minute时期。

正如预期的那样,有一个相当大的延迟在受体细胞中内化孵化25°C(图7(一))。因此,成像时间延长到60分钟。在图的图像7(一)给出一个定性的纳米传感器和pH值的局部环境。图7 (b)从三个细胞平均数据,报告的目标纳米传感器总数pH值在每个分组的比例。图7 (b)也说明了纳米传感器的快速通过内吞作用的通路孵化时37°C。设计的纳米传感器组的图像显示,在12分钟,80%的纳米传感器在pH值分组说明晚endosomal /溶酶体囊泡。在以后的时代里,传感器的总体数量降低,符合贩卖的纳米传感器通过回收隔间和细胞表面由exocytic释放分泌溶酶体,其次是分离介质。纳米传感器的检测与pH值6.0 - -7.0隔间在以后的时代里,暗示他们的保留在早期的分类和回收核内体。

实验在25°C演示两个初始的温度依赖性受体介导的内化传感器通过内吞作用的途径及其进展缓慢。细胞培养相比,在37°C,值得注意的是,纳米传感器往往积累pre-endosomal /回收核内体在较低的温度。还有一个值得注意的保留总数的pH值最低的隔间内的纳米传感器,如预期如果低温放缓receptor-nanosensor复合物的到来为分泌溶酶体和他们随后回到质膜胞外分泌。

3.5。药理学

有针对性的纳米传感器是通过药物的方法进行验证。首先,纳米传感器检测的能力增加pH值在核内体的细胞治疗bafilomycin,抑制剂的H⁺腺苷三磷酸酶泵泵H⁺到endosomal泡(55- - - - - -57),进行了测试。这些结果与细胞接受阿米洛利相比,一个已知的抑制剂的Na⁺/小时⁺换热器。这导致损伤的H⁺退出endosomal泡和减少在endosomal pH值(58- - - - - -60]。在这两种情况下,细胞培养在37°C有或没有药物细胞两个小时十分钟之前接触的纳米传感器和成像药物的持续存在。结果报道在图8。

图8(一个)显示的总吸收的纳米传感器在每个条件下,报告为拉曼活性的平均数像素,在每个时间点,至少在三种不同的细胞。如前所述,基于纳米传感器大小(< 0.2和像素大小(0.5 M)米×0.5米),假设至少有一个纳米传感器每像素有可能多个活动的纳米传感器出现每像素(图6(一))。未经处理的细胞累积约100纳米传感器每个细胞在10分钟暴露估计基于假设1:1积极像素的相关性的存在至少一个纳米传感器。这个值数量慢慢减少冲刷后,可能由于(1)回收的结合表面,(2)指示贩卖分泌溶酶体之后,出口receptor-bound通过胞外分泌的纳米传感器,和(3)溶酶体降解。尽管这两个路径的相对贡献并不区分这些实验条件下,可以推断出的纳米传感器的位置分布在隔间与特定的pH值间隔在追逐(图8 (b))。在12分钟的追逐,70%的纳米传感器在隔间的pH值4.5 -5.0(40%)或5.0 -5.5 (30%)。选择性的损失这池抵达分泌溶酶体是一致的,他们可能退化或路由到胞外分泌的表面。

值得注意的是,amiloride-treated细胞累积4倍更多的纳米传感器(400 /单元)在相同的曝光时间(图8(一个))。它可以推测这个数量大幅增加可能归因于增加和回收初核内体的酸化,将受体的平衡从lysosome-directed通路的回收途径。Na的中断⁺/小时⁺换热器也可能部分块内化过程,使得传感器结合在细胞表面受体缓冲介质的pH值7.2。这是见图8 (b),10 - 18%的传感器注册一个pH值7.0 - -7.5长达20分钟的追逐。amiloride-treated细胞中其他值得注意的观察包括增加检测的纳米传感器在非常低的pH值隔间(pH值4.5 - 5)58- - - - - -60),标志着在纳米传感器数量总体下降40分钟追逐。这是符合退化与低pH值和/或胞外分泌的小隔间里。

Bafilomycin-treated细胞平均拿起150纳米传感器在10分钟曝光,且没有明显的下降了40分钟追期(图8(一个))。如图8 (b),这些纳米传感器被困在车厢与pH值显著升高,符合质子泵的封锁。大约40%的传感器位于pH值6.0 - -7.5 (red-orange-yellow酒吧图的环境8 (b)实验期间)。这可能反映了居住在endosomal和回收箱内与异常的pH值或保留在细胞表面的受体(61年,62年]。其他人认为bafilomycin影响endosomal酸化主要来自endosomal末溶酶体阶段(63年- - - - - -65年]。因此,只有不到10%的传感器典型的溶酶体感pH值范围内的pH值4.5 - -5.0。似乎持续水平的纳米传感器将可怜的交付溶酶体和/或防止退化由于pH值依赖溶酶体酶活性。

协议是不同的在两个方面:(1)吸收的纳米传感器的未经处理的细胞在37°C,其次是药物和成像或(2)治疗药物和纳米传感器,其次是药物的去除和成像跟踪复苏的隔间。图9(一个)后立即显示分布的纳米传感器bafilomycin被加入到细胞暴露于十分钟孵化的纳米传感器。图中这个数字显示,几分钟内bafilomycin的影响是显而易见的。这是最壮观的12分钟的时间点比较时,只有25%的传感器在pH值最低(4.5 - -5.5)环境相比,70%在正常细胞(见图8 (b))。重要的是,急性照射后bafilomycin吸收防止纳米传感器的损失。这是显示在图9 (b),纳米传感器的总数是12分钟内稳定bafilomycin治疗。这种影响是可逆的,如图9 (b),细胞治疗与bafilomycin 30分钟紧随其后交换与新媒体没有药物。

急性阿米洛利治疗对细胞的影响也在图检查9 (c)。细胞被再次孵化与纳米传感器十分钟37°C,其次是清洗和添加阿米洛利媒体(虚线)。尽管30%的纳米传感器达到低pH值(4.5 - -5.0)环境3分钟,有一个重大转变高pH值在12分钟内环境。这种变化似乎是完成在20分钟内由于pH值范围的隔间是类似的阿米洛利20分钟和30分钟的治疗。

3.6。药理学和温度

最后一组的实验相比,纳米传感器在细胞的吸收、通过使用阿米洛利或bafilomycin但举行25°C的所有治疗。在这种情况下,未经处理的细胞和amiloride-treated细胞显示缓慢吸收的纳米传感器,达到类似高原水平大约45分钟(图10 ())。相比之下,bafilomycin-treated细胞积累显著减少纳米传感器/细胞(图10 ()在室温下)举行。

pH值的分析环境内化受体每个条件下显示复杂的低温对受体的影响通过endosome-lysosome贩卖系统。纳米传感器的空间视图的治疗和治疗细胞内定位在15日40和60分钟(图演示了10 (b))。在未经处理的细胞中,缓慢吸收伴随着明显缺乏交付低pH值(4.5 - -5.5)隔间。即使在60分钟,大约10%的受体似乎已达到后期核内体或溶酶体(图10 (c))。解释bafilomycin-treated细胞受体的过程是复杂的整体吸收差。然而,值得注意的是,超过35%的纳米传感器被amiloride-treated细胞驻留在60分钟内pH值4.5 - -5.5环境中吸收25°C。它不能区分这些纳米传感器是否已经达到溶酶体隔间在这个阶段或者他们是否居住在endosomal隔间后极大地酸化阿米洛利Na的堵塞⁺/小时⁺换热器膜。

4所示。结论

有针对性的ser pH值的纳米传感器的发展,这项技术的第一个应用程序已被证明在活细胞使用时间流逝喇曼光谱显微术。这些实验证明有针对性的纳米传感器可以被受体介导内化,同时提供一个机制来衡量内吞作用的泡pH值并按时间和空间发展的受体通过endosome-lysosome交通系统。配体用于定位和遥感已被证明不显著干扰彼此的功能。证明,共焦高光谱ser全细胞图像可以快速获得加班费。图像,在活的有机体内校准数据,可用于创建全细胞,pH值依赖时间的局部地图。有针对性的纳米传感器显示明显的缓慢进展通过内吞作用的受体途径在细胞举行25°C。有针对性的纳米传感器的影响报道H⁺通量抑制药物阿米洛利和bafilomycin内吞作用的隔间,提供可靠的测量腔内博士这项技术的变化代表了一种新颖的方法使用活细胞作为microlaboratories通过开发基于纳米颗粒的纳米传感器平台和丰富的配位体传感和目标的可能性。这些探测器的多功能性显示承诺未来的应用程序相关的细胞内走私和智能药物设计。

确认

这个手稿已经由洛斯阿拉莫斯国家安全号合同下。与美国能源部DE-RP52-05NA25396。美国政府保留和出版商,接受这篇文章发表,承认美国政府保持一种非排他性,已付的,不可撤销的,和全球许可发布或复制的形式出版的手稿,或允许其他人这样做,美国政府的目的。他们承认洛斯阿拉莫斯国家实验室指导研究和开发批准号20080001 (k·d·校长)博士对这个项目的支持。他们承认使用UNM-HSC电镜设施和新墨西哥大学癌症中心的荧光显微镜。他们也感谢威尔逊教授布丽姬特,珍妮特•奥利弗黛安娜Lidke和基思Lidke(新墨西哥大学)的建议和意见。作者还要感谢博士斯蒂芬·乔伊斯(洛斯阿拉莫斯国家实验室)为他的扫描电镜成像实验,和大卫·金伯尔博士Maida特鲁希略(洛斯阿拉莫斯国家实验室)为他们的帮助在图的艺术品1 (c)。最后,我们感谢埃默里大学的布莱恩·代尔有用的讨论。

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